胡仁峻，涂黎晴，孫凌霜，賈　坤，遠(yuǎn)立國，李守軍*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

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Let-7a對(duì)犬流感病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)控作用的初步研究

胡仁峻1，2，涂黎晴1，2，孫凌霜1，2，賈坤1，2，遠(yuǎn)立國1，2，李守軍1，2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

犬流感(CI)是由犬流感病毒(CIV)感染犬引起的傳染性疾病，感染犬主要表現(xiàn)為急性呼吸道癥狀。為了探究犬microRNA let-7a對(duì)CIV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，在體外用CIV對(duì)MDCK細(xì)胞進(jìn)行感染，通過AO/EB染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)是否能引起細(xì)胞凋亡，并用熒光定量PCR測(cè)定let-7a的轉(zhuǎn)錄水平，最后通過轉(zhuǎn)染let-7a來評(píng)價(jià)其對(duì)于細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，CIV能夠引起MDCK細(xì)胞發(fā)生凋亡且被感染細(xì)胞內(nèi)let-7a轉(zhuǎn)錄下調(diào)，而過轉(zhuǎn)錄細(xì)胞內(nèi)let-7a則能夠有效地抑制病毒誘導(dǎo)的凋亡。研究結(jié)果顯示，犬let-7a在CIV感染細(xì)胞中起著抗凋亡作用，而let-7a的低轉(zhuǎn)錄促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，并且這一機(jī)制可能在CIV感染犬的呼吸道損傷中扮演了一定的角色。

let-7a；H3N2；犬流感；MDCK；細(xì)胞凋亡

犬流感(canine influenza，CI)是由犬流感病毒(CIV)引起的，CIV屬于正黏病毒科、甲型流感病毒屬，包括H3N8和H3N2亞型[1-2]。2006年，本實(shí)驗(yàn)室在中國華南地區(qū)分離得到第一株禽源性H3N2亞型CIV[3]。CIV能夠引起犬的體溫升高、咳嗽、流鼻涕、打噴嚏、呼吸困難、精神沉郁、厭食等癥狀[4]。據(jù)報(bào)道犬多有偶發(fā)感染其他亞型流感病毒的情況[5-6]，作為伴侶動(dòng)物，犬?dāng)y帶CIV對(duì)人類和其他動(dòng)物造成潛在的威脅，所以犬流感的流行研究和機(jī)制研究對(duì)于其預(yù)防和治療具有很重要意義。microRNA是一類大小為20～22個(gè)核苷酸(nt)的RNA分子，它來源于基因編碼區(qū)的內(nèi)含子[7]。它是由大小約為70 nt的發(fā)卡狀前體剪切得來，并對(duì)基因在轉(zhuǎn)錄后水平起調(diào)節(jié)作用[8]。CIV感染犬后，會(huì)導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)損傷，而在基因?qū)用嫔?，?huì)導(dǎo)致犬肺和氣管細(xì)胞內(nèi)一系列microRNA和炎癥及凋亡基因表達(dá)的變化[9-11]。Let-7a作為犬肺和氣管內(nèi)表達(dá)豐度第二高的家族，其對(duì)細(xì)胞免疫或凋亡起著重要作用[9]。

目前對(duì)于CIV的研究，主要集中在流行病學(xué)調(diào)查、病毒基因測(cè)序、動(dòng)物感染性或傳播性試驗(yàn)，更深入的研究主要是在轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方面。作者用CIV在體外感染MDCK細(xì)胞，測(cè)定其能否引起細(xì)胞凋亡，后通過轉(zhuǎn)染microRNA，測(cè)定microRNA對(duì)于細(xì)胞凋亡的影響，從而了解microRNA在生物體內(nèi)可能扮演的角色。

1　材料與方法

1.1病毒和細(xì)胞

病毒株H3N2亞型犬流感(A/canine/Guangdong/1/2006(H3N2))和犬腎細(xì)胞(MDCK)均由本實(shí)驗(yàn)室(廣東省獸醫(yī)臨床重大疫病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)保存。

1.2主要試劑和儀器

AO/EB細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物；FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國貝克曼(Beckman)公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購自日本TaKaRa公司；熒光定量PCR Mix購自瑞士羅氏(Roche)公司；microRNA反轉(zhuǎn)錄引物、PCR引物及microRNA擬似物和抑制物合成自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；DNA酶和轉(zhuǎn)染試劑Lip2000購自美國英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen)。流式細(xì)胞儀購自美國Beakman公司；熒光定量PCR儀購自瑞士羅氏(Roche)公司。

