孫洪新，王紅娜，張英杰*，劉月琴，陳曉勇，敦偉濤

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定 071001； 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000)

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BMPR-IB基因的克隆及其在絨山羊成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

孫洪新1，2，王紅娜1，張英杰1*，劉月琴1，陳曉勇2，敦偉濤2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定 071001； 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000)

本研究旨在克隆BB基因型小尾寒羊的BMPR-IB基因編碼區(qū)，構(gòu)建重組載體，瞬時轉(zhuǎn)染絨山羊成纖維細(xì)胞，并對BMPR-IB等基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。采用 RT-PCR方法擴(kuò)增BMPR-IB基因完整編碼區(qū)，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-BMPR-IB，經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine LTX&PLUS介導(dǎo)轉(zhuǎn)染絨山羊成纖維細(xì)胞，并分別于轉(zhuǎn)染后48和72 h收集細(xì)胞，分別提取RNA和蛋白，利用RT-PCR和Western blot方法檢測相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果擴(kuò)增得到了包含BMPR-IB基因完整編碼區(qū)全長在內(nèi)的1 550 bp片段，與已知序列高度同源；Real-time PCR檢測結(jié)果均表明，轉(zhuǎn)基因組細(xì)胞中BMPR-IB表達(dá)量顯著高于空白對照組(P<0.01)，IGF-Ⅰ基因表達(dá)量也顯著上調(diào)(P<0.01)，TLR4、IFN、MHC、PNRP、GDF5、INH基因的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；Western blot檢測表明，轉(zhuǎn)染組BMPR-IB、IGF-I的表達(dá)有所增加，BMP4、TLR4的表達(dá)略有降低，但差異均不顯著(P>0.05)。本研究成功實(shí)現(xiàn)了小尾寒羊BMPR-IB基因在山羊成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，為轉(zhuǎn)BMPR-IB基因陽性細(xì)胞株和細(xì)胞系的建立提供了基礎(chǔ)；研究表明BMPR-IB(BB型)基因的過表達(dá)能上調(diào)IGF-Ⅰ基因的表達(dá)，下調(diào)TLR4基因的表達(dá)。

BMPR-IB基因；真核表達(dá)載體；絨山羊成纖維細(xì)胞；表達(dá)

FecB基因最早是在澳大利亞Booroola羊中發(fā)現(xiàn)的一個與高繁殖率相關(guān)的主效基因，能顯著提高羊的繁殖率。后來的研究證明FecB基因的本質(zhì)為骨形態(tài)蛋白Ⅰ型受體基因(Bone morphogenetic protein receptor-IB，BMPR-IB)。BMPR-IB基因?qū)儆谵D(zhuǎn)移生長因子β亞基(TGF-β)受體家族成員，存在于許多細(xì)胞類型中，是調(diào)節(jié)生長和分化的多功能蛋白[1]。該基因編碼區(qū)由10個外顯子組成，共1 509 bp，編碼502個氨基酸[2-3]，在生殖器官中，BMPR-IB可能是參與聯(lián)結(jié)前列腺素通路和下游前列腺素作用的平行通路[4]。

2001年，3個研究小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)在Booroola綿羊BMPR-IB基因編碼區(qū)第746位上發(fā)生了A→G置換，使受體細(xì)胞內(nèi)激酶區(qū)編碼蛋白由野生型的谷胺酰氨變?yōu)榫彼?Q249R)，正是這個突變 (Q249R)與Booroola母羊高繁殖力完全相關(guān)[2-3，5]。激酶區(qū)3亞區(qū)的突變改變了Smads的表達(dá)和磷酸化，導(dǎo)致了Booroola羊表現(xiàn)出大量小的有腔卵泡早熟和排卵率提高[2]。P.Mulsant等[3]通過研究重組GDF5和BMP4在體外對顆粒細(xì)胞分化和孕酮分泌的影響，發(fā)現(xiàn)BMPR-IB基因(A746G)突變減少了小型有腔卵泡的分化活性；BMP4對野生型(++)綿羊顆粒細(xì)胞的促分化作用比對突變型(BB)有所增強(qiáng)；BB型母羊顆粒細(xì)胞對GDF5和BMP4的敏感性明顯低于++型母羊的顆粒細(xì)胞。這說明BB型母羊的Q249R突變致使BMPR-IB基因部分失活，對顆粒細(xì)胞生成的抑制作用減弱，因此顆粒細(xì)胞可進(jìn)一步分化，排卵卵泡進(jìn)一步成熟，表現(xiàn)為排卵數(shù)的增加，進(jìn)而提高綿羊的排卵率和繁殖力。

