閔子揚，劉澤發(fā)，楊紅波，成娟，孫小武, *

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省西瓜甜瓜研究所，湖南 長沙 410125；3.湖南省瓜類研究所，湖南 邵陽 422001)

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南瓜胚囊再生植株倍性鑒定方法的比較

閔子揚1, 2，劉澤發(fā)1，楊紅波3，成娟1，孫小武1, 3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省西瓜甜瓜研究所，湖南 長沙 410125；3.湖南省瓜類研究所，湖南 邵陽 422001)

摘 要：以南瓜胚囊再生植株為材料，采用形態(tài)學(xué)鑒定法、根尖染色體計數(shù)法和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計數(shù)法3種方法對46株南瓜胚囊再生植株的倍性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：在46株再生植株中，有12株再生植株生長勢弱、葉片較薄、葉脈不明顯、分枝少、根系不發(fā)達(dá)，與其他倍性植株在形態(tài)上有明顯差異；進(jìn)一步進(jìn)行染色體計數(shù)后，發(fā)現(xiàn)僅有7株再生植株的染色體數(shù)n=x=22，7株單倍體植株的保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)的平均值為4.28個，正常二倍體組培苗的平均葉綠體數(shù)目為8.37個。說明形態(tài)學(xué)鑒定法只能作為倍性鑒定的一種輔助方法，而染色體計數(shù)法雖直接、準(zhǔn)確，但效率低，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計數(shù)法高效、簡便。

關(guān) 鍵 詞：南瓜；倍性鑒定；再生植株；形態(tài)學(xué)鑒定法；根尖染色體計數(shù)法；氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計數(shù)法

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南瓜離體雌核培養(yǎng)再生植株的倍性構(gòu)成比較復(fù)雜，往往由單倍體、二倍體或雙單倍體、混倍體等不同倍性的植株構(gòu)成[1–3]。但是，在育種實踐中有應(yīng)用意義的只有單倍體或雙單倍體，因此，盡早檢測出單倍體植株并及時進(jìn)行加倍處理，是獲得理想純合自交系、顯著提高育種效率的重要一環(huán)[4]。

筆者在前期試驗中建立了比較完善的南瓜未授粉子房離體培養(yǎng)植株再生體系，獲得了較多的再生植株，可對南瓜胚囊再生植株的倍性鑒定進(jìn)行系統(tǒng)的比較。本試驗采用形態(tài)學(xué)觀察法、根尖染色體計數(shù)法、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計數(shù)法3種方法觀察再生植株的倍性構(gòu)成情況，并對3種方法進(jìn)行了比較，試圖找到適合大量再生植株倍性鑒定的方便、準(zhǔn)確的方法。

1　材料與方法

1.1材料

試驗材料為2014年秋季由南瓜品種‘雪峰蜜本’未授粉子房離體培養(yǎng)發(fā)育而來的再生植株。為消除組培環(huán)境對植株的影響，以‘雪峰蜜本’子葉培養(yǎng)獲得的二倍體組培苗為對照。

試驗所需試劑有卡諾氏固定液、1 mol/L HCl溶液、改良的卡寶品紅染色液、1% I2–KI溶液、無菌水等。試驗所用主要儀器為BK3300光學(xué)生物顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1再生植株形態(tài)學(xué)觀察

以正常二倍體組培苗和再生植株群體自身為對照，通過形態(tài)學(xué)觀察對所得46株南瓜再生植株進(jìn)行初步倍性判斷。具體評價指標(biāo)為葉片大小、葉片厚度、株高、莖粗、節(jié)間長和分枝數(shù)。

