雷　曉，朱曉霞，王德才，孟志云，甘　慧，顧若蘭，吳卓娜，鄭　穎，李　儉，呂　明，竇桂芳

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安　271000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所，北京　100850；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京　100850)

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125I-MIL50在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)及生物分布

雷曉1,2，朱曉霞2，王德才1，孟志云2，甘慧2，顧若蘭2，吳卓娜2，鄭穎2，李儉2，呂明3，竇桂芳2

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安271000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100850)

摘要：為探究125I標(biāo)記重組抗蓖麻毒素(Ricin)人源化單克隆抗體(125I-MIL50)在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)、生物分布及排泄特點(diǎn)，采用Iodogen法對MIL50進(jìn)行125I標(biāo)記，結(jié)合TCA法測定不同時間125I-MIL50在大鼠血清、組織、體液和排泄物中的含量。結(jié)果表明：Ricin染毒組和直接給藥組血藥濃度在14 d內(nèi)沒有差異，14 d后染毒組125I-MIL50消除快于未染毒組；血清中125I-MIL50濃度高于其他組織和體液，腎、膀胱組織中濃度較高，腦、脊髓、脂肪等脂性組織中濃度一直較低；125I-MIL50給藥后27 d內(nèi)經(jīng)尿累積排泄率約為62.6%，經(jīng)糞便的排泄率為15.5%。研究結(jié)果為臨床實(shí)驗和給藥方案提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蓖麻毒素；125I-MIL50；藥代動力學(xué)；生物分布；排泄

蓖麻毒素蛋白(Ricin)是從蓖麻籽中提取的一種核糖體失活蛋白，由A、B兩個肽鏈以二硫鍵共價連接[1]，A鏈?zhǔn)切?yīng)鏈，通過B鏈幾乎能與所有的真核細(xì)胞結(jié)合。中毒后在人體內(nèi)的潛伏期約為8 h，隨后出現(xiàn)發(fā)燒、嘔吐、肌肉疼痛、無力等癥狀[2]。一分子的Ricin進(jìn)入細(xì)胞，可以使細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成抑制或停止，其毒性是氰化物的6000倍[3]。Ricin為白色粉末或結(jié)晶性固體，相對分子質(zhì)量約為66 kD，溶于酸性稀釋液或鹽類水溶液[4]，性質(zhì)穩(wěn)定，在半乳糖溶液中保存半月不失活?；谶@些特點(diǎn)，美國疾病控制中心把蓖麻毒素列為具有中度威脅的 “B”武器，因此研究預(yù)防與治療策略十分必要。

蓖麻毒素的解毒劑一直是研究熱點(diǎn)，主要包括中和抗體、拮抗肽、底物類似物解毒劑、小分子拮抗劑等[5-7]，如美國研制的重組RTA突變體RiVax，已經(jīng)完成臨床前研究[8-9]。重組抗蓖麻毒素人源化單克隆抗體注射液(MIL50)是軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所在鼠源單抗4C13基礎(chǔ)上進(jìn)行人源化改造獲得的抗蓖麻毒素的中和抗體[10-12]，能有效降低血清中Ricin的濃度。蛋白類藥物容易受體內(nèi)其他物質(zhì)干擾，不易直接測定，目前常用的方法是同位素示蹤法[13-14]。放射性核素125I半衰期為60 d，發(fā)出的γ射線能量為35.5 keV，便于檢測，多采用Iodogen法對蛋白多肽類藥物進(jìn)行125I標(biāo)記后測定放射性活度[15-17]。

本文采用同位素示蹤法研究放射性125I-MIL50在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)、生物分布及排泄特征，為臨床研究提供參考。

1實(shí)驗材料

1.1主要藥品與試劑

MIL50：浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，北京天廣實(shí)生物技術(shù)股份有限公司檢驗；125I- MIL50：北京市北方生物技術(shù)研究所標(biāo)記和純化；Ricin：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供；Iodogen試劑：SIGMA-ALORICH公司；三氯乙酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2實(shí)驗動物

Wistar大鼠：共54只，雄性48只，雌性6只，購于軍事學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物中心。動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(軍)2012-004；實(shí)驗動物使用許可證編號：SYXK-(軍)2012-0021。