1.3microRNA擬似物和抑制物序列

Let-7a，正義鏈，5′-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3′，反義鏈，5′-AGCUGUACGCCG-CCCAUUUGG-3′；陰性對(duì)照，正義鏈，5′-GAAAG-CCAAACGAGGGCAGGCG-3′，反義鏈，5′-CCUG-CCCUCGUUUGGCUUUCCG-3′；抑制劑，5′-AA-CUAUACAACCUACUACCUCA-3′；抑制劑陰性對(duì)照，5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.4病毒培養(yǎng)及病毒細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)測(cè)定

將病毒接種到9到11日齡的雞胚尿囊腔，37 ℃培養(yǎng)48 h，然后將雞胚置于4 ℃環(huán)境過夜，次日以無菌操作收獲尿囊液，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。測(cè)定TCID50，將病毒樣按10-1到10-8進(jìn)行倍比稀釋，后接種到鋪滿單層細(xì)胞的96孔板中。每個(gè)稀釋度接種8孔，設(shè)2列正常細(xì)胞對(duì)照。置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變(CPE)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50值。

1.5病毒感染MDCK細(xì)胞

將3×105個(gè)MDCK細(xì)胞接種到12孔板中，等到細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，將100TCID50CIV和1 μg·mL-1TPCK胰酶接種到細(xì)胞上。于感染后24和48 h檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)

1.6.1AO/EB法檢測(cè)細(xì)胞凋亡感染病毒的細(xì)胞按AO/EB細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作方法收集并處理之后，在熒光倒置顯微鏡下觀察，綠色細(xì)胞為正常細(xì)胞，橙紅色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。計(jì)數(shù)200個(gè)以上細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。

1.6.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡感染病毒的細(xì)胞按Annexin-V FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作方法收集并處理后，在流式細(xì)胞儀(Beckman)上測(cè)定，最終結(jié)果用CXP軟件(Beckman)進(jìn)行分析。

1.7熒光定量PCR測(cè)定let-7a轉(zhuǎn)錄及其轉(zhuǎn)染條件

分別在病毒感染細(xì)胞后24和48 h，收集全部細(xì)胞，并用TRIzol抽提總RNA，之后用DNA酶處理。通過分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，并通過RNA電泳檢測(cè)其質(zhì)量。然后取1 μg RNA，在20 μL的體系里用microRNA特異性的頸環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，小分子RNA U6作為內(nèi)參。熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL，PCR mix 10 μL，模板1 μL，上下引物各0.5 μL，其余用DEPC水補(bǔ)足。條件設(shè)置：預(yù)變性95 ℃ 5 min，擴(kuò)增，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)，設(shè)置溶解曲線。結(jié)果計(jì)算用2-ΔΔCT法。測(cè)定let-7a轉(zhuǎn)染條件，待12孔板里的MDCK細(xì)胞鋪滿單層后，用Lip2000轉(zhuǎn)染相同濃度(50 μmol·L-1)和不同濃度(25～200 μmol·L-1)let-7a mimic，轉(zhuǎn)染相同濃度microRNA的細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(12～48 h)收集，轉(zhuǎn)染不同濃度microRNA的細(xì)胞在相同時(shí)間收集(24 h)。總RNA提取及PCR反應(yīng)按上述過程進(jìn)行。

1.8流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染microRNA后MDCK細(xì)胞的凋亡情況

根據(jù)最佳轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染microRNA mimic(擬似物)及其inhibitor(抑制劑)，并設(shè)置不同的組別。在轉(zhuǎn)染后24 h，接種100TCID50病毒量和1 μg·mL-1TPCK胰酶，接種病毒48 h后，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡率。

1.9數(shù)據(jù)分析

2　結(jié)　果

2.1犬流感病毒感染MDCK細(xì)胞后引起細(xì)胞凋亡

測(cè)得本試驗(yàn)所用毒株效價(jià)為103.83TCID50·0.1 mL-1，以100TCID50病毒量接種細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的病變，包括細(xì)胞聚集、脫壁漂浮、細(xì)胞皺縮、破裂等現(xiàn)象(圖1)。

圖1　CIV感染MDCK細(xì)胞后，引起了明顯的細(xì)胞病變(100×)Fig.1　Obviously cytopathic changes are observed after CIV infection(100×)

