佘平昌，吳曉云，梁春年，禇　敏，丁學(xué)智，閻　萍*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050； 2.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

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牦牛角性狀候選基因的篩選

佘平昌1，2，吳曉云1，2，梁春年1，2，禇敏1，2，丁學(xué)智1，2，閻萍1，2*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050； 2.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

本研究旨在篩選牦牛角性狀候選基因，為角發(fā)育機(jī)制的研究和無(wú)角牦牛的培育提供科學(xué)依據(jù)。采集牦牛角發(fā)育初期胎齡90 d的有角和無(wú)角牛的角基及額部皮膚組織，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)，比較牛角性狀候選基因OLIG1、OLIG2、IFNAR1、IFNAR2、C1H21orf62、GCFC1、IFNGR2、SYNJ1、IL10RB、GART、RXFP2、FOXL2、TWIST1、TWIST2、ZEB2、E-cadherin和P-cadherinmRNA在角基間及皮膚間的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，候選基因OLIG1、IFNAR1、C1H21orf62、SYNJ1、IL10RB、GART、RXFP2、TWIST2和E-cadherin在有角和無(wú)角牦牛角基間和皮膚間轉(zhuǎn)錄量差異不顯著(P>0.05)。IFNGR2、FOXL2、TWIST1和P-cadherin在有角和無(wú)角牦牛角基間轉(zhuǎn)錄量差異顯著(P<0.05)。IFNAR2和GCFC1在有角和無(wú)角牦牛角基間和皮膚間轉(zhuǎn)錄量差異都顯著(P<0.05)。OLIG2和ZEB2在有角和無(wú)角牦牛角基間轉(zhuǎn)錄量差異極顯著(P<0.01)。推測(cè)OLIG2和FOXL2可能是牛角性狀的關(guān)鍵候選基因，同時(shí)ZEB2、TWIST1和IFNGR2基因可能對(duì)牛角的形成具有重要作用，而P-cadherin基因可能參與了牛角的發(fā)育。

牛角；無(wú)角性狀；牦牛；候選基因；qRT-PCR

牛角是?？苿?dòng)物特有的組織結(jié)構(gòu)。在男耕女織的古代原始生產(chǎn)過(guò)程中，牛角是進(jìn)行耕地過(guò)程中牽牛的基礎(chǔ)，所以牛角在原始耕作時(shí)代中是一種生產(chǎn)力。但是進(jìn)入集約規(guī)模化飼養(yǎng)后，牛群常發(fā)生爭(zhēng)斗及傷害飼養(yǎng)人員的行為，造成了動(dòng)物的傷害及養(yǎng)殖場(chǎng)的混亂，牛角變成了一種制約家畜集約化和設(shè)施養(yǎng)殖的性狀。所以，很多養(yǎng)牛場(chǎng)將犢牛進(jìn)行去角[1]，然而去角增加了養(yǎng)殖成本，同時(shí)容易引起犢牛的應(yīng)激反應(yīng)，是違背動(dòng)物福利的行為。動(dòng)物福利問(wèn)題已經(jīng)在發(fā)達(dá)國(guó)家引起高度重視，歐盟啟動(dòng)了關(guān)于禁止動(dòng)物閹割和去角的ALCASDE工程[2]，而德國(guó)的動(dòng)物福利組織也聯(lián)合政府發(fā)表申明將積極推進(jìn)無(wú)角公牛精液的使用。因此，無(wú)角牛品種的培育是未來(lái)牛育種的主要方向之一。