1.2.2染色體計數(shù)法

參照陳解放[5]的南瓜根尖染色體計數(shù)方法并稍作改進(jìn)，進(jìn)行再生植株根尖染色體的觀察，具體步驟如下：09：00左右，分別取初步判斷為單倍體的植株和正常二倍體組培苗的根尖1～2 mm，放入無菌水中，4 ℃預(yù)處理24 h后，放入卡諾氏固定液中固定24 h，將固定后的根尖用無菌水漂洗3～5 min，然后將其投入到預(yù)熱后的1 mol/L的HCl溶液中，60 ℃水浴解離9 min，將解離后的根尖放入無菌水中沖洗3次，每次3 min，做后低滲處理，用改良的卡寶品紅染色液將漂洗干凈的根尖染色15 min，切取分生區(qū)部分(半透明狀態(tài))，放在滴有1滴無菌水的載玻片上，蓋上蓋玻片后用橡皮輕輕敲擊使根尖分散開，在400倍顯微鏡下進(jìn)行染色體數(shù)目的觀察并拍照。

1.2.3氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計數(shù)法

參照姚焱等[6]的方法,直接以組培苗的葉片為材料，進(jìn)行氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目的觀察。具體步驟如下：分別摘取利用根尖染色體計數(shù)法已確定為單倍體的胚囊植株和正常二倍體植株的第3片葉，放入脫色液(無水乙醇與冰醋酸體積比為3∶1)中直至葉片的綠色完全褪去為止，切取部分脫色的葉片放入無菌水中漂洗3～5 min，漂洗后的葉片放在載玻片上，用1% I2–KI溶液染色1～2 min，蓋上蓋玻片，鏡檢。每個葉片隨機(jī)記錄30個氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)目，重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理； 運用SPSS16.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同倍性植株的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

筆者對2014年秋季獲得的46株再生植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，有12株再生植株生長勢弱，葉片顏色淺、葉片小且薄，莖桿細(xì)，分枝少，根細(xì)長且無主根，表現(xiàn)出單倍體植株的形態(tài)特征(圖1–A)，剩余34株再生植株生長勢與正常二倍體組培苗差異不明顯，葉片較厚，葉尖正常，葉脈明顯，莖桿粗壯分枝多，可見明顯主根系，可初步判斷為二倍體或雙單倍體(圖1–B)。

2.2根尖染色體計數(shù)法鑒定結(jié)果

以正常的二倍體南瓜組培苗為對照，對2.1中初步判斷為單倍體的12株再生植株采用根尖染色體計數(shù)法進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這12株疑似單倍體植株中，有7株染色體數(shù)為n=x=22(圖1–C)，是正常二倍體南瓜組培苗根尖染色體數(shù)目(n=2x=44)的一半(圖1–D)，為單倍體植株。對于疑似二倍體或雙單倍體的再生植株沒有全部進(jìn)行染色體計數(shù)法鑒定。

2.3保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目計數(shù)法鑒定結(jié)果

以二倍體南瓜組培苗為對照，對2.2中已確定為單倍體的7株胚囊再生植株和部分疑似二倍體或雙單倍體再生植株進(jìn)行葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)的觀察，結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，不同倍性的植株的平均葉綠體數(shù)存在顯著差異，單倍體植株的平均葉綠體數(shù)為4.28個(圖1–E)，而正常二倍體組培苗的平均葉綠體數(shù)為8.37個(圖1–F)，它們之間的個數(shù)比接近于1∶2。對于那些未知倍性的再生植株進(jìn)行氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目觀察發(fā)現(xiàn)，其平均葉綠體數(shù)稍少于正常的二倍體組培苗，為8.05個，但它們之間差異不顯著，由此推測這些再生植株可能為二倍體，或已自然加倍的雙單倍體，其田間性狀正在進(jìn)行觀察。無論是單倍體還是二倍體，它們的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)都不是固定的，均在一個合理的范圍內(nèi)變化，對氣孔葉綠體個數(shù)的分布進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，單倍體植株中葉綠體數(shù)＞3～6個的占56.67%，1～3個的占23.33%，＞6～9個的占20.0%，＞9個的為0；二倍體植株中＞6～9個的占63.33%，＞3～6個和＞9～12個的均為16.67%，＞12個的僅占3.33%。在疑似二倍體或雙單倍體的再生植株中，葉綠體個數(shù)＞6～9個的占56.67%，低于正常的二倍體組培苗，但又明顯高于單倍體植株，這可能是因為再生植株的生理狀態(tài)不如正常的二倍體組培苗，且光合作用稍弱的緣故。

