宋　爽，曾　磊，魯紹芳，郭珍珍，魯維飛，韓立強(qiáng)，王　江，王月影，褚貝貝，楊國宇

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實驗室，鄭州 450002)

?

豬TRIM11基因克隆及其促進(jìn)豬偽狂犬病毒在體外增殖的研究

宋爽，曾磊，魯紹芳，郭珍珍，魯維飛，韓立強(qiáng)，王江，王月影，褚貝貝*，楊國宇*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實驗室，鄭州 450002)

為初步研究豬TRIM11的免疫學(xué)功能，以豬頜下淋巴結(jié)cDNA為模板擴(kuò)增TRIM11 基因cDNA并對該基因進(jìn)行了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測和組織表達(dá)譜分析，將該基因與PiggyBac載體相連獲得真核表達(dá)載體PB-TRIM11，之后轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。用豬偽狂犬病毒(PRV)刺激過表達(dá)TRIM11 PK15細(xì)胞和對照組細(xì)胞后，于不同時間收獲細(xì)胞上清，比較兩組細(xì)胞上清中病毒滴度變化。結(jié)果表明，豬TRIM11的ORF長度為1 407 bp，編碼468個氨基酸，該氨基酸序列含有3個TRIM家族保守的結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)譜分析顯示，豬TRIM11在脂肪組織、肺的表達(dá)量較高，而在心、回腸、十二指腸、直腸中的轉(zhuǎn)錄量較低。成功克隆了豬TRIM11 cDNA序列并構(gòu)建了真核轉(zhuǎn)錄載體PB-TRIM11，qRT-PCR檢測結(jié)果表明TRIM11在PK15細(xì)胞系中成功表達(dá)。檢測感染PRV后過表達(dá)TRIM11 PK15細(xì)胞和對照組細(xì)胞上清液病毒的TCID50發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIM11組的病毒滴度始終高于對照組。過表達(dá)TRIM11有一定的促進(jìn)PRV增殖的作用，為進(jìn)一步研究豬TRIM11在天然免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。

三基序結(jié)合蛋白；豬偽狂犬病毒；病毒增殖；穩(wěn)定細(xì)胞系

三基序結(jié)合蛋白(TRIM)家族在人上已發(fā)現(xiàn)超過70個家族成員。所有的TRIM蛋白都含有一個由鋅指結(jié)構(gòu)、1或2個B-box、1個卷曲螺旋(RBCC)組成的N端三結(jié)構(gòu)域[1]。TRIM蛋白功能多種多樣，除了參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞凋亡，也在免疫相關(guān)信號通路和抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2]。TRIM11(含有468個氨基酸殘基)是一種典型的RBCC蛋白且形成寡聚物，在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中都存在[3]。近年來有研究表明，TRIM11可以與TBK1含有接頭蛋白的復(fù)合體結(jié)合，抑制RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的信號通路，降低Ⅰ型皰疹病毒感染中IFN的產(chǎn)生量，負(fù)調(diào)控抗病毒免疫反應(yīng)[4]。

豬偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)也稱為奧葉基氏病毒或豬Ⅰ型皰疹病毒，是皰疹病毒科中皰疹病毒甲亞科的一員，其基因組是一個雙鏈線性DNA分子[5]。主要感染豬和其他家畜，在偶然情況下也會感染野生動物[6]。猜測豬TRIM11基因在病毒感染細(xì)胞過程中也可能起到負(fù)調(diào)控抗病毒免疫反應(yīng)作用。作者選擇豬的TRIM11基因作為研究對象，對其進(jìn)行克隆，并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PB-TRIM11，之后轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)豬TRIM11基因的PK15細(xì)胞系。通過PRV感染過表達(dá)細(xì)胞系，對TRIM11基因?qū)RV增殖的作用進(jìn)行了初步研究。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和病毒

豬偽狂犬病毒(PRV strain Bartha K16)，豬腎傳代細(xì)胞PK15細(xì)胞，非洲綠猴腎細(xì)胞Vero細(xì)胞均由本實驗室保存。

