雷東陽

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

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水稻PFP基因的克隆及其遺傳轉(zhuǎn)化

雷東陽

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

摘 要：采用 RT–PCR 方法，成功克隆到 1 個與水稻苗期耐熱相關(guān)的基因 PFP，構(gòu)建了該基因的超表達(dá)載體，通過基因槍法轉(zhuǎn)化水稻品種中花17，獲得 9 個轉(zhuǎn)基因陽性植株，與對照相比，T1代轉(zhuǎn)基因植株的苗期耐熱性明顯增強(qiáng)。33 個代表性地方水稻品種的耐熱表型與PFP 基因型的相關(guān)性分析結(jié)果表明，PFP 基因的基因型與品種的耐熱表型存在顯著的相關(guān)性。本研究中還分析了該基因在鹽、4 ℃低溫、PEG和ABA脅迫處理下的基因表達(dá)情況。

關(guān) 鍵 詞：水稻；耐熱基因PFP；過氧化物酶；基因克?。贿z傳轉(zhuǎn)化

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高溫和干旱等逆境脅迫使植物的產(chǎn)量降低和種植區(qū)域受限制。隨著全球氣候的變化和人口的增長，迫切需要培育能夠耐受不同逆境的作物。為了從分子水平解釋植物適應(yīng)逆境的機(jī)制，獲得抗逆基因用于抗逆育種，對植物適應(yīng)逆境機(jī)制的研究已經(jīng)從生理水平進(jìn)入到了分子水平。水稻基因組學(xué)研究已取得了重大進(jìn)展，其高密度連鎖圖譜及2個亞種的基因組工作框架圖已經(jīng)被構(gòu)建，粳稻(日本晴)和秈稻(9311)的全基因組測序已經(jīng)完成，一批控制質(zhì)量性狀的基因和控制復(fù)雜農(nóng)藝性狀及耐逆性狀的基因/QTL也已被克隆出來[1–2]。隨著全球氣候變暖，水稻耐熱基因的挖掘和耐熱水稻品種的選育已成為水稻遺傳育種研究的重要課題。筆者采用基因芯片對經(jīng)高溫處理的熱敏感野生稻滲入系 YIL106和耐熱輪回親本特青的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)合QTL初步定位結(jié)果和生物信息學(xué)方法，針對野生稻滲入系群體對 QTL 定位區(qū)域內(nèi)的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析和驗(yàn)證[3]，篩選出與水稻苗期耐熱性相關(guān)的基因 LOC_Os01g19020。該基因?qū)儆谶^氧化物酶家族類(peroxidase family protein)基因。本研究中克隆了PFP 基因，并將其編碼區(qū)構(gòu)建超表達(dá)載體，通過基因槍法獲得了轉(zhuǎn)基因植株?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為耐熱品種特青、熱敏感滲入系YIL106、粳稻品種中花17和日本晴等77個具代表性水稻品種。

所用的各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq Plus酶等購自TAKARA公司；PCR Buffer、dNTP、TRIzol RNA提取試劑盒、大腸桿菌(E.coli)TOP10 購自天根生物工程公司；反轉(zhuǎn)錄酶購自六合通公司。所使用的各引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。各序列由北京六合華大基因科技公司進(jìn)行測序分析。

1.2方法

1.2.1苗期耐熱性的鑒定

選取飽滿的水稻種子，用3%的次氯酸鈉消毒20 min，清洗后室溫浸種2 d，30 ℃催芽2 d，將出芽整齊的種子播種于剪去管底的96孔PCR塑料板，放至裝有Yoshida培養(yǎng)液的塑料盒子中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換1次營養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為12 h光照(28 ℃)/12 h黑暗(26 ℃)，相對濕度為70%。幼苗長至2葉1心時(shí)進(jìn)行42 ℃高溫處理9 d，調(diào)查葉赤枯度，根據(jù)文獻(xiàn)[4]中的7級分類法進(jìn)行抗性鑒定。

1.2.2葉片總RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

(RT–PCR)

葉片總RNA的提取參考文獻(xiàn)[5]中的方法。

利用PRIMER3軟件設(shè)計(jì)該基因的特異引物(正向引物5′–AGTCCTGCTGGACAAGTCGT–3′)、反向引物5′–RTAGATGAGGATGTCGGAGCA– 3′)，選用水稻的18S基因作為內(nèi)標(biāo)基因，引物序列為18S–F (5′–GCTTTGGTGACTCTAGATAAC–3′)和18S–R (5′–GTCGGGAGTGGGTAATTTGC–3′)，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。手工設(shè)定熒光閾值，確定特定熒光閾值下各樣品的 Ct 值，采用 2–ΔΔCt對不同樣品的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.3過量表達(dá)載體的構(gòu)建

利用RT–PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)基因，并在PCR引物中引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(KpnⅠ和SpeⅠ)，從 cDNA 模板中擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的目標(biāo)基因的編碼序列。質(zhì)粒提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等參照試劑盒說明書。提取過表達(dá)載體pCAMBIA1301–PFP 質(zhì)粒，用基因槍法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，將目的基因超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到粳稻品種中花17中。