牛角根據(jù)生物學(xué)分類屬于洞角，由角質(zhì)鞘和骨心組成。牛角的發(fā)育較早，60胎齡的胎牛就細(xì)微可見(jiàn)角的形成，90胎齡時(shí)發(fā)育更加明顯，基本可以通過(guò)肉眼判定角的有無(wú)，在角的生長(zhǎng)部位可見(jiàn)真皮乳頭狀的突起形成角竇[3]，同時(shí)出現(xiàn)表皮增厚的現(xiàn)象[4]，角竇和皮膚間通過(guò)真皮乳頭進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)[5]。但是只有在出生時(shí)才可見(jiàn)螺紋狀角的出現(xiàn)[6]，出生后6月齡才開(kāi)始出現(xiàn)角的空腔結(jié)構(gòu)[3]。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)胚胎期牛角與皮膚間的差異主要有4點(diǎn)：腺導(dǎo)管真皮細(xì)胞的集群不同、囊泡化的角質(zhì)細(xì)胞、沒(méi)有毛囊的發(fā)育[7]、真皮中出現(xiàn)大量的神經(jīng)束[8]，推測(cè)頭皮層的神經(jīng)纖維對(duì)牛角形成具有觸動(dòng)作用，所以神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因可能會(huì)在角基部位高表達(dá)。在牛角性狀候選基因的研究中，根據(jù)目前的研究進(jìn)展，很多研究將無(wú)角突變定位在1號(hào)染色體(BTA1，Bostaurusautosome1)1.265～2.198 M上1 M左右的一段序列內(nèi)，包括C1H21orf62、OLIG1、OLIG2、SYNJ1、GCFC4、GART、IL10RB、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2等基因[9-14]。而不在該序列內(nèi)的一些基因也可能對(duì)牛角形成和發(fā)育具有重要作用，F(xiàn)OXL2和RXFP2基因在牛角形成和發(fā)育過(guò)程中高度表達(dá)[7，15]，而ZEB2、TWIST1和TWIST2是畸角牛的候選基因[16-18]，E-cadherin和P-cadherin對(duì)胚胎分化及表皮、毛囊、神經(jīng)等的形成具有重要作用[19-21]。牛角是一種質(zhì)量性狀(Qualitative trait)，其遺傳方式可能為多基因遺傳(Polygenic trait)。目前對(duì)牛角性狀相關(guān)基因還沒(méi)有進(jìn)行精確定位，還需進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)方法分析牛角性狀候選基因mRNA的表達(dá)水平，初步揭示牛角發(fā)育和形成的分子機(jī)制，以期為無(wú)角牦牛品種的培育提供科學(xué)依據(jù)和理論支撐。

1　材料與方法

在青海省大通牦牛種牛場(chǎng)采集90 d胎齡的有角和無(wú)角牦牛的角基部及額部皮膚樣品，液氮保存，并對(duì)其角基部及全身進(jìn)行拍照，測(cè)量其頂臀長(zhǎng)，根據(jù)胎兒頂臀長(zhǎng)與胎齡的線性關(guān)系推算胎齡[22]。

1.1RNA提取及cDNA合成

采用Trizol (Invitrogen)法提取有角和無(wú)角牦牛的角基及額部皮膚組織的總RNA，按照TaKaRa公司試劑盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

1.2熒光定量PCR

使用Premier 5.0設(shè)計(jì)候選基因mRNA熒光定量PCR引物(表1)，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因。引物由上海英駿生物公司合成，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

定量PCR(CFX96)反應(yīng)使用25 μL體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。熒光定量 PCR 的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，53.5 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；之后進(jìn)行熔解曲線分析，反應(yīng)程序：65 ℃ 逐漸升溫至95 ℃，每升溫0.5 ℃讀板1次。每個(gè)組織4個(gè)個(gè)體重復(fù)，每個(gè)樣本3次試驗(yàn)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后以熔解曲線來(lái)判定qRT-PCR反應(yīng)的特異性；獲得每個(gè)樣品的Ct值，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

1.3圖像數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SPSS 17.0進(jìn)行one-way ANOVA分析，Origin 7.5作柱狀圖。

2　結(jié)　果

2.1BTA1上候選區(qū)域內(nèi)基因的相對(duì)表達(dá)量分析

為了分析候選基因的轉(zhuǎn)錄情況，本研究對(duì)比候選基因在有角牛和無(wú)角牛的角基間及額部皮膚間的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，據(jù)此分析該基因是否參與了角的形成和發(fā)育(圖1)。OLIG1、OLIG2、IFNAR1、IFNAR2、C1H21orf62、GCFC1、IFNGR2、SYNJ1、IL10RB和GART是1號(hào)染色體上1 M左右片段上的基因。研究發(fā)現(xiàn)，OLIG1、IFNAR1、C1H21orf62、SYNJ1、IL10RB、GART、PXFP2、TWIST2和E-cadherin在有角和無(wú)角牦牛的角基間及皮膚間的轉(zhuǎn)錄量差異都不顯著(P>0.05)；OLIG2在有角牛角基的轉(zhuǎn)錄量極顯著高于無(wú)角牛角基(P<0.01)，而在皮膚間差異不顯著；IFNAR2在有角牛的角基和皮膚的轉(zhuǎn)錄量都要顯著高于無(wú)角牛(P<0.05)；相反，GCFC1在有角牛的角基和皮膚的轉(zhuǎn)錄量都要顯著低于無(wú)角牛(P<0.05)。IFNGR2在無(wú)角牛角基中的轉(zhuǎn)錄量顯著高于有角牛(P<0.05)，而在皮膚間的轉(zhuǎn)錄差異不顯著(P>0.05)。

