張　方，胡子喬，景炅婕，潘洋洋，喬利英，李寶鈞，劉建華，劉文忠

(山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801)

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綿羊不同部位脂肪組織microRNA高通量測序及生物信息學分析

張方#，胡子喬#，景炅婕，潘洋洋，喬利英，李寶鈞，劉建華，劉文忠*

(山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801)

本研究旨在挖掘綿羊不同脂肪組織中特異表達的miRNAs。構(gòu)建腎周(PEF)、皮下(SUF)和尾部(TAF)脂肪組織的3個小RNA文庫，利用Solexa測序技術(shù)進行測序，用Stem-loop qRT-PCR技術(shù)和生物信息學方法對測序結(jié)果進行驗證和分析。結(jié)果表明，8個隨機選擇的miRNAs中有7個miRNAs的表達與測序結(jié)果一致。在腎周和皮下脂肪組織的sRNA文庫中分別檢測到128和112個保守miRNAs，分別發(fā)現(xiàn)198和196個新miRNAs。結(jié)合前期在尾脂中檢測到miRNAs的分析結(jié)果，腎周脂肪中特異表達的有12個保守的和66個新miRNAs；皮下脂肪中特異表達的保守和新miRNAs分別為1個和30個；尾脂中特異表達的保守和新miRNAs分別為1個和34個。上述結(jié)果將為進一步研究miRNA調(diào)控綿羊的脂肪代謝提供科學依據(jù)。

綿羊；脂肪組織；microRNA；Solexa測序；生物信息學方法

miRNA是一類廣泛存在于動植物中，具有全局調(diào)控作用，長約22 nt的內(nèi)源性非編碼的單鏈小RNA分子。它們通過調(diào)控基因表達，廣泛參與細胞的分化、增殖與凋亡、個體發(fā)育與器官形成等眾多生物學過程，所以被稱為多細胞生物中最主要的基因表達調(diào)控因子[1-2]。然而，其調(diào)控基因表達的主要方式是通過與靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)的特異性堿基互補配對，進而引起靶mRNA降解、穩(wěn)定性下降或者翻譯抑制[3-4]。研究綿羊脂肪組織miRNA表達譜和特征對于進一步揭示其在綿羊脂肪細胞增殖、分化和凋亡中的作用及其機理具有重要意義。

脂肪是人和動物貯存能量最主要的形式。然而對于肉用動物來說，脂肪的過量或過少沉積均會影響人和動物健康，或者影響肉的品質(zhì)和風味。所以，對肉用動物脂肪代謝的研究至關(guān)重要。miRNA在脂肪代謝中的作用首先在果蠅中報道。miR-14的缺失可引起果蠅細胞凋亡和表型特征的改變，脂肪細胞的脂滴增大，三酰甘油和二酰甘油的水平升高[5]。隨后的研究表明，miR-335在脂質(zhì)加工過程中表達上調(diào)，且在肥胖小鼠的脂肪組織中高度表達[6]。miR-143是最早發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)脂肪細胞分化的miRNA。有人研究發(fā)現(xiàn)，miR-143抑制劑可以抑制人類脂肪細胞的分化并下調(diào)PPARγ2、FABP和GLUT4基因的表達[7]。此外，體外研究表明，miR-143可促進牛的成纖維樣前體脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞[8]。此外，還有很多miRNAs在脂類代謝中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[9-10]。這表明miRNA對脂肪代謝具有重要調(diào)控作用。

目前，miRNA在小鼠、人、豬、牛等動物的脂肪代謝過程中的研究都有大量報道，但在綿羊脂肪代謝中的研究僅見少量文獻報道。本研究擬通過對綿羊脂肪組織小RNA進行Solexa測序，并進行Stem-loop RT-PCR驗證和生物信息學分析，挖掘在脂肪組織中特異表達的miRNAs，為進一步研究miRNA調(diào)控綿羊脂肪代謝過程提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

