林　琳，程艷杰

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 檢驗科，遼寧 大連 116011)

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類風濕關節(jié)炎患者TH17細胞及其相關細胞因子的表達及臨床意義

林琳，程艷杰

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 檢驗科，遼寧 大連 116011)

[摘要]目的探討類風濕關節(jié)炎(RA)患者TH17細胞及其相關細胞因子的表達及臨床意義。方法收集大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診RA初治活動期患者的外周血標本32例為活動期RA組，健康獻血者30例為健康對照組，所有受試者清晨空腹坐位肘靜脈采血。應用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)及反轉錄PCR(RT-PCR)法，分別檢測外周血血清中IL-17水平和外周血單個核細胞(PBMC)中IL-17mRNA表達水平；將PBMC一組不加刺激，另一組用佛波酯(50 ng/mL)和離子霉素(1 μg/mL)刺激4 h后，流式細胞儀檢測TH17細胞數(shù)量。結果活動期RA患者血清IL-17水平(15.76±0.62) pg/mL與健康對照組(8.67±0.12) pg/mL比較，差異有顯著性意義(P<0.05)?；顒悠赗A患者PBMC的IL-17mRNA表達水平(1.94±0.46)與健康對照組(0.84±0.16)比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。RA組血清IL-17水平與mRNA表達水平呈正相關(r=0.70, P<0.05)，且與疾病活動程度(DAS28)評分呈正相關(r=0.99, P<0.05)?；顒悠赗A患者外周血TH17細胞比例(2.50±0.54)%與健康對照組(0.03±0.00)%比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。但刺激組(3.23±0.05)%與無刺激組(2.50±0.54)%比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。RA患者組TH17細胞數(shù)量與疾病活動程度(DAS28)評分呈正相關(r=0.96, P<0.05)。結論活動期RA患者TH17細胞及其主要效應性細胞因子IL-17在細胞、蛋白和基因表達水平上均明顯升高并與疾病活動程度呈正相關，對臨床制定治療方案、判斷療效有指導意義。

[關鍵詞]類風濕性關節(jié)炎;TH17細胞;IL-17;IL-17mRNA;RT-PCR;流式細胞儀

[引用本文]林琳,程艷杰.類風濕關節(jié)炎患者TH17細胞及其相關細胞因子的表達及臨床意義[J].大連醫(yī)科大學學報，2016,38(3)：232-236.

類風濕性關節(jié)炎(RA)是中國高發(fā)的一種以關節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病。目前的主要治療原則是使患者獲得盡可能長的完全緩解期，以非甾體抗炎藥、免疫抑制劑、抗風濕類藥等為主，對肝腎功能有損害，因此更需要明確RA的病因及其新的治療靶點。近年來對自身免疫性疾病動物模型實驗，即自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)[1]和膠原誘導的關節(jié)炎(collagen-induced arthritis, CIA)[2]的研究中發(fā)現(xiàn)，體內注射抗IL-17中和性抗體能夠降低自身免疫性疾病的發(fā)生，減輕疾病的嚴重程度。CIA模型動物免疫接種重組IL-17的病毒樣顆粒后，小鼠體內IL-17抗體滴度升高，并且使疾病的嚴重程度降低[3-4]。與來自動物模型的大量證據(jù)相比，對人TH17細胞以及患者的該群細胞誘導自身免疫病的能力知之尚少。最近研究顯示，RA活動期IL-17生成增加，提示了IL-17與RA發(fā)病相關[5]。目前已經(jīng)鑒定出的TH17細胞表面的分子標記包括CD4、CD45RO、CCR6、CCR4等[6-7]，但是還沒有發(fā)現(xiàn)該細胞亞群具有特異性的表面標志。雖然IL-17能在多種細胞中檢測到，如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和單核細胞，但IL-17主要是由T淋巴細胞產(chǎn)生，如活化的CD4+T細胞[8]。因此可用IL-17陽性細胞占CD4+T細胞的百分比來鑒定TH17細胞亞群數(shù)量。本研究通過觀察活動期RA患者外周血CD4+IL-17+T細胞鑒定TH17細胞數(shù)量和其分泌的IL-17以及外周血單個核細胞(PBMC)中IL-17mRNA的表達水平，探討TH17細胞在RA發(fā)病中的作用。

1材料和方法

1.1研究對象

收集2013年7月至2014年2月大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診RA初治活動期患者的外周血標本，共計32例，其中男性7例，女性25例，平均年齡(51±6)歲。所有病例均符合1987年美國風濕病學會(American College of Rheumatology, ACR)修訂的RA分類標準[10]并除外腫瘤、炎癥及其它自身免疫性等疾病。所有RA患者均由風濕病?？漆t(yī)生填寫RA病例調查表，并對疾病活動程度進行評估，活動期RA：(1)符合ACR 1987年制定的分類標準；(2)3個或3個以上的關節(jié)腫脹，并有以下附加條件中的至少兩條：晨僵時間≥1 h；ESR≥28 mm/h；CRP增高≥1.5倍正常值；5個或以上的關節(jié)有壓痛。根據(jù)RA患者的臨床表現(xiàn)及實驗室檢查結果，計算DAS28評分。對照組：收集大連市中心血站2013年8月至2014年1月的健康獻血者，共30例，男9例，女21例，平均年齡(47±4)歲，均未被檢查出患有任何疾病。將RA患者外周血單個核細胞(PBMC)再分為刺激組和非刺激組。