1.2主要試劑

豬頜下淋巴結(jié)、睪丸、肺等組織提取RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，大腸桿菌(Escherichiacoil)感受態(tài)Top10由本實驗室保存；氨芐青霉素、嘌呤霉素為美國Sigma公司產(chǎn)品；ExTaq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、DL2000為TaKaRa公司產(chǎn)品；Q5?熱啟動超保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NheⅠ、SwaⅠ、T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；質(zhì)粒中提試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑Turbofect為Thermo公司產(chǎn)品。

1.3引物設(shè)計

參照GenBank中的豬源TRIM11(序列號：GACC01000116.1)基因序列，設(shè)計了包含NheⅠ和SwaⅠ酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物，以及用于Q-PCR定量的特異引物。引物均由生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1擴(kuò)增TRIM11和參照基因引物

Table 1The primers used to amplifyTRIM11 and reference gene

1.4豬TRIM11基因序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析

用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預(yù)測豬TRIM11的CDS序列，豬TRIM11分子大小和等電點(diǎn)用DNAStar進(jìn)行計算，二級結(jié)構(gòu)域模式分析用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de)。構(gòu)建豬TRIM11的系統(tǒng)進(jìn)化樹。首先從NCBI數(shù)據(jù)庫上下載不同物種間TRIM11蛋白序列，然后在MEGA 6 software中構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，計算方法為NJ法。NJ法系統(tǒng)進(jìn)化樹的穩(wěn)健性使用自展內(nèi)部分枝法(Bootstrapping)評定，Bootstrap Replication為1 000。

1.5豬TRIM11基因的克隆與PB-TRIM11表達(dá)載體構(gòu)建

利用PCR技術(shù)，以實驗室保存的豬頜下淋巴結(jié)組織提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，擴(kuò)增得到豬TRIM11基因的cDNA序列。產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收大小為1 432 bp左右條帶，并進(jìn)行純化。用NheⅠ和SwaⅠ分別雙酶切載體PiggyBac和純化得到的目的片段，連接過夜后轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于預(yù)先加入Amp的LB瓊脂平板，37 ℃過夜。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，采用菌液PCR，瓊脂糖凝膠電泳篩選陽性克隆，命名為PB-TRIM11，送生物工程(上海)股份有限公司測序。將鑒定正確的質(zhì)粒按中提試劑盒說明書進(jìn)行提取，-20 ℃保存，備用。

1.6PB-TRIM11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞

將處于對數(shù)生長期的PK15細(xì)胞接種于6孔板中，達(dá)到80%融合度時，利用Turbofect進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后以PiggyBac系統(tǒng)自帶的GFP為依據(jù)，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。更換含有4 μg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，加壓篩選4周后，熒光顯微鏡下可見有綠色熒光且抗嘌呤霉素的陽性細(xì)胞克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)即可得到穩(wěn)定表達(dá)豬TRIM11的PK15細(xì)胞系。

1.7熒光定量PCR法檢測TRIM11 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TRIM11基因和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PiggyBac空載體的PK15細(xì)胞，以7.5×105·孔-1分別接種于6孔板中，每組在6孔板中做3個復(fù)孔，6 h后收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，熒光定量PCR法檢測TRIM11 mRNA表達(dá)水平。兩組之間比較采用independent-sampleTtest (P<0.05)。

1.8TRIM11對PRV增殖的影響

1.8.1豬偽狂犬病毒(PRV strain Bartha K16)的培養(yǎng)及預(yù)處理將實驗室保存的一支PRV懸液接種于長滿單層PK15細(xì)胞的25 cm2細(xì)胞瓶內(nèi)，于37 ℃孵育1 h后，每瓶加8 mL含2%胎牛血清的DMEM維持液，培養(yǎng)至24 h細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時收獲培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，1 500 r·min-1離心15 min，收集病毒上清液，置-80 ℃?zhèn)溆?。?6孔微量培養(yǎng)板，每孔接種1×104個PK15細(xì)胞，待細(xì)胞長成單層后，取100 μL制得的病毒懸液，用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行10倍稀釋(10-1～10-10)，同時設(shè)立陰性對照，接種96孔微量培養(yǎng)板，測定所制病毒懸液的TCID50。TCID50計算按Reed-Muench法進(jìn)行。