試驗羊為8只飼養(yǎng)管理條件一致的10月齡廣靈大尾羊，公母各半。對其進行屠宰，宰后迅速采集皮下(SUF)、尾部(TAF)和腎周脂肪(PEF)樣品，分別裝入無RNase的離心管中，立即置于液氮中保存，用于總RNA的提取。本試驗中屠宰程序和飼養(yǎng)管理按照中華人民共和國國家標準(GB13078-2001和GB/T17237-1998)和農(nóng)業(yè)行業(yè)標準(NY 5148-2002)進行。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及Solexa測序樣品在液氮中研磨至粉末狀，然后按照Trizol(Invitrogen，Gaithersburg，MD，USA)法提取綿羊脂肪組織總RNA。將4只公羊的總RNA放入泡沫盒中用干冰作為保護劑密封送往深圳華大基因科技有限公司完成文庫的構(gòu)建：先檢測所送樣品的質(zhì)量及濃度，合格的miRNA 利用15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(PAGE)從總RNA中分離小片段(15～30 nt)RNA，純化后對分離的小片段RNA連接3′和5′接頭。由此構(gòu)建皮下、尾部和腎周脂肪3個小RNA(sRNA)文庫。再運用SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶將連接有5′和3′接頭的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。然后，進行PCR擴增，擴增程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，14個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。最后，擴增產(chǎn)物用Solexa高通量測序方法測序。

1.2.2生物信息學分析

1.2.2.1綿羊保守miRNAs的鑒定：對上述測序獲得的原始序列數(shù)據(jù)進行去接頭、去低質(zhì)量、去污染等過程的處理，然后統(tǒng)計序列總數(shù)(total)、種類(unique)和長度分布，最后得到的全部有效序列用于后續(xù)分析。將有效序列用SOAP軟件與NCBI的綿羊基因組進行比對注釋，分析sRNA在基因組上的表達與分布情況。與GenBank和Rfam(12.0)數(shù)據(jù)庫進行比對，注釋測序后的sRNA序列(這兩個數(shù)據(jù)庫間的優(yōu)先級為GenBank>Rfam)，盡可能發(fā)現(xiàn)并去除rRNA、tRNA、scRNA、snoRNA、snRNA等非編碼小RNAs。用tag2repeat軟件將sRNA與重復(fù)序列進行比對，得到repeat associate sRNA。將sRNA與mRNA的外顯子和內(nèi)含子序列進行比對，找出來自mRNA的降解片段。這些降解片段就是sRNA。與miRBase 21.0中已知的綿羊miRNA的成熟序列或前體序列進行比對并注釋，得到物種內(nèi)保守的miRNAs及其含量，并統(tǒng)計這些miRNAs各位點的堿基分布。本研究中，僅分析PEF和SUF兩個文庫的測序結(jié)果，關(guān)于TAF的測序分析結(jié)果參見文獻[11]。

1.2.2.2統(tǒng)計不同部位脂肪組織中特異表達的miRNA：根據(jù)測序結(jié)果分別統(tǒng)計3個不同部位脂肪組織中有表達的保守miRNAs和新miRNAs，用Venny2.0.2(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)軟件做韋恩圖，分析統(tǒng)計特異表達的miRNAs。

1.2.3綿羊新miRNAs的預(yù)測由于miRNA前體帶有的標志性發(fā)夾結(jié)構(gòu)能夠用來預(yù)測新的miRNA，所以對在GenBank和Rfam(12.1)數(shù)據(jù)庫中沒有比對上任何注釋信息的sRNA，根據(jù)綿羊基因組數(shù)據(jù)，利用商用軟件Mireap(http：//sourceforge.net/projects/mireap/)分析其發(fā)夾結(jié)構(gòu)、Dicer酶切位點信息及能量等特征。預(yù)測標準：首先，篩選miRNA的成熟體必須位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干部位，且序列長度介于20～24 nt；其次，Drosha和Dicer酶的剪切位點至少在3個堿基以上；最后，允許候選miRNA前體最小自由能不能大于-75.24 kJ·mol-1[12]。 1.2.4Stem-loop qRT-PCR驗證 用于測序結(jié)果驗證的樣本為8只廣靈大尾羊。從測序結(jié)果中隨機選取8個miRNAs，以U6 snRNA作為內(nèi)參基因[13]，根據(jù)這8個miRNAs的成熟序列設(shè)計反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR引物。利用SYBR PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqⅡ定量試劑盒，對目標miRNAs在綿羊脂肪組織中的表達進行檢測。檢測嚴格參照試劑盒說明書進行，相對表達量結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行計算[14-15]。miRNA引物及內(nèi)參基因序列見表1。