研究表明，BMPR-IB基因編碼區(qū)的A746G突變對Booroola Merino羊(澳大利亞)、Javanese綿羊(印度尼西亞)、Garole綿羊(印度)以及中國的湖羊、小尾寒羊和中國美利奴羊多胎品系等的排卵數(shù)或產(chǎn)羔數(shù)都有顯著影響[6-9]，該基因作為影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因，可用于對綿羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇[10]。目前，該基因已被用于小尾寒羊、湖羊等品種的純種選育及其與引進(jìn)品種雜交育種中多胎的輔助選擇的標(biāo)記基因，如寒泊羊、魯西黑頭杜泊羊等種群的選育[11-12]。

除了綿羊，國內(nèi)還開展了多個山羊品種BMPR-IB基因多態(tài)性研究，但迄今未見在山羊中存在BMPR-IB基因A746G突變的報道。如李麗萍[13]、儲明星[14]、孟麗娜[15]、李文楊[16]等分別對云嶺黑山羊、濟(jì)寧青山羊、河北絨山羊、美姑黑山羊、承德黑山羊和河南槐山羊、崇明白山羊、徐淮山羊、奶山羊、努比山羊、戴云山羊、閩東山羊、福清山羊和南江黃羊等品種的BMPR-IB基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測，均未檢測到A746G突變。在轉(zhuǎn)基因方面，于振興等[17]獲得了轉(zhuǎn)湖羊FecB基因的新疆細(xì)毛羊陽性細(xì)胞株。李新秀[18]研究了沉默BMPR-IB基因?qū)ωi卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及BMP通路上相關(guān)基因表達(dá)的影響。而有關(guān)該基因在山羊細(xì)胞中的表達(dá)情況未見報道。本研究旨在克隆BB型小尾寒羊BMPR-IB基因完整編碼區(qū)序列，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體 pEGFP-BMPR-IB，瞬時轉(zhuǎn)染絨山羊成纖維細(xì)胞，對其中BMPR-IB基因及與繁殖、免疫、生長發(fā)育等相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，為進(jìn)一步研究BMPR-IB基因的功能和轉(zhuǎn)基因優(yōu)質(zhì)肉羊品種培育提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng)用組織及采樣方法自河北易縣絨山羊場采集7日齡遼寧絨山羊耳組織。用剃須刀除凈耳邊緣部耳毛，碘酒、酒精(脫碘)消毒干凈后，用消過毒的耳號鉗快速剪下耳邊緣組織塊，在盛有酒精的小燒杯中涮洗30 s，最后用含雙抗(250 U·mL-1青霉素和250 U·mL-1鏈霉素)的無菌生理鹽水沖洗2～3遍后，將組織塊浸泡入裝有含雙抗的PBS溶液1.5 mL離心管中，用封口膜封口，4℃保存，3～4 h 送回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2藥品試劑pEGFP-N2質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，膠回收純化試劑盒購自上海生工公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司?；蚪M提取試劑盒和大腸桿菌DH5a購自全式金生物技術(shù)有限公司。DMEM/F12購自 Hyclone，胎牛血清購自GIBCO公司，脂質(zhì)體Lipofectamine LTX & PLUS Reagent購自Invitrogen公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔板購自CORNING公司。熒光定量用SYBR Green購自東洋紡生物科技有限公司。Western blot用抗體分別購自Eterlife 和Santa公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1卵巢組織的采集、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄在唐縣肉羊養(yǎng)殖開發(fā)中心，選取已知BMPR-IB基因型為 BB型(突變型)的小尾寒羊進(jìn)行屠宰，采集卵巢，于液氮保存，帶回實(shí)驗(yàn)室，用Trizol法提取總RNA，利用全式金公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.2.2BMPR-IB基因CDS區(qū)的擴(kuò)增根據(jù)GenBank中公布的序列(GI：AF357007)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并根據(jù)該序列編碼區(qū)和pEGFP-N2質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)分析比對結(jié)果，在引物5′端分別添加BamH I和EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，用于擴(kuò)增BMPR-IB基因編碼區(qū)序列。引物序列：上游：5′-CgCGGATCCAAACAAgCAAgCCTgTCATAC -3′(下劃線處為BamH I酶切位點(diǎn))，下游：5′-CCggAATTCgAgCTTAATGTCCTGGGACTCT-3′(下劃線處為EcoR I 酶切位點(diǎn))。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：buffer 3.0 μL，dNTP 4.0 μL，引物 1.0 μL，LA Taq 0.3 μL (1.5U)，cDNA 1.0 μL，ddH2O 15.7 μL。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度大小約為1 550 bp。 擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 95 s，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 95 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增情況。