表1熒光定量PCR引物序列

Table 1Primer sequences used for the real-time quantitative PCR

基因名稱Genename上游引物序列(5'-3')Forwardprimer下游引物序列(5'-3')ReverseprimerOLIG1GTGGCGATCTTGGAGAGCGAGAGGAAGCGGATGCACOLIG2CCGGCATCTACCAGTACATTATAGCGCACTCGTTGAGGCTGAGGTIFNAR1TCTTGACAGACTCACTGCTGCTGAAGCAAATCTGAAGCCTGAAIFNAR2CTCAAGGGCTCTCACACACAACTTCCGAGGAGGACAGTGAC1H21orf62ACCAGCTGTCAAGCCTGAGTCAGAAGGAGGTGCCATTCTCGCFC1GATGATGAGAAACGCCGCATAGGCATTGTCTGGTAGGTGTIFNGR2CTTGGACCAGCACTTTGGTTCTCGCCAAAGGATGACACTTSYNJ1TGGTACGGTGTTGGTCTCAAATTCAAGGCAGAGCTTCCCTIL10RBTCTGTGATGACGCTCAGTTTGTTTATGAGCCACCCTCATCACGARTGCCCGAGTACTTGTCATTGGCCTGGGGTAACCAACACTTGRXFP2AGAACCCCACAATCCAGATGTGACCCTGGAGAAGTTCCTGFOXL2CCGGCATCTACCAGTACATTATAGCGCACTCGTTGAGGCTGAGGTTWIST1TGTGAGTCAGTTTGATCCCAATGGCATCATTATGGACTTTCTCCTWIST2TTCAACTGGACCAAGGCTCTCCAGGCTAACTTGAGACAGTCAZEB2ACACGGGTTCTGAAACTGATGAGGCACGCTAGCTGGACTTCTE-cadherinGTACACCTTCATCGTCCAGAGCTAAGCTCTTCAATGGCTTGTCCATTTGAP-cadherinGCAGCCTGATACGGTAGAGCAGATCGAACCGGGTACTGGGAPDHATGCAACCTGGTGATAAAAGAGGAGGGCGCTAAGAGAAGAGTCAT

2.2其他重要候選基因的相對(duì)表達(dá)量分析

RXFP2、FOXL2、TWIST1、TWIST2和ZEB2也是重要的角性狀候選基因。研究發(fā)現(xiàn)，RXFP2和TWIST2在有角和無(wú)角牦牛的角基間和皮膚間轉(zhuǎn)錄量差異都不顯著(P>0.05)；FOXL2在有角牛角基的轉(zhuǎn)錄量顯著高于無(wú)角牛(P<0.05)，而在皮膚間差異不顯著；TWIST1卻在無(wú)角牛角基的轉(zhuǎn)錄量顯著高于有角牛(P<0.05)，皮膚間的轉(zhuǎn)錄量差異不顯著。ZEB2在有角牛角基的轉(zhuǎn)錄量極顯著低于無(wú)角牛(P<0.01)，而在皮膚間同樣差異不顯著(P>0.05)。

2.3角發(fā)育相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量分析

關(guān)于E-cadherin和P-cadherin與角性狀的相關(guān)研究報(bào)道較少，但E-cadherin是表皮及毛囊的發(fā)育關(guān)鍵基因，P-cadherin的表達(dá)對(duì)表皮發(fā)育及神經(jīng)分化具有重要作用，而據(jù)研究進(jìn)展可知，角的發(fā)育是角基表皮分化的過(guò)程，中間也伴隨著毛囊的發(fā)育，引入分析為試驗(yàn)提供參考。研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在角基間和皮膚間的轉(zhuǎn)錄差異都不顯著(P>0.05)，而P-cadherin在有角牛角基中的轉(zhuǎn)錄量顯著高于無(wú)角牛(P<0.05)，皮膚間的轉(zhuǎn)錄量差異不顯著(P>0.05)。

horn.角基組織；skin.皮膚組織；horned.有角牛群體；polled.無(wú)角牛群體；*.P<0.05；**.P<0.01horn.Horn bud；skin.Forehead skin；horned.Horned yaks；polled.Polled yaks；*.P<0.05；**.P<0.01圖1　候選基因在有角和無(wú)角牦牛的角基間和皮膚間的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平Fig.1　Relative expression analyses of candidate genes in horn bud and skin tissues between horned and polled yaks by qRT-PCR

