馮　麗，趙玉哲，曹文慶，張　靜

(河北省人民醫(yī)院 普外一科，河北 石家莊 050051)

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氨肽酶N在乳腺癌中的表達(dá)及與MMP-2、MMP-9的相關(guān)性研究

馮麗，趙玉哲，曹文慶，張靜

(河北省人民醫(yī)院 普外一科，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的研究氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義，并觀察其與基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的關(guān)系。方法收集河北省人民醫(yī)院病理科2011年7月至2012年9月乳腺癌石蠟標(biāo)本60例，癌旁正常乳腺組織石蠟標(biāo)本20例，及患者的臨床病理資料。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)APN在80例標(biāo)本中的表達(dá)，并分析APN表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。檢測(cè)MMP-2、MMP-9在乳腺癌組織中的表達(dá),及與APN表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果APN在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率36.7%(22/60)明顯高于癌旁正常乳腺組織0%(0/20)(χ2=10.115，P=0.001)。APN在乳腺癌中的表達(dá)與腫瘤病理類型有關(guān)(P=0.035)，多表達(dá)于浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；與患者絕經(jīng)狀況、腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、ER、PR、Her-2等無(wú)關(guān)(P>0.05)。乳腺癌組織APN的表達(dá)與MMP-2 、MMP-9的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論APN在乳腺癌中的表達(dá)高于正常乳腺組織，但APN在乳腺癌中侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

[關(guān)鍵詞]氨肽酶N/CD13；免疫組織化學(xué)；乳腺癌；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

[引用本文]馮麗，趙玉哲，曹文慶，等.氨肽酶N在乳腺癌中的表達(dá)及與MMP-2、MMP-9的相關(guān)性研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,38(3)：219-223.

氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)，又稱CD13，是一種能從肽鏈氨基端催化降解氨基酸殘基的水解蛋白酶。多年來(lái)APN/CD13主要作為髓系造血干細(xì)胞表面的標(biāo)志物而應(yīng)用于白血病或者淋巴瘤的分型，近年來(lái)卻相繼報(bào)道，其在肺癌、卵巢癌和肝癌等多種癌細(xì)胞表面高水平表達(dá)，在體內(nèi)參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。Chang YW等[1]研究發(fā)現(xiàn)APN可以增加肺癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲力。Inagaki Y等[2]研究顯示應(yīng)用APN抑制劑24F可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲性。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法，檢測(cè)APN在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，分析其與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系；并通過比較APN表達(dá)與MMP-2、MMP-9的關(guān)系，探討APN在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中所起的作用。

1材料和方法

1.1臨床資料

收集河北省人民醫(yī)院病理科2011年7月至2012年9月經(jīng)手術(shù)切除、病理證實(shí)的乳腺癌石蠟標(biāo)本60例，癌旁正常乳腺組織石蠟標(biāo)本20例，及其患者的臨床病理資料。所有乳腺癌患者均為女性，年齡28～72歲，中位年齡51.5歲，術(shù)前均未行放療、化療或其他針對(duì)腫瘤的治療，無(wú)其他腫瘤病史。

1.2試 劑

鼠抗人APN單抗(38C12)、鼠抗人MMP-2單抗(17B11)、鼠抗人MMP-9單抗(BA0573)、 SP試劑盒及DAB試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組織化學(xué)染色

所有石蠟標(biāo)本切成4 μm 厚切片，采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)APN在乳腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 在乳腺癌織中的表達(dá)。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用預(yù)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性片做陽(yáng)性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定

APN主要表達(dá)定位在細(xì)胞膜上。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)按陽(yáng)性著色程度評(píng)分：0分為無(wú)著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。(2)在高倍鏡(×400)下計(jì)數(shù)400個(gè)腫瘤細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：<10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。兩者乘積判定陽(yáng)性結(jié)果：1～3分為陰性(-)；4～5分為弱陽(yáng)性(+)；6～7分為中陽(yáng)性(++)；≥8分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。以“-”者為陰性，以“+、++、+++”者為陽(yáng)性。

MMP-2、MMP-9主要定位于細(xì)胞漿，以胞漿內(nèi)呈棕褐色顆粒為陽(yáng)性。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)顯色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無(wú)著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。(2)高倍鏡下(×400)隨機(jī)取4個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，<10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，≥76%為4 分。兩者分?jǐn)?shù)相加判定陽(yáng)性結(jié)果，0～1 分為陰性(-)，2～3 分為弱陽(yáng)性(+)，4～5 分為中陽(yáng)性(++)，6～7 分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。以“-”者為陰性，以“+、++、+++”者為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)均為計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)比較APN表達(dá)在兩組間的差異，采用spearman分析APN與MMP-2、MMP-9 的相關(guān)性。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1APN在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