1.8.2過表達(dá)豬TRIM11對PRV增殖的影響將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TRIM11基因和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PiggyBac空載體的PK15細(xì)胞，以7.5×105·孔-1分別接種于6孔板中，每組做3個復(fù)孔，待細(xì)胞長至單層后接種0.1 MOI PRV，37 ℃孵育1 h后用PBS漂洗細(xì)胞去除未吸附的病毒，每孔加入2 mL含2%胎牛血清的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)。于病毒感染12、24、36 h后觀察細(xì)胞病變并收集細(xì)胞上清液測定TCID50。取96孔微量培養(yǎng)板，每孔接種1×104個Vero細(xì)胞，待細(xì)胞長成單層后，取100 μL待測細(xì)胞上清液，用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行10倍稀釋(10-1～10-10)，同時設(shè)立陰性對照，接種96孔微量培養(yǎng)板，測定TCID50。TCID50計算按Reed-Muench法進(jìn)行。兩組之間比較采用independent sampleTtest(P<0.05)。

2　結(jié)　果

2.1豬TRIM11基因的序列分析及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)域模式

首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索預(yù)測的豬TRIM11基因的CDS序列(序列號為：GACC01000116.1)。豬TRIM11的CDS區(qū)長1 407 bp，編碼468個氨基酸(圖1)，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為53 ku，等電點(diǎn)為5.409。TRIM家族的顯著特點(diǎn)是具有3個結(jié)構(gòu)域(tripartite motif)[7]，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)域模式分析顯示TRIM11蛋白含有3個TRIM家族保守的結(jié)構(gòu)域，這三個結(jié)構(gòu)域從N端到C端的順序依次是RING結(jié)構(gòu)、2個B-box結(jié)構(gòu)域、一個卷曲結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain)，此外該蛋白C端結(jié)構(gòu)域為PRY結(jié)構(gòu)域和SPRY結(jié)構(gòu)域。PRY和SPRY結(jié)構(gòu)域組成了B30.2結(jié)構(gòu)域[8](圖2)。

2.2豬TRIM11序列相似性和在不同物種間的系統(tǒng)進(jìn)化

在TRIM11序列系統(tǒng)進(jìn)化樹上，豬和牛、虎鯨、山羊先聚在一起，然后又與太平洋海象聚成一支，與人和褐家鼠最后也聚成了一支。結(jié)果顯示，豬和牛、虎鯨、山羊的親緣關(guān)系很近，其相似性高達(dá)98%、99%、98%，人和豬的相似性為72%(圖3)。

2.3熒光定量PCR分析豬TRIM11基因的組織特異性

為了分析豬TRIM11基因mRNA在不同組織中的轉(zhuǎn)錄及分布情況，本研究使用了豬的15個組織提取的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，采用熒光定量PCR的方法進(jìn)行了分析，以GAPDH為內(nèi)參，采用與心組織的比值作為目的基因的相對轉(zhuǎn)錄水平，豬TRIM11基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄和分布明顯不同，在肺、脂肪組織中的轉(zhuǎn)錄量較高，而在心、十二指腸、回腸、直腸中的轉(zhuǎn)錄量較低(圖4)。

劃線處為起始密碼子，邊框處為終止密碼子，陰影部分從起始密碼子到終止密碼子依次為預(yù)測的RING、BBOX、Coiled-Coil domain、PRY結(jié)構(gòu)域和SPY結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域起止用三角符號標(biāo)注The start codon is underlined and the stop codon is boxed.The shaded parts represent the predicted RING domain，two B-box motifs，coiled-coil region，PRV domain，SPRY domain.Use a small triangle to sign the starting point or the ending point of the predicted domain/motif/region圖1　豬TRIM11基因的CDS序列和氨基酸序列Fig.1　The CDS sequence and Amino Acid Sequence of porcine TRIM11