3　討　論

本研究對(duì)BAT1上定位的無(wú)角性狀基因座區(qū)域內(nèi)的候選基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析。研究結(jié)果顯示，OLIG1、IFNAR1、C1H21orf62、SYNJ1、IL10RB和GART在有角和無(wú)角牦牛的角基間及皮膚間的轉(zhuǎn)錄量差異不顯著(P>0.05)；OLIG2、IFNAR2、GCFC1和IFNGR2的mRNA轉(zhuǎn)錄量在角基間具有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異。候選基因中，OLIG2為少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，其主要參與少突膠質(zhì)細(xì)胞的形成分化及髓鞘的形成，同時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物的組織分化起重要調(diào)節(jié)作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，OLIG2在角基間轉(zhuǎn)錄差異極顯著，研究結(jié)果與在荷斯坦牛[7]和西門(mén)塔爾牛[15]中的研究結(jié)果一致。近期研究發(fā)現(xiàn)，OLIG2參與神經(jīng)分化，推測(cè)該基因?qū)ε＝切纬傻淖饔脵C(jī)制可能與神經(jīng)調(diào)控有關(guān)，說(shuō)明OLIG2對(duì)角的發(fā)育有重要作用，因此將該基因作為荷斯坦奶牛、西門(mén)塔爾牛及牦牛無(wú)角性狀的候選基因[7，13，15]。IFNAR2和GCFC1基因在角基間和皮膚間轉(zhuǎn)錄差異均顯著，說(shuō)明IFNAR2和GCFC1 的表達(dá)模式不具有角組織特異性，IFNAR2和GCFC1可能對(duì)表皮的發(fā)育過(guò)程具有關(guān)鍵作用。IFNGR2是參與T細(xì)胞活動(dòng)的一個(gè)細(xì)胞因子，在無(wú)角荷斯坦牛中該基因存在突變位點(diǎn)AC000158：g.1390292G>A[24]，但是S.Rothammer等[12]的研究又否定了該突變與無(wú)角性狀的相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)，有角牛中IFNGR2基因的表達(dá)量顯著低于無(wú)角牛，所以還不能排除IFNGR2可能為角性狀候選基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，其他候選基因RXFP2、TWIST2和E-cadherin在有角和無(wú)角牦牛的角基間和皮膚間轉(zhuǎn)錄量差異不顯著(P>0.05)；FOXL2、TWIST1、ZEB2和P-cadherin的mRNA轉(zhuǎn)錄量在角基間具有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異。候選基因中，F(xiàn)OXL2又名叉頭框因子2，是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，對(duì)哺乳動(dòng)物早期胚胎的發(fā)育和生殖系統(tǒng)功能維持具有重要作用[25]，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2在角基間的表達(dá)量存在顯著差異，在西門(mén)塔爾牛有角牛角基中該基因的表達(dá)量也顯著高于無(wú)角牛[15]，同時(shí)FOXL2基因是羊角性狀的主效基因之一[26]，所以FOXL2可能參與了牛角的形成和發(fā)育。TWIST1[16]和ZEB2[18]都是目前研究畸角牛的關(guān)鍵基因，TWIST1是在胚胎發(fā)育的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)及組織朔形具有重要作用，參與骨骼、肌肉和神經(jīng)等的形成。ZEB2屬于E盒結(jié)合鋅指蛋白家族，在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育具有重要作用。而牦牛中沒(méi)有畸角牛，但是本研究發(fā)現(xiàn)其在角基中表達(dá)量差異顯著，推測(cè)TWIST1和ZEB2可能與牛角的形成或發(fā)育具有調(diào)控作用，但是其功能仍需進(jìn)一步明確。P-cadherin基因?yàn)殁}粘蛋白家族成員，在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)表皮及神經(jīng)的發(fā)育發(fā)揮著重要的作用，而角的發(fā)育為表皮增厚的過(guò)程，本研究中P-cadherin在角基間轉(zhuǎn)錄差異顯著，推測(cè)該基因可能參與了牛角的發(fā)育。