表1miRNAs PCR引物序列及U6引物序列

Table 1PCR primer sequences for miRNAs and U6 primer sequence

miRNAs和內(nèi)參基因miRNAsandreferencegene引物序列(5'-3')PrimersequencemiR-103F:ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGTACAGGR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCATAGCCCmiR-143F:ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCACTGR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAGCTACAmiR-191F:ACACTCCAGCTGGGCAACGGAATCCCAAAAR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCTGCTTmiR-23aF:ACACTCCAGCTGGGATCACATTGCCAGGGAR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGGAAATCmiR-25F:ACACTCCAGCTGGGATTGCACTTGTCTCGR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGACCGmiR-30a-5pF:ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGACTR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCTTCCAGmiR-3958-3pF:ACACTCCAGCTGGGAGATATTGCACGGTTGR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGAGATCAmiR-432F:ACACTCCAGCTGGGTCTTGGAGTAGGTCATTR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCACCCAAU6F:CTCGCTTCGGCAGCACAR:AACGCTTCACGAATTTGCGT統(tǒng)一反向引物UnifiedreverseprimerTGGTGTCGTGGAGTCG

F.上游引物；R.下游引物

F.Forward；R.Reverse

2　結(jié)　果

2.1Solexa測序結(jié)果

經(jīng)Solexa測序和生物信息學分析，去除接頭，去除污染及低質(zhì)量序列后，PEF和SUF兩文庫分別得到了13 479 569和11 589 758條清潔序列，結(jié)果見表2。

表2小RNA測序質(zhì)量

Table 2Summary of cleaning of reads produced by sRNA sequencing

讀段類型TypeofreadsPEFSUF數(shù)量Count百分比/%Percent數(shù)量Count百分比/%Percent總讀值Totalreads1503470412899073高質(zhì)量讀值Readswithhighquality13621845100.0011674608100.003'接頭缺失Readswithnull3'adaptor253530.19130730.11插入缺失讀值Readswithindels42940.0356000.055'接頭污染的讀值5'adaptorcontaminants537960.39415390.36小于18nt讀值Readsshorterthan18nt587810.43244110.21含有Poly(A)的序列Readswithpoly(A)520.002270.00干凈讀值Cleanreads1347956998.961158975899.27

統(tǒng)計2個sRNA文庫中所有sRNA序列的長度分布，大部分序列長度都集中在21～24 nt(圖1)，其中，長度為22 nt的序列頻率最高，在PEF和SUF文庫中分別占60.35%和56.74%；其次是23 nt，頻率分別為20.67%和21.90%。

圖1　皮下和腎周脂肪組織中sRNA的長度分布Fig.1　Length distribution of sRNA in subcutaneous and perirenal adipose tissues

2.2小RNA的分類注釋結(jié)果

將測序得到的所有序列數(shù)據(jù)與GenBank、Rfam、intron、exon和重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫進行比對，將比對到數(shù)據(jù)庫中的sRNA進行注釋，沒有比對上任何注釋信息的用unann表示。隨后分別統(tǒng)計PEF和SUF文庫中小RNA的種類及數(shù)量，結(jié)果見圖2?？梢姡琍EF和SUF文庫都以miRNA的數(shù)量最多，所占的比例分別為64.54%和63.24%；無注釋信息的sRNA分別占29.58%和30.10%；其他種類的RNAs含量較低。

將2個文庫與綿羊基因組進行比對，結(jié)果見表3。其中，Unique sRNAs表示clean reads中所有sRNA的種數(shù)及比對上基因組的sRNA的種數(shù)；Total sRNAs表示clean reads中所有sRNA的總數(shù)及比對上基因組的sRNA的總數(shù)?？梢?，腎周和皮下脂肪組織文庫中比對上基因組的sRNA種數(shù)所占的比例分別為18.13%和14.64%，而比對上基因組的sRNA總數(shù)所占的比例分別為73.4%和71.73%。

圖2　廣靈大尾羊腎周(A)和皮下(B)脂肪組織文庫中小RNA的分類注釋Fig.2　Annotation of small RNAs in perirenal (A) and subcutaneous (B) adipose tissues of Guangling Large-tailed sheep

