謝閨娥， 杜晶春，徐　霞，董桂蘭

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東 廣州 510182；2.廣州大學(xué) 門診部，廣東 廣州 510006)

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扁蒴藤素對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長和凋亡的影響及機(jī)制研究

謝閨娥1， 杜晶春1，徐霞1，董桂蘭2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東 廣州 510182；2.廣州大學(xué) 門診部，廣東 廣州 510006)

[摘要]目的研究扁蒴藤素對乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長和凋亡的影響及其機(jī)制。 方法用MTT法檢測扁蒴藤素對MCF-7細(xì)胞細(xì)胞生長的影響；用Annexin V-FITC/PI雙染及TUNEL染色檢測扁蒴藤素對MCF-7凋亡的誘導(dǎo)作用；用western blot分析扁蒴藤素作用后，凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果扁蒴藤素對MCF-7細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用，對其作用48 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.59 μmol/L。1.0 μmol/L扁蒴藤素作用后,Annexin V-FITC/PI染色凋亡細(xì)胞比率(15.55±1.43)%，TUNEL陽性的MCF-7細(xì)胞比率為(35.59±4.43)%，較對照組(未經(jīng)扁朔藤素作用)[(1.45±0.24)%和(0.85±0.34)%]明顯升高，差異均有顯著性意義，P<0.05。Western blot結(jié)果顯示，扁蒴藤素能下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)。 結(jié)論扁蒴藤素素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而高效抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的生長。

[關(guān)鍵詞]扁蒴藤素；乳腺癌；MCF-7；凋亡

[引用本文]謝閨娥， 杜晶春，徐霞，等.扁蒴藤素對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長和凋亡的影響及機(jī)制研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,38(3)：215-218.

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈緩慢上升趨勢，在許多西方國家中，乳腺癌的發(fā)病率占女性癌腫的首位[1]?；熓侵委熑橄侔┑闹匾o助性手段，化療能夠明顯降低乳腺癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率，對晚期乳腺癌失去根治機(jī)會(huì)者采用化療也有明顯的緩解率。但是，多藥耐藥性的產(chǎn)生往往限制了常用化療藥物的使用[2]。

南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)，又名過山風(fēng)、黃藤、降龍草、金銀柳、窮攪藤、苦樹皮、七寸麻、過山龍、地南蛇、老牛筋等，是衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物。扁蒴藤素(Pristimerin)主要存在于南蛇藤的根皮中，研究表明其具有廣譜抗腫瘤[3-8]、抗炎[8]、抗氧化[9]及其它多種藥理活性。2008年扁蒴藤素被進(jìn)一步證實(shí)，可通過抑制蛋白酶體活性而發(fā)揮抗腫瘤作用，是新型的蛋白酶體抑制劑[10]。其對乳腺癌的作用及其機(jī)制尚未完全明確。本研究以最常用的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為模型，探討扁蒴藤素對MCF-7生長的影響及其可能的作用機(jī)制，以期為探索新的乳腺癌高效化療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1主要材料與試劑

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系購自ATCC，扁蒴藤素、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶 (PI)購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)為美國Hyclone公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品；MTT購自美國Genview公司； Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、DeadEndTM Fluorometric TUNEL試劑盒購自美國Roche公司;BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液購自美國Pierce公司；Bax和Bcl-2抗體購自美國Cell Signaling公司；鼠抗人GAPDH購自Sigma公司；HRP標(biāo)記抗鼠二抗和 HRP標(biāo)記抗兔二抗為Pierce公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7于含10%FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。傳代用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。

1.3MTT比色法

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL；每孔種200 μL細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，吸去舊培養(yǎng)液，加入含不同濃度扁蒴藤素(設(shè)7個(gè)不同濃度：0.1、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立對照組，正常培養(yǎng)基，每組均設(shè)3個(gè)平行孔培養(yǎng)；48 h，每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，培養(yǎng)4 h；小心吸棄培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO置搖床上低速振蕩10 min；酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測定其吸光度(OD)值，按下述公式計(jì)算生長抑制率：抑制率(%)=(1-OD加藥組/ OD對照組)×100%，并用Bliss's軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)值[11]。