1.2.3pEGFP-BMPR-IB表達(dá)載體的構(gòu)建分別取pEGFP-N2質(zhì)粒和上述PCR產(chǎn)物各40 μL，分別加入10×M Buffer 12 μL，BamH I 和EcoR I各6 μL，ddH2O 36 μL組成100 μL體系，37 ℃水浴6 h，進(jìn)行雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，膠回收BMPR-IB片段和pEGFP-N2骨架片段，用T4連接酶進(jìn)行16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂具有卡那霉素抗性的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序鑒定。對雙酶切和測序均正確的菌液，進(jìn)行質(zhì)粒中提，測定濃度后備用，獲得的重組真核表達(dá)載體命名為pEGFP-BMPR-IB。

1.2.4耳組織成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)遼寧絨山羊耳組織成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)采用組織塊法進(jìn)行。具體方法見參考文獻(xiàn)[19]。將絨山羊耳緣組織在無菌條件下用PBS洗滌2～3次后，用眼科剪刀將組織剪成為1 mm3左右的小塊，用黃色滅菌槍頭將其放入25 mL培養(yǎng)瓶中。按每塊間隔0.3～0.5 cm放置貼于培養(yǎng)瓶中，倒置在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，待組織塊周圍開始變干(約3～4 h)緩慢加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液浸潤組織塊后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，進(jìn)行過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)6～7 d后，開始有細(xì)胞長出，待細(xì)胞長成致密單層后，用0.25%胰酶消化，待大部分細(xì)胞變圓時，加培養(yǎng)液終止消化，并反復(fù)吹打，只收集脫壁細(xì)胞。鑒于成纖維細(xì)胞消化脫壁比上皮細(xì)胞快，在前3代傳代經(jīng)酶消化，待細(xì)胞剛變圓即終止消化，可得到純化的成纖維細(xì)胞。細(xì)胞生長至70%～80%匯合狀態(tài)時即可冷凍保存，以備基因轉(zhuǎn)染使用。

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用 Lipofectamine LTX & PLUS Reagent試劑盒進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前將生長狀態(tài)良好的G4代絨山羊耳組織成纖維細(xì)胞分別接種到6孔板中，密度為1×105個·mL-1，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長到70%～80% 匯合時，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，用重組質(zhì)粒pEGFP-BMPR-IB進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取125 μL雙無細(xì)胞培養(yǎng)液，加入2.5 μg pEGFP-BMPR-IB質(zhì)粒，加入3 μL PLUS，輕輕混勻后備用，另取125 μL細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋12 μL 脂質(zhì)體。將上兩種稀釋液輕輕混合后在室溫下孵育5 min形成復(fù)合物(此為6孔板每孔用量)。將上述復(fù)合物加入6孔培養(yǎng)板中，輕輕搖動混勻。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，更換為含10% FBS的DMEMF12培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后12 h開始利用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)情況。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對照，分別于轉(zhuǎn)染后48和72 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行RNA和蛋白提取。