APN主要表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜，少見細(xì)胞漿著色，多呈棕黃色或者淺黃色(圖1)，間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)缺乏。60例乳腺癌標(biāo)本中，陰性38例，弱陽(yáng)性8例，中陽(yáng)性5例，強(qiáng)陽(yáng)性9例，APN在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為36.7%(22/60)，顯著高于癌旁正常乳腺組織0%(0/20)(χ2=10.115，P=0.001)(圖2)。

2.2APN表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

APN的表達(dá)與腫瘤病理類型有關(guān)，多表達(dá)于浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(P<0.05)，與患者絕經(jīng)狀況、腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等無(wú)關(guān)(P>0.05)，與ER、PR、Her-2指標(biāo)無(wú)關(guān)。見表1。

2.3MMP-2、MMP-9在乳腺癌組織中的表達(dá)及與APN的關(guān)系

MMP-2、MMP-9主要定位于細(xì)胞漿，多呈棕褐色顆粒狀(圖3、4)。MMP-2陽(yáng)性表達(dá)率為75.0%(45/60)。MMP-2陽(yáng)性組和MMP-2陰性組APN陽(yáng)性表達(dá)率分別為33.3%(15/45)和46.7%(7/15)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.861，P=0.353)。MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率為76.7%(46/60)。MMP-9陽(yáng)性組和MMP-9陰性組APN陽(yáng)性表達(dá)率分別為39.1%(18/46)、28.6%(4/14)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.515，P=0.473)。相關(guān)性分析顯示，APN與MMP-2、MMP-9均無(wú)明顯相關(guān)性(rs=-0.113，P=0.390；rs=0.076，P=0.566)。

圖3　乳腺癌組織中MMP-2陽(yáng)性表達(dá)(SP×200)

圖4　乳腺癌組織中MMP-9陽(yáng)性表達(dá)(SP×200)

3討論

人APN基因定位于第15號(hào)染色體長(zhǎng)臂25-26區(qū)，全長(zhǎng)35 kb，包含20個(gè)外顯子。APN基因有近端和遠(yuǎn)端兩個(gè)啟動(dòng)子，在上皮細(xì)胞中多由近端啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；在髓細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中，多由遠(yuǎn)端啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。APN蛋白屬于結(jié)合鋅離子的金屬蛋白酶超家族，由967個(gè)氨基酸組成，分子量約150 kD左右，通過N端跨膜螺旋區(qū)錨在細(xì)胞膜上[3]，能夠從肽、酰胺或芳酰胺上水解釋放N端的中性氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，APN在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮著重要作用，以APN為靶點(diǎn)的靶向性抗腫瘤藥物也成為了抗癌藥物開發(fā)的新領(lǐng)域。

基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)降解是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，APN是一種與降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白相關(guān)的酶，這種酶在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)可能增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，加快腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。Terauchi M等[5]發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞APN的表達(dá)水平與癌細(xì)胞遷徙力呈正相關(guān)，應(yīng)用APN抑制劑bestatin，可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移能力。本研究通過免疫組化SP法研究了APN在乳腺癌中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)APN主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，定位于細(xì)胞膜，這可能與APN定位于細(xì)胞膜的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。APN在乳腺癌中表達(dá)率為36.7%，這與Ranogajec等[6](36.2%, 50/138)報(bào)道的數(shù)據(jù)較為一致。本研究還證實(shí)，APN在乳腺癌組織上的陽(yáng)性表達(dá)高于癌旁正常乳腺組織。

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其病理分型較多，預(yù)后差別大。常用的預(yù)測(cè)因子，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、絕經(jīng)狀態(tài)、ER、PR和Her-2蛋白表達(dá)情況等。本研究分析了APN的表達(dá)情況與乳腺癌常用預(yù)后因子的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)APN多表達(dá)于浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，與腫瘤組織類型相關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)關(guān)。Ranogajec等[6]曾研究表明乳腺癌APN的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)相關(guān)性，但淋巴結(jié)陽(yáng)性組APN在乳腺癌上的表達(dá)更強(qiáng)。有關(guān)肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，鱗癌組織APN的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有顯著相關(guān)性，而腺癌組織APN的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)相關(guān)性，作者分析其原因，可能由于腺癌組織APN主要表達(dá)于腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞，間質(zhì)表達(dá)缺乏，所以與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)相關(guān)性，而鱗癌組織APN主要表達(dá)于腫瘤間質(zhì)細(xì)胞，累及成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，更有利于腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，所以與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有顯著相關(guān)性。本研究顯示，乳腺癌APN主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)缺乏，可能提示本研究APN表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)關(guān)的機(jī)制。有關(guān)APN在乳腺癌上表達(dá)情況與淋巴結(jié)狀態(tài)及與乳腺癌其它預(yù)后因子的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。Ranogajec等[6]研究還發(fā)現(xiàn)乳腺癌APN的表達(dá)與總生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，類似的結(jié)果在其他腫瘤上也有發(fā)現(xiàn)，如胃癌、肺癌等[7-8]。提示APN可以作為惡性腫瘤的不良預(yù)后因素之一。