表1　不同倍性植株的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)分布頻率及平均數(shù)Table 1　The rate of different stomatal guard cell chloroplast number and the average number of the different ploidy plants

圖1　再生植株的倍性鑒定結(jié)果Fig. 1 The ploid identification of the regenerated plants

3　討論

植株的倍性與形態(tài)之間存在一定的相關(guān)性，對再生植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，可以對再生植株的倍性做出初步的判斷。本試驗觀察到46株再生植株中有12株符合單倍體植株的形態(tài)特征，但是對它們進(jìn)行染色體計數(shù)后發(fā)現(xiàn)，只有7株是單倍體，說明此方法只能作為一種間接判斷植物倍性的方法，這與前人的研究[7]結(jié)論是一致的。

根尖染色體計數(shù)法是最直接的植株倍性鑒定方法，此方法步驟復(fù)雜，需時長，且要熟練的細(xì)胞學(xué)操作技術(shù)[8]，而二倍體南瓜染色體小，且數(shù)目較多(40～48個)，在制片的過程中很容易造成重疊，故在南瓜再生植株的倍性鑒定中無法大面積的應(yīng)用。本試驗只對初步判斷為單倍體的12株再生植株進(jìn)行了染色體計數(shù)，在鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，根尖的解離時間與觀察效果有密切關(guān)系，解離時間不夠，細(xì)胞壁解離不完全，壓片時細(xì)胞仍粘連在一起不易散開，經(jīng)常造成重疊，影響觀察結(jié)果。試驗結(jié)果顯示解離9 min的效果較好，這時細(xì)胞已完全分散，易于制片，這與陳解放[5]的研究結(jié)果稍有不同。同時，在進(jìn)行染色體制片時一定要使用清洗后烘干的載玻片，否則鏡檢時經(jīng)常會有一些顆粒物與南瓜染色體混淆，影響染色體計數(shù)的準(zhǔn)確性。

氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計數(shù)作為一種快速鑒定植株倍性的輔助方法，具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)實惠等特點，適合大樣本容量的倍性鑒定。很多學(xué)者在這方面做了系統(tǒng)的研究，并且給出了具體的劃分不同倍性植株保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目的范圍，如施先鋒等[11]報道，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)15可以作為區(qū)分西瓜二倍體和四倍體的指標(biāo)，符合度達(dá)90.2%。姚焱等[6]提出了依據(jù)保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)進(jìn)行何首烏倍性判定的指標(biāo)，即二倍體植株數(shù)為10～18個、三倍體植株數(shù)為19～23個、四倍體植株數(shù)為24～32個，其符合度達(dá)91.7%。袁素霞等[10]提出了一種甘藍(lán)、青花菜、芥藍(lán)通用的以保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目來劃分倍性的指標(biāo)，單倍體植株數(shù)≤10、二倍體植株數(shù)為11～15個，多倍體植株數(shù)＞15個，以此標(biāo)準(zhǔn)對1 153株游離小孢子再生植株的倍性進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示其符合度達(dá)93.93%。本試驗分別統(tǒng)計了90個南瓜單倍體和二倍體植株的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)南瓜單倍體再生植株的保衛(wèi)細(xì)胞平均葉綠體數(shù)目為4.28個，二倍體植株平均葉綠體數(shù)為8.37個，這與郭永強(qiáng)等[11]的研究結(jié)論相似。但由于再生植株數(shù)量有限，無法進(jìn)行符合度檢測，所以沒有對劃分南瓜單倍體和二倍體的保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目進(jìn)行界定。

本試驗選用的3種鑒定方法雖然能夠在生長發(fā)育早期鑒定出單倍體植株，并及時采取加倍措施使其成為雙單倍體，提高育種的效率，但對于已經(jīng)自然加倍的雙單倍體植株無法作出判斷，如何在生長發(fā)育早期檢測出雙單倍體植株是下一步的研究重點。