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株的檢測

采用 PCR 擴(kuò)增潮霉素抗性基因(HYG)片段，檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株?？剐曰?HYG)檢測引物為HYG–F(5′–TACTTCTACACAGCCATC–3′)和HYG–R (5′–CGTCTGTCGAGAAGTTTC–3′)。

1.2.5PFP 基因序列的擴(kuò)增和測序

首先依據(jù)已公布的日本晴和9311 DNA序列設(shè)計(jì)引物，以YIL106和特青2個材料的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：2 μL 模板，0.2 μL Taq Plus(2.5 U/ μL)，2 μL Taq Plus Buffer(2x)，1 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，2 μL Primer，12.8 μL ddH2O。擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)擴(kuò)增5 min；94 ℃擴(kuò)增30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技公司進(jìn)行測序，用DNAssist 2.0軟件進(jìn)行基因序列比對分析。

1.2.6代表性水稻品種PFP 基因的測序與耐熱表型鑒定

選取77個具代表性的地方水稻品種進(jìn)行苗期耐熱性鑒定，篩選表型確定的且耐熱級別大于4的17個品種定義為熱敏感品種(S)，篩選表型確定且耐熱等級小于2.5的16個品種定義為耐熱品種(R)。對這33個品種分別提取基因組DNA，對目的基因PFP進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。

1.2.7鹽和低溫等脅迫處理后PFP 基因的表達(dá)

為了研究PFP基因是否受ABA、鹽脅迫、PEG干旱和低溫脅迫的誘導(dǎo)，分別用100 μmol/L ABA、200 mmol/L NaCl、30%PEG 和4 ℃低溫處理YIL106和特青2葉1心期的幼苗，處理0、1、8、24 h分別取樣，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT–PCR分析。引物序列為HYG–F(5′–AGTCCTGCTGGACAAGTCGT–3′)和HYG–R(5′–TAGATGAGGATGTCGGAGCA–3′)。

2　結(jié)果與分析

2.1PFP基因序列的擴(kuò)增和測序分析

為了獲得PFP基因序列的全長編碼序列，并驗(yàn)證PFP基因在野生稻熱敏感滲入系YIL106和耐熱輪回親本特青的基因組水平上是否存在差異，對YIL106和特青中PFP基因的編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增和克隆測序，結(jié)果表明，PFP基因在熱敏感滲入系YIL106和耐熱輪回親本特青中的擴(kuò)增產(chǎn)物長均為1 041 bp，但二者的cDNA序列存在1個堿基的差異，其中特青中第70個堿基為T，而在YIL106中為A。這導(dǎo)致了二者存在1個編碼蛋白差異(圖 1)。

圖1　PFP 基因在YIL106與特青中的編碼蛋白Fig.1 Com parison the encoding p roteins of gene PFP in YIL106 and Teqing

2.2PFP基因型與水稻耐熱性的相關(guān)性分析

PFP基因型與水稻耐熱性的相關(guān)性分析結(jié)果表明，在16個表型被鑒定為耐熱的品種中有13個品種的PFP基因序列與耐熱品種特青的一致，而17個表型被鑒定為熱敏感的品種中有14個品種的PFP基因序列與熱敏感品種YIL106的一致。對這33個水稻品種的耐熱表型和基因型進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果表明，PFP基因型與水稻苗期耐熱性存在顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.610。

2.3PFP基因過表達(dá)載體的構(gòu)建

利用qRT–PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，并在PCR引物中引入合適的限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和 SpeⅠ酶切位點(diǎn)，從特青的cDNA模板中擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的目標(biāo)基因CDS序列，酶切PCR產(chǎn)物，回收后連接到PMD18–T克隆載體上，利用通用引物M 13測序，挑選序列完全正確的克隆，酶切回收后連接到過表達(dá)載體pCAMBIA 1301上，對陽性克隆進(jìn)行酶切、PCR擴(kuò)增和測序驗(yàn)證，得到了完全正確的克隆。利用水稻品種中花17，采用組成型啟動子過表達(dá)PFP基因(轉(zhuǎn)特青基因)，得到9株陽性轉(zhuǎn)基因植株(圖3)，并獲得轉(zhuǎn)基因T1代植株。

圖3　PFP基因過表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測結(jié)果Fig. 3 Identification the transformants overexpressed by gene PFP using PCR

圖2　RT–PCR擴(kuò)增的目的條帶Fig.2 RT–PCR resu lt of gene PFP

2.4轉(zhuǎn)PFP基因植株的表型分析

待轉(zhuǎn)PFP基因植株和對照中花17植株長至2葉1心時(shí)進(jìn)行42 ℃高溫處理，鑒定耐熱表型。由圖4可以看出，高溫處理后中花17的第2和第3片葉有一半以上枯黃，而轉(zhuǎn)基因植株的第2和第3片葉只有葉尖枯黃，大部分葉片仍為綠色?？梢钥闯?，與對照中花17比較，PFP 基因超表達(dá)植株的耐熱性明顯增強(qiáng)，但轉(zhuǎn)基因植株不同株系的耐熱表型存在一定程度的分離。