1.2.6RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染山羊細(xì)胞中有關(guān)基因表達(dá)轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集試驗(yàn)組和空白組細(xì)胞，利用Trizol提取總RNA，按 Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以GAPDH作為內(nèi)參對照，利用Real-time PCR對BMPR-IB等基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，檢測基因及所用引物見表1。

表1實(shí)時熒光定量所用引物

Table 1Primers used in real-time fluorescence quantitative PCR

基因Gene序列號Accession引物序列(5'-3')PrimersequenceTm值/℃Annealingtemperature片段長度/bpLengthofproductsGAPDHJF825527CAAGTTCCACGGCACAGTCACTCAGCACCAGCATCACCC59.8061.90118BMPR-IBDQ666418CGAATGAAGTTGACATACCACTCGTAAGAGGGGTCACTGG67.5067.30232BMP4EF632080GCTTCCACCACGAAGAACATCACCTCATTCTCTGGGATGC60.1260.62101GDF5XM_005688496TCCAGACCCTGATGAACTCCCAGAGGCCAGTGTTGCTACC60.0560.85176INHXM_005692605CTGGACTCTTTGGCATCACCTGTGTGGTTTCTCACGAACG60.6660.76116IGF-ID11378TCAGCAGTCTTCCAACCCAAAAGGCGAGCAAGCACAGG63.7056.80118MHCAB008346GCCAAGGGCAACGCACAGACTCCTCGTTCAGGGCGATGTAAT60.1064.00188IFNM73244CAGTCGCTGTATCCCTTCTCCGCTTCAACCTCTTCCACA59.8057.60227PNRPJF729302ATGTGGAGTGACGTGGGCGAGGTGGATAGCGGTTGC59.6059.60115TRL4JF825527GTTTCCACAAGAGCCGTAATCCTGTTCAGAAGGCGATA55.4055.40198

Real-time PCR的反應(yīng)體系為20 μL：SYBR qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，ROX 0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，H2O 7.4 μL。Real-time PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。自動生成Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行校正，各基因的相對表達(dá)量重復(fù)3次，取平均值。其中ΔCtl=轉(zhuǎn)染后的Ct值-對應(yīng)內(nèi)參Ct值，ΔCt2=空白組的Ct值-對應(yīng)內(nèi)參Ct值，ΔΔCt=ΔCtl-ΔCt2，2-ΔΔCt值為轉(zhuǎn)染后較空白組各基因表達(dá)量的倍數(shù)。

1.2.7Western blot檢測山羊細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，制備裂解液，4℃離心取上清提取蛋白，測定濃度后使用Western blot方法檢測蛋白表達(dá)情況。利用Total Lab Quant軟件讀出樣品和內(nèi)參的灰度值，按蛋白表達(dá)量=目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值，對蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析統(tǒng)計。1.2.8數(shù)據(jù)分析基因表達(dá)試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和 GraphPad軟件進(jìn)行分析，每個處理做3個重復(fù)。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結(jié)　果

2.1BMPR-IB基因的RT-PCR

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在1.5和 2 kb之間有特異性條帶，約1 550 bp，與預(yù)期條帶大小一致(圖 1)，條帶明亮清晰，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1～3.PCR產(chǎn)物；M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1-3. PCR products; M. Marker DL2000圖1　PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Electrophoresis of PCR products

2.2重組表達(dá)載體pEGFP-BMPR-IB的構(gòu)建及鑒定

將經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后的目的片段與pEGFP-N2線性化片段用T4連接酶進(jìn)行過夜連接后轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，隨機(jī)挑取10個克隆進(jìn)行PCR檢測，對陽性克隆菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果產(chǎn)生了長約1.5和4.7 kb的兩條帶，與預(yù)期的片段長度一致(圖2)。對雙酶切正確的質(zhì)粒樣品進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶切較短片段長度為1 550 bp，該片段包含BMPR-IB基因完整編碼區(qū)，經(jīng) BLAST比對發(fā)現(xiàn)，除A746G外，序列與已知綿羊BMPR-IB編碼區(qū)序列一致。表明BMPR-IB基因已成功克隆入pEGFP-N2質(zhì)粒的MCS區(qū)，pEGFP-BMPR-IB載體構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒圖譜見圖3。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染