1.4Annexin V-FITC/PI染色

取對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，實(shí)驗(yàn)組加入扁蒴藤素終濃度為1.0 μmol/L的培養(yǎng)基，對照組加入正常培養(yǎng)基， 培養(yǎng)8 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，1×binding buffer懸浮細(xì)胞至1×106個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；加入400 μL 1×binding buffer充分混合，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5TUNEL染色

將MCF-7細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，按每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞分別接種至已鋪有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜；實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為1.0 μmol/L的扁蒴藤素，對照組正常培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛，4 ℃固定細(xì)胞25 min； PBS洗滌3次，每次5 min；用0.2% Triton X-100處理5 min；PBS洗滌3次，每次5 min；盡量吸去多余液體，滴加100 μL平衡緩沖液覆蓋細(xì)胞，平衡5～10 min；配制rTdT反應(yīng)緩沖液(45 μL Equilibration Buffer+5 μL Nucleotide Mix+1 μL rTdT Enzyme)/每孔；吸棄平衡緩沖液，將50 μL rTdT反應(yīng)緩沖液滴加至細(xì)胞上，將24孔板放入濕盒中反應(yīng)，37 ℃孵育1 h，注意避光(以下步驟均需)；吸棄反應(yīng)液，加入2×SSC室溫作用15 min以終止反應(yīng)；室溫下，PBS洗滌3次，每次5 min；加入1 μg/mL PI 室溫下避光作用15 min；PBS洗滌3次，每次5 min；吸盡多余的水分，將蓋玻片上的細(xì)胞避光干燥過夜，次日加Anti-Fade封片；在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，TUNEL染色陽性熒光信號(hào)呈綠色，PI熒光信號(hào)呈紅色。

1.6Western blot實(shí)驗(yàn)

分別收集1.0 μmol/L的扁蒴藤素處理組和對照組MCF-7細(xì)胞，PBS洗滌后加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量后，western blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平。制備SDS-PAGE膠，電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉對PVDF膜進(jìn)行封閉后，一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再次洗滌后以ECL試劑盒發(fā)光、X線膠片感光顯影后觀察結(jié)果。GAPDH為內(nèi)參照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1扁蒴藤素對MCF-7細(xì)胞生長的影響

MTT比色結(jié)果表明，扁蒴藤素對MCF-7細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用，當(dāng)藥物濃度為1.0 μmol/L時(shí)，對MCF-7細(xì)胞的生長抑制率為73.88%，48 h的IC50為0.59 μmol/L。見圖1。

圖1　扁蒴藤素對MCF-7細(xì)胞生長抑制曲線Fig 1 Dose-response curve of pristimerin on the growth of MCF-7 cells

2.2扁蒴藤素對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞經(jīng)扁蒴藤素作用8 h后，凋亡細(xì)胞比率(15.55±1.43)%較對照組(1.45±0.24)%明顯升高，差異有顯著性意義,P<0.05。見圖2。

TUNEL結(jié)果顯示，未經(jīng)扁蒴藤素作用的對照組幾乎未見TUNEL染色陽性細(xì)胞；經(jīng)扁蒴藤素作用24 h后，TUNEL染色陽性細(xì)胞率(35.59±4.43)%較對照組(0.85±0.34)%明顯增加，差異有顯著性意義，P<0.05。見圖3。

2.3扁蒴藤素對細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的調(diào)節(jié)

Werstern blot分析表明，扁蒴藤素能夠下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)。見圖 4。

圖2　Annexin V-FITC/PI染色檢測扁蒴藤素對MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用Fig 2 Annexin V-FITC/PI staining of MCF-7 cells treated with pristimerinA: Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞分析圖； B: 凋亡細(xì)胞比率統(tǒng)計(jì)圖。 *與對照組比較，P<0.05