參考文獻(xiàn)：

[1] 周嫦，楊弘遠(yuǎn)．從未授粉的水稻幼嫩子房培養(yǎng)出單倍體植株[J]．遺傳學(xué)報，1980，7(3)：287–288．

[2] 吳伯驥，鄭國錩．煙草未授粉子房誘導(dǎo)單倍體植珠的細(xì)胞學(xué)和胚胎學(xué)研究[J]．植物學(xué)報，1982，24(2)：125–129．

[3] 祝仲純，吳海珊．煙草離體條件下未授粉子房胚狀體的發(fā)育[J]．植物學(xué)報，1981，23(6)：499–501．

[4] Kurtar E S，Sail N，Abak K．Obtention of haploid embryos and plants through irradiated pollen technique in sqush (Cucurbitapepo L.)[J]．Euphytica，2002，127(3)：335–344．

[5] 陳解放．南瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)體系的優(yōu)化[D]．鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010．

[6] 姚焱，李巖松，王藝霖，等．利用何首烏葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目鑒定植株倍性[J]．中藥材，2014，37(6)：939–942．

[7] 王秀英，李改珍，趙俊，等．大白菜小孢子植株群體染色體倍性鑒定方法[J]．山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(6)：671–672，681．

[8] Metwally E I，Moustafa S A，El Sawy B I，et al. Production of haploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules of Cucurbita pepo[J]．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1988，52：117–121．

[9] 施先鋒，彭金光，汪李平．用西瓜葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)鑒定西瓜染色體倍性[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，35(6)：640–642．

[10] 袁素霞，劉玉梅，方智遠(yuǎn)，等．甘藍(lán)類蔬菜小孢子再生植株染色體倍性與氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)的相關(guān)性[J]．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(1)：189–197．

[11] 郭永強(qiáng)，王建設(shè)，張慧玲，等．西葫蘆胚囊再生植株倍性鑒定方法研究[J]．華北農(nóng)學(xué)報，2004，19(3)：80–83．

責(zé)任編輯：尹小紅英文編輯：梁 和

Ploidy identification methods for regenerated plant from unfertilized ovary of pumpkin

Min Ziyang1, 2，Liu Zefa1，Yang Hongbo3，Cheng Juan1，Sun Xiaowu1, 3*
(1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Hunan Watermelon and Muskmelon Institute, Changsha 410125, China; 3. Hunan Province Melon Research Institute，Shaoyang, Hunan 422001, China)

Abstract:Three methods of chromosomal counting of the root, morphological identification and chloroplasts counting of stomatal guard cell were used to identify the ploidy of 46 regenerated plants from unfertilized ovary pumpkin. The results showed that 12 regenerated plants were poor growth, thinner leaf, unobvious vein, fewer branches, undeveloped root system and significant differences in morphology compared to the others; only 7 regenerated plants were found that the chromosomal number was n=x=22 by chromosomal counting of the root; the average number of chloroplasts in stomatal guard cell was 4.28 for the seven haploid regeneration plants, while the normal tissue cultured seedling was 8.37. The results suggest that morphological identification is an auxiliary mean for ploidy identifications and chromosomal counting is a direct, accurate but inefficient method, chloroplasts counting in stomatal guard cell is easier and more effective.

Keywords:pumpkin; ploidy identification; regenerated plant; morphological identification; chromosomal counting of the root ; chloroplasts counting of stomatal guard cell

中圖分類號：S642.101

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007?1032(2016)02?0162?04

收稿日期：2015–11–19 修回日期：2016–03–03

基金項目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目(201303112)

作者簡介：閔子揚(1989—)，男，河南駐馬店人，碩士，研究實習(xí)員，主要從事葫蘆科作物單倍體育種相關(guān)研究，minziyang1220@163.com；*通信作者，孫小武，教授，主要從事瓜類作物育種相關(guān)研究，sunxiaowu2007@126.com