王琳超，鮑海港，李俊英，吳常信

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物遺傳資源與分子育種實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

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瑪麗魚染色體核型及Ag-NORs研究

王琳超，鮑海港，李俊英，吳常信

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物遺傳資源與分子育種實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

摘要：為獲得瑪麗魚Poecilia latipinna細(xì)胞遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，以瑪麗魚的鰓絲和鰭條為試驗(yàn)材料，采用秋水仙素浸泡、低滲處理和熱滴片法制備染色體標(biāo)本，分析其染色體的核型和銀染 （Ag-NORs）。結(jié)果表明：瑪麗魚具有23對(duì)染色體，核型2n=46t，NF=46；Ag-NORs出現(xiàn)在t2和t9的染色體末端，其數(shù)目具有多態(tài)性，未發(fā)現(xiàn)性染色體。本研究結(jié)果可為研究瑪麗魚的遺傳方式提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：瑪麗魚；染色體核型；銀染

瑪麗魚 Poecilia latipinna隸屬于脊索動(dòng)物門Chordata、硬骨魚綱 Osteichthyes、鳉形目 Cyprinodontiformes、花鳉科Cyprinodontidae、花鳉屬Poecilia，是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的觀賞魚，原產(chǎn)于北美洲佛羅里達(dá)半島、墨西哥灣和美國(guó)北卡羅來(lái)納州大西洋沿海一帶，后引進(jìn)到亞洲，并有多種人工改良品種?，旣愻~體色多樣，有白瑪麗、黑瑪麗、黃瑪麗和雜交后的多色瑪麗。雄魚背鰭豎直，像一張帆，用來(lái)引誘雌魚，其臀鰭已變成棒狀結(jié)構(gòu)，用來(lái)與雌魚完成體內(nèi)受精?，旣愻~是一種卵胎生魚，受精與胚胎發(fā)育在體內(nèi)進(jìn)行，且胚胎發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)成分主要來(lái)自卵本身的養(yǎng)分。瑪麗魚在淡水和半咸水環(huán)境中均可棲息生存，耐污能力強(qiáng)，在低溶氧環(huán)境中亦可存活，以藻類及其他有機(jī)物為食物來(lái)源［1］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)花鳉科其他魚類的研究較為深入，如劍尾魚屬Xiphophorus的劍尾魚Xiphophorus helleri和月光魚Xiphophorusmaculatus。對(duì)瑪麗魚的研究主要集中在生理［2］、雄性體長(zhǎng)與形態(tài)發(fā)育［3］、生態(tài)［1］、動(dòng)物行為［4］和分子系統(tǒng)發(fā)育［5］等方面，而對(duì)其核型組成、Ag-NORs方面的研究尚未見報(bào)道。本研究中，對(duì)瑪麗魚染色體核型和帶型進(jìn)行了分析，旨在探究瑪麗魚遺傳物質(zhì)的特點(diǎn)，為深入研究其遺傳方式提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用瑪麗魚取自北京市觀賞魚市場(chǎng)，將試驗(yàn)魚帶回實(shí)驗(yàn)室后養(yǎng)殖于水族箱中，養(yǎng)殖水溫為26℃。選取45日齡左右、體長(zhǎng)為1～2 cm的幼魚10尾，剪取鰓絲和鰭條，制備染色體標(biāo)本；選取3～4月齡的瑪麗魚10尾，只用其鰓絲部分，制備染色體標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 染色體標(biāo)本的制備 參照Haaf等［6］和周麗青等［7］的方法并稍作改進(jìn)。室溫下，將瑪麗魚放入0.01％秋水仙素溶液中6 h，剪取鰓絲和鰭條，在25℃下置于10 mL 0.037 5 mol/L KCl溶液中分別低滲約30、50 min。

將低滲后的鰓絲放入甲醇與冰醋酸 （體積比為9∶1）的固定液中浸泡8 min，再放入純冰乙酸中浸泡處理1～2 min；用卡諾氏固定液固定2次（每次均為50 min），之后放入冰箱 （4℃）中固定。取蒸餾水和冰乙酸，并按體積比1∶1混合，將固定過的鰓絲放入其中，輕輕搖動(dòng)，1 min后取出鰓絲，所得液體用于滴片。