2實(shí)驗方法

2.1125I-MIL50制備

用Iodogen法標(biāo)記MIL50：稱取1 mg Iodogen試劑溶于0.5 mL氯仿中，取50 μL混合液加至試管底部，經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笠来渭尤?.2 mL MIL50(蛋白含量為5.63 g/L)， 1.1×105kBq的Na125I，室溫下震蕩反應(yīng)10 min。標(biāo)記反應(yīng)混合物經(jīng)10 mm×500 mm的sephadex-G50凝膠柱分離純化，洗脫液為0.01 mol/mL的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)，流速為1.0 mL/min。

純化后的標(biāo)記混合物經(jīng)分子排阻色譜法(molecular exclusion chromatography，MEC)測定放化純度，放射性活度為18.358 GBq/L。島津LC-20T系統(tǒng)，配以部分收集器，300 mm×7.8 mm的TSK-GEL G3000SWXL凝膠柱，洗脫液為0.01 mol/mL的PBS(pH=7.4)。分別采用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)和酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)法測定蛋白含量和標(biāo)記前后免疫活性。

2.2125I-MIL50的方法學(xué)測定

用大鼠血清做方法學(xué)全驗證，代表組織做方法學(xué)部分驗證，以保證測定結(jié)果的可靠性。

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和處理

用空白大鼠血清將125I-MIL50稀釋成放射性比活度為16.667、33.333、66.667、133.333、333.333、666.667、1 666.667、3 333.333、10 000 Bq/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品，制備低、中、高(放射性比活度分別為33.333、333.333、10 000 Bq/mL)的質(zhì)控樣品。取100 μL樣品，加入等體積的20%三氯醋酸(trichloroacetic acid,TCA)終濃度為10%，測定總放射性活度；離心，去上清液，測定酸沉放射性活度。

2.2.2酸沉率

制備不同放射性活度(Bq/mL)的標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控樣品100 μL，測定總放射性活度和酸沉放射性活度，測定酸沉率。

2.2.3血清精密度和準(zhǔn)確度測定

放射性比活度為33.333、333.333、10 000 Bq/mL的質(zhì)控樣品，每一濃度配置6個樣本，重復(fù)3批，測定總放射性和酸沉放射性活度，隨行當(dāng)天配置的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算質(zhì)控樣品的濃度，計算準(zhǔn)確度和精密度。

2.2.4血清樣品穩(wěn)定性

放射性為33.333、333.333、10 000 Bq/mL質(zhì)控樣品，每個濃度采6個樣品，4 ℃冰箱放置2 d，隨行當(dāng)天配置的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定總放射性活度和酸沉放射性活度。

2.2.5組織方法學(xué)

勻漿制備大鼠的肝、腎、小腸空白組織，用空白組織制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品，測定總放射性活度和酸沉放射性活度。

2.3藥代動力學(xué)比較

受試品為125I-MIL50，進(jìn)行動物實(shí)驗前用非標(biāo)記的MIL50稀釋至2.0 g/L，藥物比活度為1.695×105Bq/mg。

為比較125I-MIL50在Ricin染毒大鼠和未染毒大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，取12只雄性Wistar大鼠，分為染毒組和未染毒組，每組6只。染毒組腹腔注射劑量12 μg/kg的Ricin，染毒后1 h尾靜脈注射劑量為1 mg/kg(每kg重的大鼠給予1.0 mg 的125I-MIL50)的125I-MIL50，放射性比活度1.695×105Bq/kg，該劑量下抗體和毒素的摩爾比為36∶1。未染毒組直接給予相同劑量的125I-MIL50。給藥后5 min、1 h、4 h、8 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、9 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d、21 d、29 d、34 d眼眶取血(每次取血約250 μL)，離心分離后取100 μL血清，測定總放射性和酸沉放射性活度，用血清中的放射性活度計算MIL50含量。

2.4125I-MIL50在大鼠體內(nèi)的生物分布

24只雄性Wistar大鼠，平均分成4組，每組6只，靜脈給予2.2 mg/kg的125I-MIL50，放射性比活度為3.730×105Bq/kg，分別于給藥后1 h、24 h、8 d、35 d處死。

6只雌性Wistar大鼠，編號A、B、C、D、E、F，靜脈給予2.2 mg/kg 的125I-MIL50，放射性比活度為3.730×105Bq/kg，于給藥后1 h處死。