圖2　豬TRIM11蛋白二級結(jié)構(gòu)域模式Fig.2　Schematic model of porcine TRIM11

用MEGA 6軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，不同物種TRIM11蛋白序列從GenBank中獲得，序列號為：JAA53691(Sus scrofa)，XP_004420550.1(Ceratotherium simum simum)，XP_011370226.1 (Pteropus vampyrus)，XP_004780674.1 (Mustela putorius furo)，XP_848259.1(Canis lupus familiaris)，XP_004407123.1(Odobenus rosmarus divergens)，XP_004284071.1(Orcinus orca)，XP_007986332.1 (Chlorocebus sabaeus)，XP_006534642.1 (Mus musculus)，XP_003980669.1(Felis catus)，NP_001071388.1 (Bos taurus)，XP_011542587.1 (Homo sapiens)，XP_013820385.1 (Capra hircus)，XP_006246567.1 (Rattus norvegicus)，XP_006147045.1 (Tupaia chinensis)，XP_008250757.1 (Oryctolagus cuniculus)，XP_010599060.1 (Loxodonta africana)The MEGA 6 software was used to construct the phylogenetic tree with the neighbor-joining method.The protein sequences of TRIM11 from different species were taken from GenBank，under accession numbers：XP_004420550.1 (Ceratotherium simum simum)，XP_011370226.1 (Pteropus vampyrus)，XP_004780674.1 (Mustela putorius furo)，XP_848259.1(Canis lupus familiaris)，XP_004407123.1(Odobenus rosmarus divergens)，XP_004284071.1 (Orcinus orca)，XP_007986332.1 (Chlorocebus sabaeus)，XP_006534642.1 (Mus musculus)，XP_003980669.1 (Felis catus)，NP_001071388.1 (Bos taurus)，XP_011542587.1 (Homo sapiens)，XP_013820385.1 (Capra hircus)，XP_006246567.1 (Rattus norvegicus)，XP_006147045.1 (Tupaia chinensis)，XP_008250757.1 (Oryctolagus cuniculus)，XP_010599060.1 (Loxodonta africana)圖3　不同物種間TRIM11蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3　Phylogenetic tree of the TRIM11 proteins from different species

圖4　豬TRIM11 mRNA在不同組織中的相對轉(zhuǎn)錄量Fig.4　Relative porcine TRIM11 mRNA transcription in different tissues

2.4豬TRIM11基因的克隆及PB-TRIM11重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用降落PCR技術(shù)，擴(kuò)增TRIM11基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得單一目的條帶，目的片段大小與預(yù)期的TRIM11基因(1 432 bp)一致(圖5)。將經(jīng)NheⅠ和SwaⅠ雙酶切的載體PiggyBac和豬TRIM11基因連接，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)，經(jīng)氨芐青霉素篩選，進(jìn)行菌液PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌液送至上海生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果Blast分析顯示，該重組質(zhì)粒包含了豬TRIM11基因CDS序列與兩端的酶切位點(diǎn)序列，提示成功構(gòu)建了豬PB-TRIM11重組質(zhì)粒。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1.TRIM11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA marker (DL2000)；1.PCR product of TRIM11圖5　豬TRIM11基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.5　PCR product of pig TRIM11

2.5PB-TRIM11轉(zhuǎn)染PK15的熒光顯微鏡觀察

將PB-TRIM11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，由于PiggyBac載體上有綠色熒光蛋白GFP，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果(圖6)。經(jīng)嘌呤霉素篩選4周后，可見單克隆出現(xiàn)，細(xì)胞GFP表達(dá)穩(wěn)定。

2.6豬PB-TRIM11重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)檢測

以GAPDH為內(nèi)參，熒光定量檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PB-TRIM11細(xì)胞中的TRIM11 mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示(圖7)，和轉(zhuǎn)染PiggyBac組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PB-TRIM11組的TRIM11轉(zhuǎn)錄量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.7過表達(dá)豬TRIM11對PRV病毒增殖的影響