使用Lipofectamine LTX & PLUS Reagent試劑盒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。更換培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染24 h后有少量綠色熒光，轉(zhuǎn)染48 h后熒光有所增加，轉(zhuǎn)染72 h后呈現(xiàn)熒光細(xì)胞數(shù)最多。表明所克隆基因可以和報告基因融合表達(dá)。

1～2.雙酶切產(chǎn)物；M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1-2.The double digestion products; M. Marker DL5000圖2　pEGFP-BMPR-IB的雙酶切鑒定Fig.2　Identification of pEGFP-BMPR-IB digested by BamHⅠ and EcoRⅠ

圖3　重組pEGFP-BMPR-IB質(zhì)粒圖譜Fig.3　Vector map of recombinant plasmid

A.未轉(zhuǎn)染；B.轉(zhuǎn)染24 h； C.轉(zhuǎn)染48 h；D.轉(zhuǎn)染72 hA.Control; B. Transfection for 24 hours; C. Transfection for 48 hours; D. Transfection for 72 hours圖4　pEGFP-BMPR-IB轉(zhuǎn)染山羊成纖維細(xì)胞 100×Fig.4　The transfection of pEGFP-BMPR-IB into goat fibroblast cells 100×

2.4轉(zhuǎn)染pEGFP-BMPR-IB山羊成纖維細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

利用實(shí)時熒光定量PCR方法對轉(zhuǎn)染48 h后遼寧絨山羊成纖維細(xì)胞中BMPR-IB基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組做為空白(對照組)，以GAPDH做為內(nèi)參基因。定量結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后BMPR-IB表達(dá)量有所增加。當(dāng)Lipofectamine LTX用量為12 μL，質(zhì)粒用量為2.5 μg，PLUS用量為3 μL時，試驗(yàn)組BMPR-IBmRNA的表達(dá)量顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)(圖5)。

圖5　相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的變化Fig.5　The relative expression change of different genes

以GAPDH做為內(nèi)參基因，利用實(shí)時熒光定量方法分別對未轉(zhuǎn)染和pEGFP-BMPR-IB質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染遼寧絨山羊成纖維細(xì)胞中BMP4、GDF5、INH、IGF-I、TLR4、IFN、MHC和PNRP基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果，轉(zhuǎn)染組IGF-I基因表達(dá)量顯著高于空白組(P<0.01)；BMP4基因表達(dá)量基本無變化(P>0.05)， 轉(zhuǎn)染組GDF5、INH、TLR4、IFN、MHC、PNRP基因表達(dá)量顯著低于空白組(P<0.01)(圖5)。

2.5pEGFP-BMPR-IB轉(zhuǎn)染山羊成纖維細(xì)胞中相關(guān)基因蛋白水平的表達(dá)

轉(zhuǎn)染72 h后分別收集空白對照和轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取蛋白后，分別利用Western blot方法對BMPR-IB、IGF-I、BMP4和TLR4蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖6、圖7。

圖6　相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.6　The expression of different proteins

圖7　部分蛋白相對表達(dá)量的變化Fig.7　The relative expression change of different proteins

由圖6、7均可以看出，相對于空白對照組，瞬時轉(zhuǎn)染組BMPR-IB、IGF-I的表達(dá)均有所升高但差異均不顯著(P>0.05)，BMP4和TLR4的表達(dá)略有降低，差異也不顯著(P>0.05)。

綜合看，轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染租BMPR-IB、IGF-I、BMP4和TLR4的mRNA和蛋白水平表達(dá)趨勢基本趨于一致。

3　討　論

本研究采用分子克隆技術(shù)，通過在上、下游引物兩端分別引入BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基進(jìn)行擴(kuò)增，直接對RT-PCR產(chǎn)物和pEGFP-N2質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和EcoR I雙酶切、回收，用T4連接酶進(jìn)行16 ℃過夜連接、轉(zhuǎn)化、克隆、酶切及測序鑒定構(gòu)建載體，相比于克隆目的基因后，再進(jìn)行酶切、連接，構(gòu)建載體省時省力；PCR擴(kuò)增和雙酶切產(chǎn)物電泳及測序后均證實(shí)重組真核表達(dá)載體 pEGFP-BMPR-IB構(gòu)建成功。