分別取共23種組織或體液。每種組織稱重，勻漿，測定總放射性活度和酸沉放射性活度。

2.5125I-MIL50在大鼠體內(nèi)代謝

6只雄性Wistar大鼠，靜脈給予2.2 mg/kg的125I-MIL50，放射性比活度為3.730×105Bq/kg，單獨(dú)飼養(yǎng)。給藥后不同時間點(diǎn)收集尿樣和糞樣，記錄體積和稱重，糞便用生理鹽水混懸，測定放射性活度，計算排出放射性占給藥放射性總量的百分比。

6只雄性Wistar大鼠，用戊巴比妥鈉麻醉后實(shí)施膽汁插管術(shù)，引流膽汁，靜脈注射劑量2.2 mg/kg的125I-MIL50，放射性比活度為3.730×105Bq/kg，于不同時間點(diǎn)收集膽汁，測定膽汁的放射性，計算排出放射性占給藥放射性總量的百分比。

2.6數(shù)據(jù)處理

組織分布實(shí)驗中，采用配對t檢驗的統(tǒng)計方法比較雌、雄之間有無差異，藥代組統(tǒng)計學(xué)比較采用Student’s-t檢驗，其他數(shù)據(jù)用Microsoft Excel和MicroCal Origin 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖。

3結(jié)果與討論

3.1125I-MIL50的制備

標(biāo)記化合物純化后與非標(biāo)記的MIL50經(jīng)分子排阻色譜法分析，非標(biāo)記的MIL50的保留時間為7.573 min，125I-MIL50的放射性主峰為第8管。表明洗脫出的放射性主峰為標(biāo)記蛋白，放化純度為98.1%。125I-MIL50蛋白含量為0.269 g/L，標(biāo)記后其生物活性為標(biāo)記前的95.6%。

3.2125I-MIL50的方法學(xué)確定

不同組織和體液加入125I-MIL50，在1.667～10 000 Bq范圍內(nèi)，TCA沉淀放射性的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。定量下限為5倍本底1.667 Bq。批間精密度10.5%～13.9%，批內(nèi)精密度1.1%～10.8%，準(zhǔn)確度誤差-10.1%～0.2%。血清樣品放置2 d測定相對誤差(RE)為-15.4%～0.7%。方法學(xué)確證結(jié)果符合方法學(xué)要求。

3.3125I-MIL50在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)

Wistar大鼠尾靜脈注射1.0 mg/kg125I-MIL50 后，平均血藥濃度-時間曲線示于圖1。由圖1可知，Wistar大鼠經(jīng)尾靜脈注射125I-MIL50后，體內(nèi)藥物濃度逐漸降低，14 d之內(nèi)，染毒組與空白組兩種給藥方式的血藥濃度基本保持一致，14 d之后，染毒組藥物濃度消除速率快于未染毒組。34 d、14 d主要藥代動力學(xué)參數(shù)分別列于表1、表2。由表1可知，用34 d之內(nèi)的血藥濃度計算藥代動力學(xué)參數(shù)，AUC0-t、Vd、MRTlast、CL等均有統(tǒng)計學(xué)差異；由表2可知，用14 d之內(nèi)的血藥濃度計算，主要參數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明，兩種給藥方式的差異出現(xiàn)在14 d后，可能是在低濃度下，抗原抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，加快其在大鼠體內(nèi)的消除。因此，在臨床中對Ricin染毒患者進(jìn)行救治時，要考慮抗原抗體復(fù)合物對MIL50在體內(nèi)代謝過程和藥效的影響，給予患者最佳的治療方案。

圖1　125I-MIL50 血藥濃度-時間曲線Fig.1　Plasma concentration-time curve

3.4125I-MIL50在大鼠體內(nèi)的生物分布

Wistar大鼠靜脈給予2.2 mg/kg的125I-MIL50后，不同時間各組織和體液內(nèi)的藥物濃度列于表3。由表3可知，給藥后，體內(nèi)組織中均檢測到放射性，MIL50分布于各個組織和器官；主要放射性集中在血清中，且血清中的濃度一直高于組織中的濃度，表明125I-MIL50不會與組織特異性結(jié)合，在組織中無蓄積性；胃腸內(nèi)容物種的放射性可能是由125I-MIL50在體內(nèi)被各種酶代謝，產(chǎn)生酸性和堿性片段，通過胃腸壁的分泌進(jìn)入胃腸道；腎和膀胱中的含藥量一直較高，125I-MIL50可能經(jīng)尿排泄，可進(jìn)一步經(jīng)體內(nèi)排泄實(shí)驗進(jìn)行證明；脂肪、腦、脊髓等組織中的藥物濃度一直較低，125I-MIL50不易進(jìn)入脂性強(qiáng)的組織，不易透過血腦屏障；24 h組織和體液的藥物濃度在雌、雄個體之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，125I-MIL50在大鼠體內(nèi)的分布無性別差異。