將低滲后的鰭條用卡諾氏液固定3次，每次30 min，之后放在冰箱（4℃）中過夜，次日用50％的冰醋酸液處理10min，再用移液槍反復(fù)吹打，然后靜置，使雜質(zhì)沉降，吸取上層液體用于滴片。

用加濕器稍微加濕空氣 （空氣濕度50％），室溫下采用熱滴片方法，將細(xì)胞懸液滴到控溫電熱板（50～60℃）的干凈玻片上，5 min后吸除玻片上殘留的液體。

用磷酸鹽緩沖液 （pH 7.2）將吉姆薩原液按9∶1的比例稀釋成工作液 （現(xiàn)用現(xiàn)配）。取干燥后的染色體標(biāo)本片染色20 min后取出，用蒸餾水沖洗以去除染液，干燥后即可用于觀察分析。

1.2.2 核型分析 使用Olympus BX63型顯微鏡觀察處理后，對(duì)染色體標(biāo)本片進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，并選擇10個(gè)優(yōu)良分裂相在油鏡下攝影。使用 ImageJ 1.48軟件對(duì)染色體進(jìn)行測(cè)量，并按其特點(diǎn)用VideoTesT-Karyo 3.1染色體核型分析軟件進(jìn)行同源染色體配對(duì)，按照Levan等［8］的劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。

1.2.3 銀染 參照Howell等［9］的方法略作修改。將制備好的染色體標(biāo)本片放于潔凈培養(yǎng)皿中，并置于60～70℃水浴中，在標(biāo)本上滴加50％硝酸銀與2％明膠 （內(nèi)含1％甲酸）以2∶1比例混合的混合液，覆蓋玻片。2～4min后取出玻片，用預(yù)熱蒸餾水沖洗，并于干燥后鏡檢和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑪麗魚鰓絲細(xì)胞染色體數(shù)目的確定

選取瑪麗魚鰓絲細(xì)胞100個(gè)中期分裂相染色體，計(jì)數(shù)確定其染色體數(shù)目。結(jié)果顯示，瑪麗魚染色體的數(shù)目在100個(gè)中期分裂相中，出現(xiàn)最多的是46，占細(xì)胞總數(shù)的82％ （表1）。因此，可以確定瑪麗魚的染色體數(shù)目為2n=46。

表1　瑪麗魚二倍體染色體的計(jì)數(shù)結(jié)果Tab.1 Chromosom e counts in the d ip loidy sailfin molly Poecilia latipinna

2.2 瑪麗魚染色體核型分析

選取染色體分散好且數(shù)目完整的中期分裂相10個(gè)，測(cè)量染色體臂長(zhǎng)度，計(jì)算其相對(duì)長(zhǎng)度，得出瑪麗魚染色體形態(tài)參數(shù)。從表2可知，瑪麗魚染色體二倍體體細(xì)胞的46條染色體可配對(duì)成23對(duì)同源染色體，按Leven等［8］的劃分標(biāo)準(zhǔn)，23對(duì)染色均為端部著絲粒染色體 （t）。

表2　瑪麗魚染色體對(duì)的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比及其分類類型（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Tab.2 Relative length，arm ratio and classified types of chrom osome in　sailfin　molly　Poecilia　latipinna （mean±S.D.）

在試驗(yàn)結(jié)果中，未發(fā)現(xiàn)異型性染色體、次縊痕和隨體結(jié)構(gòu)的存在，因此，瑪麗魚的核型公式可表示為2n=46t，且NF=46。根據(jù)測(cè)量結(jié)果，配對(duì)瑪麗魚各對(duì)同源染色體，即可得瑪麗魚染色體核型圖（圖1）。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，用同一條魚細(xì)胞制作的染色體標(biāo)本中，鰓絲比鰭條所呈現(xiàn)的染色體中期分裂相較多。同樣是使用鰓絲，幼魚比成魚的鰓絲更易獲得較多染色體中期分裂相。

圖1　瑪麗魚染色體中期分裂相和染色體核型Fig.1 M etaphase chromosom es and karyotype of sailfin m olly Poecilia latipinna