表32個文庫中小RNA基因組比對分析

Table 3Genomic alignment of sRNAs from 2 libraries

組織Tissue項目ItemsRNA種數(shù)UniquesRNAs百分比/%PercentsRNA總數(shù)TotalsRNAs百分比/%Percent腎周脂肪PEF小RNA總量436880100.0013479569100.00比對上基因組部分7918618.13989337073.40皮下脂肪SUF小RNA總量538565100.0011589758100.00比對上基因組部分7885014.64831337971.73

2.3保守miRNA鑒定

將有效去除rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和repeat等非編碼小RNAs后的剩余序列比對到miRBase21.0中綿羊已知miRNA的成熟序列或前體序列(默認G-U配對，允許1～2個堿基錯配)，從而得到綿羊基因組中保守的miRNAs，并分析已知miRNAs各位點的堿基偏向性，結(jié)果見圖3。PEF和 SUF兩個sRNA文庫中首堿基都偏向U，頻率分別為95.42%和95.92%；其次為A，頻率分別為3.94%和3.47%；C和G出現(xiàn)的頻率較低。其他各位點的堿基分布基本一致，并且2個文庫中的第1、9和末端位點處富含U堿基。

統(tǒng)計綿羊保守miRNAs，結(jié)果見表4?？梢姡琺iRBase21.0中綿羊有153個保守miRNAs成熟序列和105個miRNA前體序列。

廣靈大尾羊PEF文庫中獲得128個保守miRNAs，其中有51個直接匹配上目標序列的miRNAs，33個由前體miRNA的5′端剪切而來的miRNA-5p和44個由前體miRNA的3′端而來的miRNA-3p；SUF文庫中獲得112個保守miRNAs，其有50個直接匹配上目標序列的miRNAs，28個由前體miRNA的5′端剪切而來的miRNA-5p和34個由前體miRNA 3′剪切而來的miRNA-3p組成。

表42個小RNA文庫中的已知miRNA和發(fā)夾數(shù)

Table 4Number of conserved miRNAs and their hairpins from 2 libraries

數(shù)據(jù)庫DatabasemiRNAsmiRNA-5pmiRNA-3pmiRNAs總數(shù)TotalmiRNAs發(fā)夾數(shù)NumberofhairpinmiRBase525051153105PEF513344128102SUF50283411295

圖3　廣靈大尾羊腎周(A)和皮下(B)脂肪組織文庫中miRNAs片段各位點堿基的偏向性Fig.3　Nucleotide bias at each position of miRNAs in perirenal (A) and subcutaneous (B) adipose tissues of Guangling Large-tailed sheep

表4中還依次列出了PEF和SUF文庫中匹配上已知miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)上的sRNA數(shù)量，分別為102和95。進一步分析表明，這2個文庫中保守的miRNAs都屬于50個miRNA家族，而且這些家族在多個物種中都表現(xiàn)出了保守性。如let-7、miR-8、miR-10、miR-25和 miR-133家族分別在75、68、76、73 和 69個物種中被發(fā)現(xiàn)。

對3個sRNA文庫中的保守miRNA進行比較發(fā)現(xiàn)，在PEF中特異表達的有12個miRNAs，分別是miR-1197-3p、miR-370-3p、miR-376a-3p、miR-377-3p、miR-381-3p、miR-3956-3p、miR-3957-5p、miR-3959-3p、miR-412-5p、miR-431、miR-433-5p、miR-487a-5p；SUF中特異表達的只有1個miRNA(miR-329b-5p)，TAF中特異表達的也只有1個miRNA(miR-411b-5p)(圖4A)。

圖4　廣靈大尾羊腎周(PEF)、皮下(SUF)和尾部脂肪(TAF)中特異表達的保守miRNAs(A)和新miRNAs(B)Fig.4　Conservative (A) and novel (B) miRNAs specifically expressed in perirenal (PEF)，subcutaneous (SUF) and tail fat (TAF) of Guangling Large-tailed sheep