3.5125I-MIL50在大鼠體內(nèi)的排泄

Wistar大鼠靜脈注射2.2 mg/kg的125I-MIL50后，糞、尿、膽汁累積排泄率示于圖2。由圖2可知，0～120 h內(nèi)，從膽汁排泄的放射性活度占總給藥量放射性活度的4.5%±1.6%。 0～27 d內(nèi)，從尿液排泄的放射性活度占總給藥量放射性活度的62.6%±4.4%，從糞便中排泄的放射性藥物量占總給藥量放射性的15.5%±0.9%。表明MIL50主要經(jīng)尿排泄，與組織分布中腎臟內(nèi)藥物濃度一直較高相符。

表1　125I-MIL50 34 d藥代動力學(xué)參數(shù)(n=6)

注：AUC0-t為藥時曲線下面積，Vd為表觀分布容積，MRTlast為平均駐留時間，CL為清除率

表2　125I-MIL50 14 d藥代動力學(xué)參數(shù)(n=6)

表3　 Wistar大鼠尾靜脈注射125I-MIL50后各組織中的藥物濃度

注：1) 雌雄個體之間無差異，P>0.05；— 表示低于定量下限。

圖2　Wistar 大鼠靜脈注射125I-MIL50累積排泄率Fig.2　Cumulative excretion rateof125I-MIL5 after iv. injection to Wistar rats

4小結(jié)

本研究建立了靈敏度高、操作簡便、重現(xiàn)性好的同位素示蹤法研究MIL50在大鼠體內(nèi)的動力學(xué)、生物分布和排泄特點(diǎn)，同時探究Ricin染毒對MIL50在大鼠體內(nèi)動力學(xué)的影響。Ricin染毒在低濃度時加快125I-MIL50在大鼠體內(nèi)的消除；125I-MIL50與組織無特異性結(jié)合，不易進(jìn)入脂性組織；125I-MIL50在體內(nèi)主要經(jīng)尿排泄。

參考文獻(xiàn)：

[1]Griffiths G D. Understanding ricin from a defensive viewpoint[J]. Toxins, 2011, 3(11): 1 373-1 392.

[2]李楠,黎繼烈,朱曉媛. 蓖麻毒蛋白的研究進(jìn)展[J]. 中國油脂,2013,38(6):24-27.

Li Nan, Li Jilie, Zhu Xiaoyuan. Research progress on ricin[J]. China Oils and Fats, 2013, 38(6): 24-27(in Chinese).

[3]張任鵬. 蓖麻毒素單克隆抗體的制備[D]. 吉林：吉林大學(xué),2013.

[4]常春,焦媛媛,方琪,等. 蓖麻中毒與檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 西北藥學(xué)雜志,2012,27(4):394-397.

Chang Chun, Jiao Yuanyuan, Fang Qi, et al. Progress in the intoxication and detection of castor[J]. Northwest Pharmaceutical Journal, 2012, 27(4): 394-397(in chinese).

[5]Smallshaw J E, Vitetta E S. Ricin vaccine development[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2012, 357: 259-272.

[6]Yermakova A, Klokk T I, Cole R, et al. Antibody-mediated inhibition of ricin toxin retrograde transport[J]. Mbio, 2014, 5(2): e00995-e00995.

[7]Hu W G, Yin J, Chau D, et al. Humanization and characterization of an anti-ricin neutralization monoclonal antibody[J]. PLoS One, 2012, 7(9): e45595.

[8]Smallshaw J E, Richardson J A, Pincus S, et al. Preclinical toxicity and efficacy testing of RiVax, a recombinant protein vaccine against ricin[J]. Vaccine, 2005, 23(39): 4 775-4 784.

[9]Smallshaw J E, Richardson J A, Vitetta E S. RiVax, a recombinant ricin subunit vaccine, protects mice against ricin delivered by gavage or aerosol[J]. Vaccine, 2007, 25(42): 7 459-7 469.