經(jīng)過測定，制得的PRV懸液在PK15細(xì)胞上的TCID50為10-6.23·0.1 mL-1。過表達(dá)TRIM11組與PiggyBac空載組的細(xì)胞分別接種0.1 MOI PRV 12、24、36 h后，于顯微鏡下放大100倍觀察細(xì)胞病變情況，可以看到兩組細(xì)胞于12 h開始出現(xiàn)病變，24 h細(xì)胞變圓形成合胞體病變明顯，36 h細(xì)胞脫落明顯出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象。

A1、B1.PK15細(xì)胞；A2、A3.轉(zhuǎn)染PiggyBac空白載體和PB-TRIM11載體48 h的PK15細(xì)胞；B2、B3.分別表示轉(zhuǎn)染PiggyBac空白載體和PB-TRIM11載體28 d的PK15細(xì)胞A1，B1.PK15 cells；A2、A3.PK15 cells transfected with PiggyBac empty vector or PB-TRIM11 vector after 48 hours；B2，B3.PK15 cells transfected with PiggyBac empty vector or PB-TRIM11 vector after 28 days (200×)圖6　熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染結(jié)果(200×)Fig.6　Transfection results under fluorescence microscope (200×)

過表達(dá)TRIM11組與PiggyBac空載體組的細(xì)胞分別接種0.1 MOI PRV 12、24、36 h后，收取細(xì)胞上清液檢測病毒滴度發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TRIM11組的病毒滴度始終高于PiggyBac空載體組，這種差異在12 h時更明顯，約1-log10(P<0.05)，隨著時間的延長而縮小，提示過表達(dá)TRIM11在PRV感染早期，一定程度上促進(jìn)了病毒的增殖(圖8)。

Control.轉(zhuǎn)染PiggyBac vector組；*. P<0.05；以GAPDH為內(nèi)參Control.The PK15 cells stably transfected with PiggyBac vector；* indicated the significant level at 5%；GAPDH was used as internal standard圖7　熒光定量PCR檢測PK15細(xì)胞中TRIM11 mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.7　The transcription level of TRIM11 mRNA in PK15 cells determined by fluorescence quantitative

*.P<0.05圖8　穩(wěn)定表達(dá)TRIM11的PK15細(xì)胞對PRV增殖的影響Fig.8　The PK15 cells stably expressing TRIM11 influnence on PRV multiplication

3　討　論

最大的含有RING結(jié)構(gòu)域的蛋白家族是三結(jié)構(gòu)域(TRIM)蛋白也稱為RING/B-box/Coil(RBCC)蛋白家族。在功能上，許多TRIM蛋白家族成員如TRIM8、TRIM25、TRIM32等的RING結(jié)構(gòu)具有E3泛素連接酶活性[9]。近年來的研究表明TRIM蛋白在病毒感染中調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的有關(guān)信號通路，調(diào)控抗病毒免疫反應(yīng)。例如，最近有研究報道TRIM32參與病毒誘導(dǎo)的MITA泛素化修飾，正調(diào)控Ⅰ型干擾素表達(dá)信號通路，抑制VSV病毒復(fù)制[10]。TRIM25能夠泛素化病毒RNA受體視黃酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ(RIG-Ⅰ)的N末端，這種改變能夠激活RIG-Ⅰ下游配體結(jié)合參與線粒體抗病毒信號通路(MAVS)直接引起Ⅰ型干擾素(IFN)的產(chǎn)生從而抑制病毒復(fù)制[11]。TRIM8通過介導(dǎo)TAK1 K63連接的聚泛素化，在IL-1β和TNFα誘導(dǎo)的NF-κB激活中充當(dāng)了一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，而NF-κB在免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，TAK1也參與了模式識別受體介導(dǎo)的信號通路[12]。