本研究中，候選基因OLIG1、IFNAR1、C1H21orf62、SYNJ1、GART和RXFP2雖然在有角和無(wú)角牦牛的角基間和皮膚間的轉(zhuǎn)錄均不存在顯著差異(P>0.05)，但是根據(jù)本研究的內(nèi)容不能完全排除這些基因可能參與角的形成或發(fā)育的可能。而IL10RB、TWIST2和E-cadherin基因的相關(guān)研究較少，且本試驗(yàn)結(jié)果顯示這些基因在有角和無(wú)角牛角基及皮膚間的表達(dá)量都不存在差異，故推測(cè)IL10RB、TWIST2和E-cadherin基因可能不是牛角早期形成和發(fā)育的關(guān)鍵基因。

4　結(jié)　論

牦牛角形狀候選基因的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，候選基因OLIG1、IFNAR1、C1H21orf62、SYNJ1、IL10RB、GART、RXFP2、TWIST2和E-cadherin在有角和無(wú)角牦牛的角基和皮膚間相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著(P>0.05)。IFNGR2、FOXL2、TWIST1和P-cadherin基因在角基間轉(zhuǎn)錄量差異顯著(P<0.05)。IFNAR2和GCFC1基因在角基和皮膚間轉(zhuǎn)錄量差異都顯著(P<0.05)。OLIG2和ZEB2基因在角基間轉(zhuǎn)錄量差異極顯著(P<0.01)。結(jié)合前期研究推測(cè)OLIG2和FOXL2基因可能是牛角性狀的關(guān)鍵候選基因，同時(shí)ZEB2、TWIST1和IFNGR2基因可能對(duì)牛角的形成具有重要作用，而P-cadherin基因可能參與了牛角的發(fā)育。

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(編輯郭云雁)

Screening of Candidate Genes for Horn Trait of Yak

SHE Ping-chang1，2，WU Xiao-yun1，2，LIANG Chun-nian1，2，CHU Min1，2，DING Xue-zhi1，2，YAN Ping1，2*

(1.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalSciencesofChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou730050，China；2.KeyLaboratoryofYakBreedingEngineeringofGansuProvince，Lanzhou730050，China)

This study screened the candidate genes of horn trait which provides scientific basis for the horn developmental mechanism and the polled yak breeding.The horn bud and forehead skin tissue from horn and polled yaks with 90 d gestational age were collected，and the mRNA different expression ofOLIG1，OLIG2，IFNAR1，IFNAR2，C1H21orf62，GCFC1，IFNGR2，SYNJ1，IL10RB，GART，RXFP2，F(xiàn)OXL2，TWIST1，TWIST2，ZEB2，E-cadherin，P-cadheringenes were analyzed using real-time quantitative PCR(qRT-PCR).The results showed that expressions ofOLIG1，IFNAR1，C1H21orf62，SYNJ1，IL10RB，GART，RXFP2，TWIST2 andE-cadheringenes showed no significant differences in horn and skin between horned and polled yaks (P>0.05).There were significant difference at transcript levels ofIFNGR2，F(xiàn)OXL2，TWIST1 andP-cadheringenes in horn buds between horned and polled yaks(P<0.05).IFNAR2 andGCFC1 had significant transcription difference in the expression of horn bud and skin between horned and polled yaks (P<0.05).OLIG2 andZEB2 had highly significant transcription difference in horn bud expression between horned and polled yaks (P<0.01).We concluded thatOLIG2 andFOXL2 might be the key candidate genes.ZEB2，TWIST1 andIFNGR2 might also involve in the formation of horn.P-cadherinmight participate in the development of horn.

horn；polled trait；yak；candidate genes；qRT-PCR

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.009

2015-11-02

牦牛遺傳資源與育種(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-01)；科技部科技支撐計(jì)劃(2012BAD13B05)

佘平昌(1989-)，男，云南普洱人，碩士生，主要從事家畜分子生物學(xué)研究，E-mail：sheemail@163.com

閻萍，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：pingyanlz@163.com

S823.85；S813.3

A

0366-6964(2016)06-1147-07