[10]Guo J, Shen B, Sun Y, et al. A novel neutralizing monoclonal antibody against both ricin toxin A and ricin toxin B, and application of a rapid sandwich enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Hybridoma, 2006, 25(4): 225-229.

[11]Wang Y, Guo L, Zhao K, et al. Novel chimeric anti-ricin antibody C4C13 with neutralizing activity against ricin toxicity[J]. Biotechnol Lett, 2007, 29(12): 1 811-1 816.

[12]Luo L, Luo Q, Guo L, et al. Structure-based affinity maturation of a chimeric anti-ricin antibody C4C13[J]. Biomol Struct Dyn, 2014, 32(3): 416-423.

[13]楊婷婷,廖建民,江欣,等. 多肽ADWX-1在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究[J]. 藥物生物技術(shù),2012,19(4):334-337.

Yang Tingting, Liao Jianmin, Jiang Xin, et al. Pharmacokinetic study of polypeptide ADWX-1 in rats[J]. Pharmaceutical Biotechnology, 2012,19(4): 334-337(in Chinese).

[14]謝瑛. 生物大分子藥物的標(biāo)記及其藥代動力學(xué)研究[D]. 上海：第二軍醫(yī)大學(xué),2010.

[15]于秋菊,朱曉霞,王德才,等.125I-rAncrod在大鼠體內(nèi)的組織分布與代謝[J]. 同位素,2015,28(2):107-112.

Yu Qiuju, Zhu Xiaoxia, Wang Decai, et al. Tissue distribution and metabolism of125I-rAncord in Wistar Rats[J]. Journal of Isotopes, 2015,28(2): 107-112(in Chinese).

[16]Gupta S, Batra S, Jain M. Antibody labeling with radioiodine and radiometals[J]. Methods Mol Biol, 2014, 1 141(2): 147-157.

[17]Lindegren S, Andrade L N, B?ck T, et al. Binding affinity, specificity and comparative biodistribution of the parental murine monoclonal antibody MX35(Anti-NaPi-2b) and its humanized version rebmab200[J]. PLoS One, 2015, 10(5): e0126298.

Pharmacokinetics and Biodistribution of125I-MIL50 in Wistar Rats

LEI Xiao1,2, ZHU Xiao-xia2, WANG De-cai1, MENG Zhi-yun2, GAN Hui2,U Ruo-lan2, WU Zhuo-na2, ZHENG Ying2, LI Jian2, Lü Ming3, DOU Gui-fang2

(1.TaishanMedicalUniversity,Tai’an271000,China;2.InstituteofTransfusionMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China;3.InstituteofBasicMedicalScience,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China)

Abstract:In order to study the impact of Ricin on the pharmacokinetics of125I-MIL50 and to investigate the tissue distribution and excretion of125I-MIL50 in Wistar rats, MIL50 was labeled with125I using the Iodogen method. Then, the concentration of125I-MIL50 in serum、tissues、body fluids and excretions was measured by TCA method at different time. The results showed that25I-MIL50 was eliminated faster after 14 days in the Ricin administrated group. The concentration of125I-MIL50 in serum was always higher than that in other tissues. The level in kidney and bladder were high and in brain, spine and fat were low. The cumulative excretion rate of125I-MIL50 was 62.6% in urine, and 15.5% in feces within 27 days. Ricin could fasten the elimination of125I-MIL50 when the concentration of125I-MIL50 was low in Wistar rats. It might because of the interaction between antigen and antibody.125I-MIL50 had no specific combination with tissues and it could hardly entered into lipophilic tissues. Urinary excretion represented the major pathway of elimination of125I-MIL50. The results of the study provide a reference for clinical trials and drug administration program.

Key words：Ricin;125I-MIL50; pharmacokinetics; biodistribution; excretion

收稿日期：2016-01-26;修回日期：2016-03-10

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2012AA022001-05)

作者簡介：雷曉(1990—)，女，山東泰安人，藥理學(xué)專業(yè) 通信作者：竇桂芳，博士，研究員，E-mail: douguifang@vip.163.com；王德才，教授，E-mail: dcwang@tsmc.edu.cn

中圖分類號：TL92+3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)02-0065-06

doi：10.7538/tws.2016.29.02.0065