AO/EB染色結(jié)果可見在流感病毒處理后24和48 h，細(xì)胞都發(fā)生了顯著的凋亡。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，測(cè)得感染后24和48 h，凋亡率分別為(20.7±1.6)%和(22.3±2.2)%，顯著高于對(duì)照組的(8.1±1.1)%和(8.9±1.7)%(圖2)。

圖2　AO/EB染色檢測(cè)感染病毒后細(xì)胞的凋亡率(100×)Fig.2　AO/EB staining was used to detect the apoptosis rate of the cells infected with CIV(100×)

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果顯示感染后24 和48 h，凋亡率分別達(dá)到(15.53±0.49)%和(15.87±0.58)%，顯著高于對(duì)照組的(4.13±0.24)%和(7.20±0.38)%(圖3)。

圖3　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染病毒后細(xì)胞的凋亡率Fig.3　The apoptosis rate of infected cells was detected by flow cytometry

2.2病毒感染細(xì)胞后let-7a轉(zhuǎn)錄及其轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

AO/EB染色和流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明CIV能夠誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過熒光定量PCR測(cè)得，在細(xì)胞凋亡發(fā)生的同時(shí)，犬let-7a的轉(zhuǎn)錄是顯著下調(diào)的。與對(duì)照組相比，病毒感染后24和48 h，let-7a轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)到(39.37±2.46)%和(26.90±7.58)%(圖4)，具體擴(kuò)增曲線和熔解曲線如圖5所示。為了進(jìn)一步探究let-7a對(duì)MDCK細(xì)胞凋亡的影響，作者轉(zhuǎn)染let-7a進(jìn)細(xì)胞，并對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明50 μmol·L-1let-7a mimic轉(zhuǎn)染24 h的let-7a轉(zhuǎn)錄水平最高(圖6)。

2.3let-7a對(duì)CIV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生明顯的抑制作用

為了探究let-7a在凋亡過程中所起的作用，作者轉(zhuǎn)染let-7a擬似物或抑制劑進(jìn)MDCK細(xì)胞，測(cè)定擬似物或抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。如圖7各組順序，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得各轉(zhuǎn)染組凋亡結(jié)果為(8.83±0.55)%、(24.90±1.39)%、(24.17±0.74)%、(22.83±0.73)%、(43.33±1.76)%、(13.07±0.75)%、(28.93±0.95)%和(18.87±1.36)%。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算得出，與對(duì)照組相比，MDCK細(xì)胞感染CIV以后凋亡率極顯著增加(P<0.01)，而脂質(zhì)體Lip2000對(duì)細(xì)胞凋亡影響不大(P>0.05)。與scrambled mimic組相比，let-7a過轉(zhuǎn)錄組凋亡率極顯著降低(P<0.01)，而let-7a低轉(zhuǎn)錄組的凋亡率則極顯著上升(P<0.01)。轉(zhuǎn)染let-7a mimic的同時(shí)轉(zhuǎn)染inhibitor能使得凋亡率極顯著上升(P<0.01)，而scrambled inhibitor盡管也使得凋亡率上升(P=0.02)，但其對(duì)于細(xì)胞凋亡的影響不如let-7a inhibitor。

圖4　感染CIV后，細(xì)胞內(nèi)let-7a轉(zhuǎn)錄變化Fig.4　Let-7a transcription changes of MDCK cells after CIV infection

圖5　let-7a和U6的擴(kuò)增曲線及熔解曲線Fig.5　Amplification and dissolution curve of let-7a and U6

圖6　let-7a轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化Fig.6　Optimization of transfection conditions of let-7a

圖7　let-7a或抑制劑對(duì)CIV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響Fig.7　Effect of let-7a or inhibitor on apoptosis of MDCK cells induced by CIV