圖4　轉(zhuǎn)基因植株和對照中花17高溫處理后的表型Fig.4 Phenotypic comparison of transgenic plants and control from Zhonghua17 after heat treatment

2.5NaCl、低溫、PEG和ABA脅迫處理下PFP基因的表達(dá)情況

由圖5可見，與未處理時(shí)相比，經(jīng)NaCl處理后，PFP基因在特青中的表達(dá)量在處理1 h時(shí)明顯上升，隨后下降，在YIL106中的表達(dá)量相對較低。

圖5　NaCl處理下特青和YIL106中PFP基因在不同處理時(shí)間的mRNA表達(dá)水平Fig.5 Comparison the expression of PFP gene at different times on NaCl treatments in YIL106 and Teqing

由圖6可見，經(jīng)4 ℃低溫處理后，與未處理時(shí)相比，PFP基因在YIL106中的表達(dá)量變化不大，在特青中的表達(dá)量在處理8 h時(shí)略有上升。

圖6　4 ℃低溫處理下特青和YIL106中PFP基因在不同處理時(shí)間的mRNA表達(dá)水平Fig.6 Comparison the expression of PFP gene at different times on 4 ℃ low temperature in YIL106 and Teqing

由圖7可見，經(jīng)PEG處理后，與未處理時(shí)相比，PFP基因在特青中的表達(dá)量在處理8 h時(shí)略有上升，而在YIL106中的表達(dá)量各處理均明顯下降。

圖7　PEG處理下特青和YIL106中PFP基因在不同處理時(shí)間的mRNA表達(dá)水平Fig.7 Comparison the expression of PFP gene at different times on PEG in YIL106 and Teqing

由圖8可見，經(jīng)ABA處理后，與未處理時(shí)相比，PFP基因在YIL106中的表達(dá)量在處理24 h時(shí)明顯上升，在特青中的表達(dá)量在處理1 h和處理24 h有比較明顯的上升。

圖8　ABA處理下特青和YIL106中PFP基因在不同處理時(shí)間的mRNA表達(dá)水平Fig.8 Comparison the expression of PFP gene at different times on ABA in YIL106 and Teqing

3　結(jié)論與討論

日本和國際水稻研究所較早地開展了耐熱水稻品種的選育研究[4–5]。日本學(xué)者Satake等[6]曾進(jìn)行過水稻耐熱品種篩選和耐熱性狀數(shù)量遺傳分析，發(fā)現(xiàn)水稻對高溫的耐性具有品種特異性；中國學(xué)者徐云碧等[7]報(bào)道，不同水稻品種耐熱性的差異較大。這些研究結(jié)果表明，遺傳因素是影響水稻品種間耐熱性差異的主要因素。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，已有了利用分子標(biāo)記對水稻耐熱性進(jìn)行數(shù)量性狀基因(quantitative trait loci，QTL)定位研究的報(bào)道[8–10]。

植物通過一系列生理生化代謝來適應(yīng)高溫逆境，一般認(rèn)為，植物體內(nèi)的熱激蛋白(heat shock protein, HSP)和熱激因子(heat shock factors, HSF)可能是參與調(diào)控這些生理過程的重要因子。在水稻中已鑒定出21個在抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的Hsfs[11]，如Spl7(HsfA4b) DNA結(jié)合域1個堿基的變異引起氨基酸序列發(fā)生變化，使色氨酸變?yōu)榘腚装彼?，?dǎo)致水稻葉片在高溫條件下出現(xiàn)受傷害的表型[12]；過量表達(dá)OsHsp17.7使水稻耐熱UV–B增加和耐干旱等抗逆能力增強(qiáng)[13]。

本研究中克隆了水稻苗期耐熱性狀的相關(guān)基因PFP，構(gòu)建了該基因的過表達(dá)載體，獲得了轉(zhuǎn)基因植株后代，其轉(zhuǎn)基因植株的苗期耐熱性得到提高，耐熱基因PFP在鹽和低溫脅迫下的基因表達(dá)上調(diào)。

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責(zé)任編輯：王賽群英文編輯：王 庫

Cloning and genetic transformation of gene PFP in rice

Lei Dongyang
(College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Abstract:PFP, a peroxidase family protein gene, was successfully separated and cloned from rice by means of RT–PCR strategy, overexpression construction was prepared and nine positive transgenic plants were obtained by gene gun bombardment method. Compared to Zhonghua17, the overexpression plants of the candidate gene PFP showed heat tolerance. Functional association analysis of the gene PFP using 33 rice cultivars showed that it had significant correlation (P≤0.01) with heat tolerance. The expression of gene PFP in salt, cold, PEG and ABA stress was also analysised in this study.

Keywords:rice; heat tolerance PFP; peroxidase; gene cloning; genetic transformation

中圖分類號：S511.032

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007?1032(2016)02?0113?05

收稿日期：2015–08–31 修回日期：2016–03–07

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)杰出青年科學(xué)基金(2016JJ1011)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金(15B117)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)開放基金(ZWKF201506)

作者簡介：雷東陽(1980—)，男，湖南邵陽人，博士，副教授，主要從事水稻遺傳育種研究，leidongyang1980@126.com