1.2標本收集

采集所有受試者清晨空腹坐位肘靜脈血2 mL，采用分離膠促凝管，3500 r/min離心10 min，分離血清用于IL-17的檢測。采集所有受試者清晨空腹坐位肘靜脈肝素抗凝靜脈血3 mL，用于PBMC的提取。

1.3試劑與方法

人目的基因IL-17 119 bp上游引物TGTCCACCATGTGGCCTAAGAG，下游引物GTCCGAAATGAGGCTGTCTTTGA和看家基因GAPDH 196 bp上游引物GAAGGTGAAGGTCGGAGT，下游引物GAAGATGGTGATGGGATTTC，引物參考國外文獻設計[6-8]，由大連寶生物公司合成，IL-17 ELISA試劑盒購自美國BD公司，佛波酯和離子霉素購自SIGMA公司,CD4-FITC和IL-17-PE購自美國eBioscience公司。

應用酶聯(lián)免疫吸附法及反轉錄法(以RA患者PBMC中提取的總RNA為模板，用構建PCR引物調取管家基因GAPDH及目的基因IL-17)，分別檢測外周血血清中IL-17水平和外周血單個核細胞(PBMC)中IL-17mRNA表達水平。以Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，以含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液重懸細胞，刺激組用(50 ng/mL)佛波酯和(1 μg/mL )離子霉素6孔板刺激培養(yǎng)4 h?？笴D4-PE和抗IL-17-FITC標記，流式細胞儀檢測CD4+IL-17+T細胞的數(shù)量。

1.4結果判定

ELISA結果判定采用半定量方法S/CO(pg/mL)。RA患者及外周血PBMC中IL-17mRNA表達水平，根據(jù)讀取的灰度值與內參的比值分析結果。流式細胞儀上PBMC可分為幾個亞群，框定淋巴細胞群并以同型對照確定各熒光的分界游標后，軟件分析顯示待測樣品的圖像和各亞群細胞的百分率。

1.5統(tǒng)計學方法

2結果

2.1血清IL-17水平

活動期RA患者血清IL-17水平(15.76±0.62) pg/mL與健康對照組(8.67±0.12) pg/mL比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。

2.2PBMC中IL-17mRNA表達水平

活動期RA患者PBMC的IL-17mRNA表達水平(1.94±0.46)與健康對照組(0.84±0.16)比較，差異有顯著性意義(P<0.05)，見圖1和2。外周血IL-17與IL-17mRNA水平及DAS評分均呈正相關(r=0.70和0.99；均P<0.05)，見圖3和4。

圖1　活動期RA患者PBMC中I-17mRNA表達水平

圖2　健康對照組PBMC中IL-17mRNA表達水平Fig 2 The IL-17mRNA level of PBMC in normal group

圖3　RA患者外周血IL-17與IL-17 mRNA的水平的相關性分析(n=32)Fig 3 Correlation of IL-17 protein and mRNA in the peripheral blood of RA patients (n=32)

圖4　RA患者外周血IL-17水平與DAS28評分相關性分析(n=32)Fig 4 Correlation of IL-17 levels and DAS28 core in the peripheral blood of RA patients (n=32)

2.3CD4+IL-17+T細胞比例

活動期RA組CD4+IL-17+T淋巴細胞比例明顯高于健康對照組(P<0.01)，但刺激組與未刺激組CD4+IL-17+T細胞比例無明顯差異。見表1。未刺激組與刺激組細胞狀態(tài)見圖5，流式細胞儀檢測CD4+IL-17+T淋巴細胞比例(未刺激組/刺激組/對照組)見圖6。RA患者CD4+IL-17+T細胞與DAS評分呈正相關(r=0.96,P<0.05)，見圖7。

表1　RA患者外周血CD4+IL-17+T細胞的比例

組別CD4+IL-17+T細胞(%)活動期RA組(n=32) 刺激組3.23±0.05 未刺激組2.50±0.54健康對照組(n=30)0.03±0.00

活動期RA組與健康對照組比較，P<0.01; 刺激組與未刺激組比較，P>0.05

圖5　未刺激組與刺激組細胞形態(tài) (×400)Fig 5 Cell morphology in the non-stimulation group and stimulation group (×400)A：未刺激組；B：刺激組

圖6　流式細胞儀檢測CD4+IL-17+T淋巴細胞 Fig 6 The proportion of CD4+IL-17+ cells in each group by flow cytometry A：未刺激組；B：刺激組；C：對照組

圖7　RA患者CD4+IL-17+T細胞與DAS28評分的關系Fig 7 Correlation of CD4+IL-17+ T cells and DAS28 core in the peripheral blood of RA patients