2.3 鰓絲細(xì)胞銀染核型

在瑪麗魚鰓絲細(xì)胞的中期分裂相中，Ag-NORs的數(shù)量有兩種情況 （圖2），細(xì)胞中有2個(gè)Ag-NORs和1個(gè)Ag-NORs出現(xiàn)的中期分裂相頻率分別為78.8％與21.2％，分別位于t2和t9中的一條染色體上，且銀染點(diǎn)出現(xiàn)在染色體靠近著絲粒的末端。

注：A為細(xì)胞中具1個(gè)Ag-NORs的中期分裂相；B、C分別為細(xì)胞中具有2個(gè)Ag-NORs的中期分裂相及其核型圖 （箭頭指銀染位點(diǎn)）Note：A，themetaphase with one Ag-NORs in cells；B，C，themetaphase with two Ag-NORs in cells and its karyotype（arrow showing silver dying sites）圖2　瑪麗魚的Ag-NORs數(shù)目Fig.2 Number of Ag-NORs in sailfin molly Poecilia latipinna

瑪麗魚染色體的Ag-NORs在瑪麗魚間期鰓絲細(xì)胞中細(xì)胞中數(shù)量也存在差異 （圖3），數(shù)目為1個(gè)或2個(gè)。細(xì)胞中有2個(gè)Ag-NORs和1個(gè)Ag-NORs出現(xiàn)的頻率分別為72.8％與27.2％，含有2 個(gè)Ag-NORs的細(xì)胞數(shù)量明顯多于含有1個(gè)Ag-NORs的細(xì)胞。

圖3　瑪麗魚染色體Ag-NORs之間的相對(duì)大小Fig.3 Dimension of Ag-NORs in sailfin molly Poecilia latipinna

對(duì)試驗(yàn)獲得的間期核觀察可知，瑪麗魚間期核中的NORs呈現(xiàn)大小不一的現(xiàn)象，小的為圓點(diǎn)狀，大的類似圓盤狀 （圖3），但這種差異不大。

3 討論

本試驗(yàn)中，采用秋水仙素直接浸泡魚體和熱滴片的方法制備染色體標(biāo)本片，試驗(yàn)準(zhǔn)備階段需將載玻片反復(fù)清洗備用。低滲處理時(shí)間會(huì)影響細(xì)胞染色體分裂相，不同魚類低滲時(shí)間差別不大［10］。在滴片過程中，環(huán)境溫度和濕度對(duì)中期分裂相的分散程度影響很大。

3.1 瑪麗魚的核型分析

關(guān)于瑪麗魚的核型研究國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，國(guó)外對(duì)花鳉科魚類核型的研究較多。Nanda等［11］在研究花鳉科魚類的性染色體過程中，對(duì)帆鰭瑪麗Poecilia velifera、孔雀魚Poecilia reticulata、Poeciliasphenops、劍尾魚和月光魚進(jìn)行了C帶顯帶試驗(yàn)和合成探針的DNA雜交試驗(yàn)。結(jié)果表明：帆鰭瑪麗具有23對(duì)染色體，通過探針雜交試驗(yàn)表明，雌性可能存在W染色體；孔雀魚含有雄性異性性染色體，共有23對(duì)染色體；Poecilia sphenops則是ZZ/ ZW性別決定系統(tǒng)，具有23對(duì)染色體；劍尾魚和月光魚都是24對(duì)染色體且未發(fā)現(xiàn)性染色體。本試驗(yàn)中，瑪麗魚的染色體數(shù)目為2n=46，其染色體數(shù)目與花鳉科的其他魚類比較接近。在魚類系統(tǒng)進(jìn)化上，根據(jù)學(xué)者對(duì)于魚類演化類群的劃分［12-13］，瑪麗魚屬于高位類魚類。

3.2 瑪麗魚染色體Ag-NORs

核仁組織者 （NORs）存在于染色體上的次溢痕部位，與物種間親緣關(guān)系聯(lián)系密切［14］。1977年，Kligerman等［15］最早將Ag-NORs方法用來(lái)研究魚類染色體，之后對(duì)魚類NORs的研究不斷深入，國(guó)內(nèi)學(xué)者也對(duì)多種鯉科魚類進(jìn)行了Ag-NORs的研究［16-17］。NORs的數(shù)目一般是比較固定的，同一科屬中的不同種都可能是一致的。在劍尾魚的銀染試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其Ag-NORs數(shù)量為1～2個(gè)，但絕大多數(shù)為2個(gè)［18］。在很多魚類中發(fā)現(xiàn)，NORs具有多態(tài)性，不僅數(shù)目具有多態(tài)性，而且NORs的位置結(jié)構(gòu)也有不同類型。瑪麗魚和劍尾魚Ag-NOR的數(shù)量很相似，本研究中發(fā)現(xiàn)，瑪麗魚NORs顯示的數(shù)目為1～2個(gè)，且2種數(shù)目的NORs出現(xiàn)的頻率也不相同。