TRIM11是TRIM/RBCC蛋白家族中E3泛素連接酶中的一員，因其與人體肽相互作用而被知曉。雖然之前也有報道稱TRIM11參與了HIV-1復(fù)制的抑制[13]，但最近在Y.Lee等[4]的研究中發(fā)現(xiàn)在HSV-1感染中TRIM11可以和TBK1(RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生信號通路的關(guān)鍵因子)的CC2結(jié)構(gòu)域結(jié)合抑制IRF3的激活最終導(dǎo)致IFN-β產(chǎn)生的減少，負(fù)調(diào)控抗病毒免疫反應(yīng)，這種作用不依賴于其RING結(jié)構(gòu)域。

偽狂犬病毒(PRV)是一種豬的α皰疹病毒，其與人類病原體單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、HSV-2以及水痘帶狀皰疹病毒有關(guān)[14]。推測在PRV感染中TRIM11也可能抑制抗病毒免疫反應(yīng)。作者選擇豬的TRIM11基因為研究對象，對其進(jìn)行克隆，構(gòu)建真核表達(dá)載體PB-TRIM11，之后用PB-TRIM11和PiggyBac空載體轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，探究在PK15細(xì)胞中過表達(dá) TRIM11 對PK15細(xì)胞感染PRV后的影響。結(jié)果表明經(jīng)篩選后的轉(zhuǎn)染PB-TRIM11的PK15細(xì)胞比對照組細(xì)胞TRIM11基因約過表達(dá)1倍。在0.1 MOI的PRV感染細(xì)胞0、12、24、36 h時，過表達(dá) TRIM11組上清中的病毒滴度始終高于對照組，且在12 h時這種差異更明顯(P<0.05)，提示過表達(dá)TRIM11在PRV感染早期，一定程度上促進(jìn)了PRV的增殖。以往有研究[15]RIG-Ⅰ介導(dǎo)了PRV感染早期誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)，推測TRIM11促進(jìn)PRV增殖的作用可能與其負(fù)調(diào)控RIG-Ⅰ誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的信號通路有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

[1]OZATO K，SHIN D M，CHANG T H，et al.TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity[J].NatRevImmunol，2008，8(11)：849-860.

[2]仇艷光，王江雁，王沛.TRIM蛋白家族結(jié)構(gòu)與抗病毒功能[J].中國免疫學(xué)雜志，2013，29(1)：107-110.

QIU Y G，WANG J Y，WANG P.The structure of TRIM family and antiviral function[J].ChineseJournalofImmunology，2013，29(1)：107-110.(in Chinese)

[3]ISHIKAWA H，TACHIKAWA H，MIURA Y，et al.TRIM11 binds to and destabilizes a key component of the activator-mediated cofactor complex (ARC105) through the ubiquitin-proteasome system[J].FEBSLett，2006，580(20)：4784-4792.

[4]LEE Y，SONG B，PARK C，et al.TRIM11 negatively regulates IFNβ production and antiviral activity by targeting TBK1[J].PLoSOne，2013，8(5)：e63255.

[5]YU X L，ZHOU Z，HU D M，et al.Pathogenic pseudorabies virus，China，2012[J].EmergInfectDis，2014，20(1)：102-104.

[6]SCOTT A D.Overview of Pseudorabies [J/OL].http：//www.merckvetmanual.com/mvm/nervous_system/pseudorabies/overview_of_pseudorabies.html，2014-10.

[7]田利源，陳紅星，鄧?yán)^先.一個新的與泛素化有關(guān)的蛋白家族—TRIM家族[J].生物技術(shù)通訊，2007，18(2)：270-272.

TIAN L Y，CHEN H X，DENG J X.TRIM protein：a family involved in ubiquitination[J].LettersInBiotechnology，2007，18(2)：270-272.(in Chinese)

[8]RYU S.Investigation of the FAT10 conjugation pathway[D].Konstanz：University of Konstanz，2012.

[9]PETROSKI M D，DESHAIES R J.Function and regulation of cullin-RING ubiquitin ligases[J].NatRevMolCellBiol，2005，6(1)：9-20.

[10]張靜.TRIM32調(diào)控病毒誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素表達(dá)的分子機(jī)制[D].武漢：武漢大學(xué)，2013.