3討論

活動期RA患者血清中IL-17A的水平明顯高于健康對照組(P<0.05)，活動期RA的PBMC IL-17mRNA的表達水平也高于正常對照組(P<0.05),且血清中IL-17A水平與PBMC IL-17mRNA表達水平呈正相關，表明活動期RA患者外周血存在著基因轉錄水平和蛋白質翻譯水平上IL-17的一致性高表達，提示IL-17的表達與RA疾病關系密切；以分泌IL-17為主要效應性細胞因子的TH17細胞，在RA發(fā)病活動過程中其功能是活躍的，且與RA疾病活動程度呈正相關的關系，進一步證實了TH17細胞通過一定機制參與RA患者疾病的發(fā)生和發(fā)展。對這種機制的進一步研究，將有可能通過調節(jié)IL-17mRNA的表達來降低RA患者的疾病活動性，從而達到治療關節(jié)炎癥的目的。另外，RA活動期患者外周血表達、分泌IL-17水平明顯升高，且其水平高低可反映疾病的活動程度，這對臨床制定治療方案，判斷療效有指導意義。用流式細胞技術檢測了RA患者外周血中CD4+IL-17+T細胞的數(shù)量，活動期RA患者外周血CD4+IL-17+T細胞比例明顯升高(P<0.01)，說明活動期RA患者外周血中存在異常增多的TH17細胞，這與患者血清中IL-17水平升高的結果相一致。這群異常增多的TH17細胞通過分泌大量的細胞因子IL-17參與RA的發(fā)病過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，細胞內細胞因子染色前加入PMA和鈣離子載體對細胞進行刺激，CD4+IL-17+T淋巴細胞比例不高于未加刺激對照組(P>0.05)，這與黃昂等[9]的研究結果不一致。分析其原因：有研究報道在PMA的刺激下細胞表面的CD4抗原會被內吞，使得檢測出的CD4+IL-17+雙陽性細胞比例偏低，但CD8的表達在這個過程中不受影響，因此可以通過CD3+和CD8-細胞反設門來確定CD4細胞亞群，即CD3+CD8-IL-17+T細胞的比例可能更加接近于TH17細胞的實際數(shù)量[10]。黃昂等[9]研究表示，在加入PMA和鈣離子載體刺激后，加入蛋白轉運抑制劑會提高IL-17+T細胞檢出率，但是在預實驗階段，發(fā)現(xiàn)蛋白轉運抑制劑(莫能霉素)的加入，細胞呈現(xiàn)蛋白變性的狀態(tài)，后期舍棄了加入蛋白轉運抑制劑組的對比試驗。這對體外檢測人TH17細胞頻率方法有參考價值。

本研究通過檢測RA患者外周血TH17細胞亞群的數(shù)量、細胞因子以及mRNA的表達水平，進一步證實了TH17細胞在數(shù)量和功能上與RA疾病活動程度的關系，這對臨床制定治療方案，判斷療效有指導意義。

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作者簡介:林 琳(1984-),女,遼寧沈陽人，主管技師。E-mail:linlin_work@yeah.net 通信作者：程艷杰，教授。E-mail:2845662180@qq.com

doi:論著10.11724/jdmu.2016.03.06

[中圖分類號]R593.22

[文獻標志碼]A

文章編號：1671-7295(2016)03-0232-05

(收稿日期：2016-03-05；修回日期：2016-05-20)

Clinical significance of TH17 cells and related cytokines expression in RA patients

LIN Lin, CHENG Yan-jie

(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

[Abstract]Objective To investigate TH17 cells and their cytokine expression in rheumatoid arthritis patients, which may play a positive role in clarifying the pathogenesis of RA. Methods Utilizing Enzyme-linked immunosorbent assay and reverse transcription PCR methods, IL-17 protein in serum and mRNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were measured in RA patients. TH17 cells were detected by flow cytometry in a group without stimulation and the other group with phorbol ester (50 ng/mL) and ionomycin (1 μg/mL) stimulation for 4 hours. Results Serum IL-17 levels in active RA patients were significantly higher than those in the normal control group (15.76±0.62) pg/mL vs. (8.67±0.12) pg/mL (P<0.05). PBMC IL-17 mRNA expression in active RA patients were significantly higher than the normal control group (1.94±0.46) vs. (0.84±0.16) (P<0.05). IL-17 protein levels were positively associated with mRNA expression levels (r=0.70, P<0.05). Serum IL-17 level of RA patients and disease activity (DAS28) score were positively correlated (r=0.99, P<0.05). In the peripheral blood of RA patients, TH17 cells proportion increased (2.50±0.54)% vs. (0.03±0.00)% (P<0.01), and there was no difference between stimulation and non-stimulation groups (3.23±0.05)% vs. (2.50±0.54)% (P>0.05). TH17 cells of RA patients and disease activity (DAS28) score were positively correlated (r=0.96, P<0.05). Conclusion In active RA patients, TH17 cells and their cytokine expression are significantly increased in the levels of cell, protein and mRNA, which suggests that TH17 cells might play an important role in the pathogenesis of RA.

[Key words]Rheumatoid arthritis (RA); TH17 cells; IL-17;IL-17mRNA; RT-PCR; flow cytometry