瑪麗魚Ag-NORs的大小也有不同，有點(diǎn)狀和圓盤狀兩種，這也反映出Ag-NORs的結(jié)構(gòu)多態(tài)性。銀染的面積大小和銀染的強(qiáng)弱是由NORs的轉(zhuǎn)錄活性決定的，根據(jù)染色體上NORs與rDNA之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系可知，NORs的銀染與否以及NORs銀染強(qiáng)度均與rDNA的轉(zhuǎn)錄活性息息相關(guān)，Ag-NORs表現(xiàn)出的多態(tài)性在一定程度上反映了rDNA的轉(zhuǎn)錄活性［19］。大多數(shù)魚類只含有一對(duì)存在Ag-NORs的染色體［20］，例如藍(lán)曼龍 Trichogaster trichopterus［21］、布氏石斑魚Epinephelus bleekeri［22］、麥穗魚Pseudorasbora parva［19］和六帶石斑魚Epinephelus sexfasciatus［23］等，而且Ag-NORs都是位于一對(duì)同源染色體上?，旣愻~Ag-NORs并非在一對(duì)同源染色體上，且t2與t9上的Ag-NORs大小不同，這說明瑪麗魚細(xì)胞中這兩個(gè)NORs轉(zhuǎn)錄活性不同。類似的情況也出現(xiàn)在準(zhǔn)噶爾雅羅魚Leuciscusmerzbacheri中，2個(gè)Ag-NORs不在一對(duì)同源染色體上［24］。由于NORs一般位于次縊痕區(qū)域，瑪麗魚染色體中很有可能存在次縊痕，但此結(jié)構(gòu)在瑪麗魚中并未發(fā)展到能夠分辨的程度。

本試驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)瑪麗魚的性染色體，未來(lái)需要通過其他分子生物學(xué)手段，進(jìn)一步探究瑪麗魚是否存在性染色體以及性別決定機(jī)制。目前世界各國(guó)實(shí)驗(yàn)室的模式生物試驗(yàn)用魚種類包括：斑馬魚、劍尾魚、青鳉、河鲀等［25］，瑪麗魚具有同這些模式生物試驗(yàn)用魚相似的生物學(xué)特性，是潛在的又一模式生物，未來(lái)對(duì)其基因組的深入研究，將會(huì)對(duì)動(dòng)物遺傳以及動(dòng)物進(jìn)化的研究起到很大幫助。

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Karyotype and Ag-NORs of sailfin molly Poecilia latipinna

WANG Lin-chao，BAO Hai-gang，LIJun-ying，WU Chang-xin
（Laboratory of Animal Genetic Resource and Molecular Breeding，College of Animal Science and Technology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Abstract：Themetaphase chromosome spreadingwas conducted in gills and fins cells of sailfinmolly Poecilia latipinna by colchicine-low concentration-hot film drops，and Ag-NORs were analyzed to obtain cytogenetic data of sailfin molly.The results showed that the karyotype of sailfin molly composed of 2n=46t，NF=46.Ag-NORswere found on the end of chromosome No.2 and chromosome No.9，and the Ag-NORs polymorphismswere individually specific，while no sex chromosome was observed in this fish.The findingswill provide reference to genetic pattern of sailfinmolly.

Key words：Poecilia latipinna；karyotype；Ag-NORs

中圖分類號(hào)：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.006

文章編號(hào)：2095-1388（2016）02-0151-05

收稿日期：2015-06-23

基金項(xiàng)目：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)科技基金資助項(xiàng)目 （88057007）

作者簡(jiǎn)介：王琳超 （1991—），男，碩士研究生。E-mail：wanglinchao@cau.edu.cn

通信作者：鮑海港 （1972—），男，博士，副研究員。E-mail：zjbhg@126.com