3　討　論

2003年美國報(bào)道了H3N8亞型犬流感的出現(xiàn)，隨后中國和韓國相繼在2006年和2007年發(fā)現(xiàn)了H3N2亞型CIV。一直以來美國均未曾有過H3N2亞型CIV的報(bào)道，然而近年美國卻報(bào)道了犬感染H3N2亞型CIV。因?yàn)镃IV流行區(qū)域的擴(kuò)大并且具有和其他流感病毒重組的可能性，所以它對(duì)犬和人類都有一定潛在的威脅[12-13]。因此闡明CIV感染犬的內(nèi)在分子機(jī)制，對(duì)于其預(yù)防和治療都具有重要的意義。很多研究表明流感病毒感染細(xì)胞，都有凋亡現(xiàn)象的發(fā)生[14-16]，雖未經(jīng)證實(shí)，但不難推測(cè)H3N2亞型CIV也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究證實(shí)H3N2亞型CIV感染MDCK細(xì)胞后，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生了凋亡，這與蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)所得出的結(jié)論，即凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)和基因的廣泛表達(dá)的結(jié)果相吻合[9-11]。凋亡作為機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制，其意義在于能夠有效地限制病毒復(fù)制。本研究從側(cè)面為CIV誘導(dǎo)的呼吸道損傷提供了理論依據(jù)，即CIV感染呼吸道上皮細(xì)胞后，機(jī)體細(xì)胞為了限制病毒復(fù)制，受凋亡信號(hào)刺激，激活凋亡通路，執(zhí)行凋亡過程，從而使得病毒復(fù)制受阻，挽救整個(gè)器官。本研究也是對(duì)流感病毒誘導(dǎo)凋亡研究的一個(gè)補(bǔ)充，某種程度上為流感病毒的基礎(chǔ)研究、防治提供進(jìn)一步的理論支持。

microRNA具有非常廣泛和強(qiáng)大的功能，其在生物體內(nèi)的功能不容忽視[17]。作者還初步探究了let-7a對(duì)于CIV誘導(dǎo)凋亡的影響，結(jié)果表明，let-7a為一個(gè)抗凋亡因子，細(xì)胞內(nèi)的某些凋亡蛋白可能是其靶點(diǎn)[18-19]。CIV感染的細(xì)胞下調(diào)了let-7a的轉(zhuǎn)錄，可能是為了利于凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而有助于凋亡的發(fā)生。作者所闡述的關(guān)于let-7a在凋亡機(jī)制中所扮演的角色，在小分子RNA方面為抗病毒復(fù)制提供了新的思路。結(jié)果可為microRNA與流感病毒的進(jìn)一步研究從量上提供一定的參考。未來通過控制細(xì)胞凋亡來對(duì)付流感病毒，具有理論上的可行性，但其實(shí)際應(yīng)用還有待對(duì)凋亡的機(jī)制作更深入的研究和臨床試驗(yàn)。

4　結(jié)　論

犬let-7a在CIV感染細(xì)胞中起著抗凋亡作用，而let-7a的低轉(zhuǎn)錄促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，并且這一機(jī)制可能在CIV感染犬的呼吸道損傷中扮演了一定的角色。

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(編輯白永平)

Study on Regulation Function of Let-7a on Canine Influenza Virus Induced Cells Apoptosis

HU Ren-jun1，2，TU Li-qing1，2，SUN Ling-shuang1，2，JIA Kun1，2，YUAN Li-guo1，2，LI Shou-jun1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China；2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofPreventionandControlforSevereClinicalAnimalDiseases，Guangzhou510642，China)

Canine influenza (CI) is an infectious disease caused by canine influenza virus (CIV) infection，which is mainly manifested as acute respiratory symptoms.In order to explore the effect of let-7a on CIV induced cells apoptosis，MDCK cells were infected by CIVinvitro，and AO/EB staining and flow cytometry were used to detect cells apoptosis，and the transcription of let-7a was also determined by real time PCR，and the effect of let-7a on cell apoptosis was evaluated by the transfection of let-7a.The results showed that CIV could induce apoptosis of MDCK cells and downregulate the transcription of let-7a in infected cells，and over-transcription of let-7a could effectively inhibit the virus induced apoptosis.This study showe that let-7a plays an anti-apoptotic role in CIV infected cells，and the low transcription of let-7a promotes apoptosis，and this mechanism may play a role in the respiratory tract injury of CIV infected dogs.

let-7a；H3N2；canine influenza；MDCK；cells apoptosis

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.021

2015-11-25

國家自然科學(xué)基金(31372448)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303042)；廣東省自然科學(xué)基金(S2013020013858)；廣東省促進(jìn)科技服務(wù)業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013B040200032)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020202001；2013B020224001)；廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2013A061401013)

胡仁峻(1990-)，男，江蘇鹽城人，碩士生，主要從事犬流感感染與microRNA相關(guān)研究，E-mail：1149243709@qq.com

李守軍，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事犬流感及其流行病學(xué)相關(guān)研究，E-mail：shoujunli@scau.edu.cn

S855.3

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0366-6964(2016)06-1247-06