在金屬蛋白酶家族中，除了APN外，還有一種鋅離子依賴性金屬蛋白酶—基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPs)，MMPs與惡性腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。MMPs是一大類鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，在胚胎發(fā)育、血管生成、傷口愈合等生理過程中參與正常組織的重構(gòu)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要的角色。其中MMP-2和MMP-9，參與腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用[9]。MMP-2，又稱為明膠酶A、IV型膠原酶，主要降解IV型膠原蛋白、層粘連蛋白。MMP-9,又稱明膠酶 B，可以降解IV, V, XI, XVI型膠原蛋白、彈力蛋白。多項(xiàng)研究表明，MMP-2、MMP-9在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)[10-11]。

Terauchi M等[5]發(fā)現(xiàn)APN可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株分泌MMP-2。另有實(shí)驗(yàn)應(yīng)用APN抑制劑抑制APN活性后，可以通過抑制或者激活某些因子，影響MMP分子的表達(dá)情況，從而抑制MMP對(duì)基底膜的降解[12]。多項(xiàng)研究表明，APN與MMPs在促進(jìn)腫瘤的侵襲機(jī)制上有相同之處，即均可通過其蛋白水解酶的作用降解細(xì)胞外基質(zhì)，達(dá)到侵襲的目的。因此可以推測(cè)APN和MMPs在惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中可能起一定的協(xié)同作用。因而本研究比較了APN、 MMP-2、MMP-9三者在乳腺癌組織上的表達(dá)情況，觀察它們?cè)谌橄侔┲杏袩o(wú)相關(guān)性。結(jié)果顯示，MMP-2、MMP-9在乳腺癌上高表達(dá)，然而，未發(fā)現(xiàn)APN與MMP-2、MMP-9有明顯相關(guān)性。分析其原因，(1)可能是由于樣本量不足。(2)可能是由于APN與MMP-2、MMP-9在多種不同機(jī)制上參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。APN和TAL6(腫瘤相關(guān)抗原L6)組成一個(gè)復(fù)合體調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移能力和侵襲力，但這種能力并不依賴于APN的蛋白水解酶活性[1]；多種腫瘤細(xì)胞類型中，APN的表達(dá)及其蛋白水解酶活性與腫瘤細(xì)胞的侵襲力相關(guān)，然而，應(yīng)用不影響酶切活性的抗APN單克隆抗體作用肺癌細(xì)胞，引起APN的交聯(lián)，亦可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，即不影響酶切活性的單克隆抗體依然可以阻斷其侵襲力。研究表明，抑制APN活性能有效阻止腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)APN在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步深入研究也成為了本組以后研究的方向之一。

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基金項(xiàng)目:河北省科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目(13397701D)

作者簡(jiǎn)介:馮 麗(1986-)，女，河北易縣人，醫(yī)師。E-mail:fengye-215@163.com 通信作者:張 靜，教授。 E-mail：zhangjing166@126.com

doi:論著10.11724/jdmu.2016.03.03

[中圖分類號(hào)]R737.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

文章編號(hào)：1671-7295(2016)03-0219-05

(收稿日期:2016-01-11;修回日期:2016-05-24)

Aminopeptidase N expression and its correlation with MMP-2, MMP-9 in breast cancer

FENG Li, ZHAO Yu-zhe, CAO Wen-qing, ZHANG Jing

(TheFirstDepartmentofGeneralSurgery,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China)

[Abstract]Objective To investigate the significance of Aminopeptidase N (APN) expression in breast cancer, and to discuss the role of APN in the process of breast carcinoma invasion and metastasis by analyzing the relationships between APN and Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Methods Immunohistochemistry (SP method) was performed to detect the expressions of APN, MMP-2 and MMP-9 in 60 cases of breast cancer tissues, as well as APN expression in 20 cases of adjacent normal breast tissues. Results The positive frequency of APN expression in breast cancer tissues (36.7%, 22/60) was significantly higher than that in adjacent normal breast tissues (0%, 0/20) (χ2=10.115, P=0.001). APN expression was associated with tumor pathological types (P=0.035). However, there was no relationship between the APN expression and other clinicopathological features, such as menopausal state, clinical stage, tumor size, histological grade, nodal status, ER, PR, and Her-2 (P>0.05). There was no significant relationship between the APN expression and MMP-2, MMP-9 expression (P>0.05). Conclusion APN expression was higher in breast cancer than that in normal breast tissues, but it needs further study if APN expression could play a role in invasion and metastasis in breast cancer.

[Key words]aminopeptidase N/CD13; immunohistochemistry; breast cancer; matrix metalloproteinase-2; matrix metalloproteinase-9