ZHANG J.The mechanisms of virus-induced expression of type I interferon by TRIM32[D].Wuhan：Wuhan University，2013.(in Chinese)

[11]劉童，安利國，楊桂文.TRIM在病毒免疫防御機(jī)制中的作用[J].國際病毒學(xué)雜志，2012，19(2)：57-60.

LIU T，AN L G，YANG G W.The role of TRIM in the immune defense against virus[J].InternationalJournalofVirology，2012，19(2)：57-60.(in Chinese)

[12]LI Q，YAN J，MAO A P，et al.Tripartite motif 8 (TRIM8) modulates TNFα- and IL-1β-triggered NF-κB activation by targeting TAK1 for K63-linked polyubiquitination[J].ProcNatlAcadSciUSA，2011，108(48)：19341-19346.

[13]YUAN T，YAO W T，HUANG F，et al.The human antiviral factor TRIM11 is under the regulation of HIV-1 Vpr[J].PLoSOne，2014，9(8)：e104269.

[14]BRUKMAN A，ENQUIST L W.Suppression of the interferon-mediated innate immune response by pseudorabies virus[J].JVirol，2006，80(13)：6345-6356.

[15]謝立蘭.偽狂犬病毒和豬傳染性胃腸炎病毒誘導(dǎo)β干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

XIE L L.Studies on the molecular mechanisms that PRV induced and TGEV induced IFN-β production[D].Wuhan：Huazhong Agricultural University，2011.(in Chinese)

(編輯白永平)

Molecular Cloning of PorcineTRIM11 Gene and Its Promotion Effect on Pseudorabies Virus Replicationinvitro

SONG Shuang，ZENG Lei，LU Shao-fang，GUO Zhen-zhen，LU Wei-fei，HAN Li-qiang，WANG Jiang，WANG Yue-ying，CHU Bei-bei*，YANG Guo-yu*

(KeyLaboratoryofAnimalBiochemistyandNutrition，MinistryofAgriculture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

In order to preliminary study the immunologic functions of porcineTRIM11，the cDNA of the target gene was amplified from the cDNA of porcine submandibular lymph node，the protein structure of porcineTRIM11 was predicted and its tissue expression profile was analysed，the cloned porcineTRIM11 cDNA was connected into PiggyBac (PB) transposon vector，then the recombinant vector (PB-TRIM11) was transfected to PK15 cells to establish stably transfected PK15 cell line.The results showed that the coding length of the cloned porcineTRIM11 was 1 407 bp and the sequence code 468 amino acids.Porcine TRIM11 protein was characterized by the presence of the tripartite motif.Tissue transcription profile analysis showed that，the transcription ofTRIM11 was higher in fat，lung，whereas the transcription of porcineTRIM11 was lower in heart，ileum，recutum，duodenum.DNA sequence analysis ofTRIM11 showed that the clonedTRIM11 cDNA was consistent with sequence from GenBank and the recombinant vector (PB-TRIM11) was constructed.The transfected PK15 cell line stably expressing TRIM11 was established successfully and the transcription ofTRIM11 was identified by qRT-PCR.PK15 cell line that stably express porcine TRIM11 and control cells were infected with pseudorabies virus (PRV)，respectively，then the cell supernatants were harvested at various time points after infection and the virus titers were detected.The results showed that the viral TCID50of theTRIM11 over-expression group was higher than the control all the time.It indicates that theTRIM11 over-expression cells might be more susceptible to PRV.The study provides the experimental basis for the role of porcine TRIM11 in the innate immunity system in the future.

tripartite motif protein；pseudorabies virus；virus multiplication；stable cell line

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.020

2015-12-01

國家自然科學(xué)基金(3149600030) ；農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?2014ZX0801015B)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(142300413209)

宋爽(1990-)，女，河南許昌人，碩士生，主要從事動物生物化學(xué)研究，E-mail:Domhill@163.com

褚貝貝，E-mail: chubeibei_hau@hotmail.com；楊國宇，教授，博士，主要從事動物生物化學(xué)研究，E-mail: haubiochem@163.com

S852.4；S852.659.1

A

0366-6964(2016)06-1239-08