試驗(yàn)過程中利用組織塊貼壁法進(jìn)行遼寧絨山羊耳組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，根據(jù)上皮樣細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對胰酶消化敏感性的不同，采用低濃度胰蛋白酶作用分離純化成纖維細(xì)胞，經(jīng)2～3次傳代得到了高純度的成纖維細(xì)胞，為后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究提供了保障。

試驗(yàn)將成功構(gòu)建的重組pEGFP-BMPR-IB經(jīng)Lipofectamine LTX & PLUS介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染絨山羊耳組織成纖維細(xì)胞，并分別提取RNA和蛋白對BMPR-IB等基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，定量和蛋白檢測結(jié)果均表明，BMPR-IB表達(dá)量有所增加，成功實(shí)現(xiàn)了小尾寒羊BMPR-IB(BB型)基因在山羊成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，為轉(zhuǎn)BMPR-IB基因陽性細(xì)胞株和細(xì)胞系的建立提供了基礎(chǔ)。

應(yīng)用成纖維細(xì)胞進(jìn)行核移植生產(chǎn)體細(xì)胞克隆動物具有許多優(yōu)勢，但克隆中存在孕期流產(chǎn)率高、圍產(chǎn)期死亡率高、胎兒過度生長以及出生后生長異常等問題。甚至有些克隆動物在出生后不久死亡，并表現(xiàn)出某些器官發(fā)育異常。李世杰對成纖維細(xì)胞克隆新生死亡牛器官中的染色質(zhì)修飾基因、類胰島素生長因子系統(tǒng)等22個對發(fā)育有重要作用的基因表達(dá)差異進(jìn)行研究，認(rèn)為它們的異常表達(dá)可能是造成克隆動物出生死亡和器官發(fā)育異常的原因[20]。瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)BMPR-IB基因細(xì)胞中，繁殖、生長發(fā)育以及抗病基因的表達(dá)是否也存在異常呢？ IGF-I具有類似于胰島素樣的生物合成代謝功能，一方面可提高組織攝取葡萄糖的能力，另一方面抑制肝糖原的分解并促進(jìn)肝糖原及肌糖原的合成，同時，IGF-I本身又是生長激素的介質(zhì)，具有促進(jìn)生長的作用。BMP4除作為形態(tài)發(fā)生過程的信號因子外，還能促進(jìn)或維持有關(guān)組織的細(xì)胞分裂。而TLR4 作為TLRs家族成員之一，能夠識別革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分中的脂多糖和脂磷壁酸，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘發(fā)炎癥因子(例如TNF-α、IL-1、IL-6)與Type I型IFN的產(chǎn)生[21]。TypeⅠ型 IFN可以在病毒復(fù)制的任何階段發(fā)揮作用，由于其在天然免疫與獲得性免疫中具有抗病毒的活性與調(diào)節(jié)功能，Ⅰ型IFN能夠通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞、T 細(xì)胞等重要的免疫細(xì)胞來發(fā)揮功能，是連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，在抗病毒和其他型的感染與免疫方面具有重要的作用[22]。試驗(yàn)分別對BMP4、GDF5、INH、IGF-I、TLR4、IFN、MHC和PNRP等的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染BMPR-IB基因后，IGF-I基因表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；TLR4、IFN、MHC、PNRP、GDF5、INH基因表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，表明BMPR-IB基因的過表達(dá)可上調(diào)IGF-I的表達(dá)，下調(diào)TLR4、IFN、MHC、PNRP、GDF5、INH基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中生長發(fā)育相關(guān)IGF-I表達(dá)量的升高，免疫相關(guān)的TLR4、IFN、MHC和PNRP基因的表達(dá)降低，是否和體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因羊后代存在的體型大，先天免疫力低，抗病性差存在關(guān)聯(lián)，需進(jìn)一步研究。