圖3　TUNEL染色檢測扁蒴藤素對MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

圖4　扁蒴藤素對MCF-7細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白的影響Fig 4 Effect of pristimerin on the expression of Bcl-2 and Bax in MCF-7 cells

3討論

作為發(fā)病率占女性癌腫首位的惡性腫瘤，乳腺癌嚴(yán)重威脅著女性的健康。臨床上使用化療藥物進(jìn)行治療時(shí)，腫瘤對化療藥物的耐藥性嚴(yán)重影響了治療效果[2]。

作為藥用南蛇藤的重要活性成分，扁蒴藤素能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[3-8]。而本實(shí)驗(yàn)研究了扁蒴藤素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長和凋亡的影響，結(jié)果表明扁蒴藤素對MCF-7細(xì)胞的生長也具有很強(qiáng)的抑制作用。經(jīng)扁蒴藤素作用后，Annexin V-FITC染色和TUNEL染色陽性的MCF-7細(xì)胞比例均增高，表明扁蒴藤素能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

為進(jìn)一步探討扁蒴藤素對腫瘤細(xì)胞可能的作用機(jī)制，對細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)行了檢測。Werstern blot顯示，扁蒴藤素顯著減少了Bcl-2的表達(dá)，增加Bax的表達(dá)。Bcl-2、Bax都定位于線粒體膜上，Bcl-2基因家族與線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用密切相關(guān)[12]；Bax是參與細(xì)胞凋亡的一個(gè)成員，可以直接促使細(xì)胞色素C在外膜未被破壞的情況下通過某種通道釋放至胞漿，同時(shí)激發(fā)PT通道的開放，降低線粒體膜電位[13]。而Bcl-2蛋白則通過穩(wěn)定線粒體膜電位，阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。此外，Bcl-2的過度表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱甘肽的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性。因此，扁蒴藤素對抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)和對促凋亡蛋白Bax的上調(diào)作用可以部分解釋扁蒴藤素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

扁蒴藤素能夠下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax的表達(dá)，從而激活細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑，最終高效抑制MCF-7的生長。本研究擴(kuò)充了對扁蒴藤素抗乳腺癌作用及其機(jī)制的新認(rèn)識(shí)，也將為新的抗乳腺癌化療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81101682)；廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014A020212015)

作者簡介:謝閨娥(1981-)，女，湖南邵陽人，講師。E-mail：guier2003@126.com 通信作者:徐 霞，教授。E-mail：xux2014@126.com

doi:論著10.11724/jdmu.2016.03.02

[中圖分類號(hào)]R737.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

文章編號(hào)：1671-7295(2016)03-0215-04

(收稿日期:2016-01-13;修回日期:2016-05-20)

Effect of pristimerin on the growth and apoptosis of MCF-7 breast cancer cells and the mechanism

XIE Gui-e1, DU Jing-chun1, XU Xia1, DONG Gui-lan2

(1.KingMedSchoolofLaboratoryMedicine,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China；2.OutpatientDepartment,GuangzhouUniversity,Guangzhou510006,China)

[Abstract]Objective To investigate the effect of pristimerin on the growth and apoptosis of MCF-7 breast cancer cells and to explore the underlying mechanism. Methods The effect of pristimerin on the growth and of apoptosis MCF-7 cells were analyzed by MTT assay and Annexin V-FITC/PI staining, TUNEL staining, respectively. The expression of Bcl-2 and Bax was determined by western blotting analysis. Results Pristimerin exhibited a marked inhibition on the survival of MCF-7 cells, and the half maximal inhibitory concentration (IC50) value was 0.59 μmol/L. The numbers of apoptotic MCF-7 cells, as revealed by Annexin V binding and TUNEL assay, increased upon pristimerin treatment. Pristimerin treatment resulted in a decrease of Bcl-2 and an increase of Bax expression. Conclusion Our results demonstrated that pristimerin suppressed the proliferation of MCF-7 cells, and that these effects occurred through increasing apoptosis by regulation of apoptotic effectors.

[Key words]pristimerin; breast cancer; MCF-7; apoptosis