基因表達(dá)分為轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個層面，即mRNA和蛋白水平。試驗(yàn)中因未能找到合適的抗體，只對BMPR-IB、BMP4、IGF-I和TIR4基因的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時間和位點(diǎn)存在時空間隔，而轉(zhuǎn)錄后又會有轉(zhuǎn)錄后加工，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解、翻譯、翻譯后加工及修飾等幾個層面，所以轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平并不完全一致。本試驗(yàn)中，未轉(zhuǎn)染組BMPR-IB、IGF-I和TLR4基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)趨勢趨于一致，而BMP4基因mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化剛好相反，可能是由于BMP4蛋白的表達(dá)還在增加中。

基因的表達(dá)受多種因素影響，BMPR-IB基因的過表達(dá)直接或間接通過某個途徑導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中BMP4、GDF5、INH、IGF-I、TLR4、IFN、MHC和PNRP等基因表達(dá)的變化，其具體原因還需進(jìn)一步研究。

4　結(jié)　論

本研究成功克隆了小尾寒羊BB型BMPR-IB(即FecB)基因完整編碼區(qū)，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pEGFP-BMPR-IB，并實(shí)現(xiàn)了其在山羊成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，為轉(zhuǎn)BMPR-IB基因陽性細(xì)胞株和細(xì)胞系的建立提供了基礎(chǔ)；RT-PCR和Westen blotting檢測表明，BMPR-IB基因在山羊成纖維細(xì)胞中的表達(dá)能上調(diào)IGF-I和下調(diào)TLR4基因的表達(dá)，具體原因需進(jìn)一步研究。

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(編輯郭云雁)

Cloning and Expression ofBMPR-IBGene in Cashmere Goat Fibroblast Cells

SUN Hong-xin1，2，WANG Hong-na1，ZHANG Ying-jie1*，LIU Yue-qin1，CHEN Xiao-yong2，DUN Wei-tao2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071001，China；2.HebeiInstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，Baoding071000，China)

The research was conducted to cloneBMPR-IBgene coding sequence of the Small-tailed Han sheep with BB genotype，construct the recombinant eukaryotic expression vectorwhich was transiently transfected into cashmere goat fibroblast cells，and detect the expression ofBMPR-IBand other genes.TheBMPR-IBgene was amplified by RT-PCR and the eukaryotic expression vector pEGFP-BMPR-IB was constructed by cloningBMPR-IBgene fragments into the pEGFP-N2vector frame，which were followed by the transfer of recombinant plasmids into goat fibroblast cells by liposome Lipofectamine LTX&PLUS.After transfection for 48 and 72 h，transfection cells were collected to extract RNA and total protein.Real-time quantitative PCR and Western blot approachs were used to identify the expression level of target genes and other related genes.The results showed thatBMPR-IBgene which was amplified including CDS region was about 1 550 bp in length，and highly homologous with the published sequences.Real-time PCR detection results showed that the expression ofBMPR-IBgene in transgenic cells were significantly higher than that in control group (P<0.01).The expression level ofIGF-Igene in transfected cells were significantly higher than that in control group (P<0.01)，while the expression ofTLR4，IFN，MHC，PNRP，GDF5 andINHgenes were significantly lower (P<0.01).Western blot detection results showed that the expression of BMPR-IB and IGF-I in transgenic cells was higher than that in control group，although the expression of BMP4 and TLR4 decreased，the difference did not reach significant level (P>0.05).The result showed that expression vector ofBMPR-IBwas constructed successfully and the expression ofBMPR-IBgene in goat fibroblast cells was realized，which provide the basis for the preparation of positive cell strains，cell lines and transgenic animals.It is also concluded that the over-expression ofBMPR-IBgene up-regulates theIGF-Iexpression and down-regulates theTLR4 expression in transfected cells.

BMPR-IBgene；eukaryotic expression vector；cashmere goat fibroblast cells；expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.006

2015-11-05

國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項目(CARS-39)

孫洪新(1978-)，女，山東臨清人，高級畜牧師，博士生，主要從事羊遺傳繁育研究，E-mail：sdlqshx@126.com

張英杰，教授，博導(dǎo)，主要從事羊遺傳育種及營養(yǎng)研究，E-mail：zhangyingjie66@126.com

S827；S813.3

A

0366-6964(2016)06-1124-09