2.4預(yù)測的綿羊新miRNAs

將與miRBase 21.0中綿羊的保守miRNAs沒有比對上，但利用miReap軟件篩選出具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列作為綿羊新miRNA的候選序列。PEF和SUF文庫中均有220個候選序列。進一步與miRBase 21.0中所有物種的保守miRNAs比對，2個文庫中依次得到198和196個新miRNAs。隨后，分析這些新miRNAs在3種不同脂肪組織中的特異性表達情況，結(jié)果見圖4B。可見，在PEF、SUF和TAF中特異表達的新miRNAs分別有66、30和34個。并且，這些新miRNAs的長度為20～24 nt，最小自由能(MFE)為-75.24～-294.69 kJ·mol-1。

2.5Stem-loop RT-PCR驗證結(jié)果

隨機選擇的8個miRNAs在綿羊3種脂肪組織中的相對表達量列于圖5A。這些miRNAs在綿羊脂肪組織中都有表達，且除miR-23a外，組織間的差異表達趨勢與Solexa測序的結(jié)果(圖5B)一致。腎周脂肪中，miR-23a在驗證時的高表達和測序時的低表達存在著明顯的不同。

圖5　隨機選取的8個miRNAs在廣靈大尾羊3種脂肪組織中的定量表達量(A)和測序表達量(B)Fig.5　Expressions by quantification (A) and sequencing (B) of 8 randomly selected miRNAs in 3 adipose tissues of Guangling Large-tailed sheep

3　討　論

目前，高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于家畜小RNA組學研究[16-17]。利用高通量測序，可以發(fā)現(xiàn)新的miRNAs，也可以鑒別已知的miRNAs，并研究其功能機制。本研究采用Solexa測序技術(shù)，在廣靈大尾羊的腎周和皮下脂肪組織中分別發(fā)現(xiàn)了128和112個已知的miRNAs以及198和196個新miRNAs。本課題組前期在廣靈大尾羊尾脂中發(fā)現(xiàn)了113個保守miRNAs和184個新miRNAs[11]，這些結(jié)果將為深入研究綿羊脂肪組織中miRNA的作用機制提供試驗依據(jù)。

對高通量測序結(jié)果進行定量PCR驗證是基因組學研究的重要步驟之一。本研究隨機選取在3種脂肪組織中都有表達的8個miRNAs，用Stem-loop qRT-PCR技術(shù)檢測測序結(jié)果的準確性。其中的7個miRNAs的表達趨勢與Solexa測序結(jié)果一致。這表明測序結(jié)果具有一定的準確性和可靠性。但miR-23a驗證時在腎周脂肪中高表達，但測序時卻發(fā)生低表達。這種不一致的情況在其他研究中也有報道。如在豬的背部脂肪組織中，miR-1a實時定量PCR時的表達量與測序中的表達量不一致[18]。這些不一致的結(jié)果可能與測定方法有關(guān)[18]。

miRNA堿基的分布可能與miRNA的作用機制，如對靶基因的調(diào)控有關(guān)。本研究中，2個sRNA文庫中已知miRNA的首位堿基都偏向U。這與對廣靈大尾羊TAF文庫的分析結(jié)果[11]一致。研究表明，5′端堿基為U有利于RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體中miRNA與Agol蛋白的結(jié)合，進而有利于該復(fù)合體對靶mRNA的特異性切割[19]。2個文庫中的第1、9和末端位點處富含U堿基，這與B.Zhang等[20]報道的結(jié)果一致。第2～8位點各堿基分布的趨勢是一致的，因為成熟miRNA的第2～8位點被稱作種子序列，這一區(qū)域具有高度的保守性，miRNA的靶標基因可能會隨著這個區(qū)域堿基的改變而不同[16]。

在鑒別出的保守miRNAs中，有12個特異表達于腎周脂肪，而只有miR-329b-5p和miR-411b-5p分別特異表達于皮下和尾部脂肪。其中，部分miRNAs的作用已有研究報道。miR-433和miR-431由PEG11as基因編碼[21]，該基因是一個印記基因，在Callipyge綿羊骨骼肌中以一個全長蛋白的形式表達[22]，促進肌肉發(fā)育，同時上調(diào)miR-433和miR-431的表達，進而抑制脂肪的生成。miR-487b能直接靶向胰島素受體底物1(Insulin receptor substrate1，IRS1)的3′UTR區(qū)，下調(diào)IRS1表達[23]。而IRS1能增強胰島素的功能[24]。由此，miR-487b減弱胰島素的作用，從而抑制脂肪生成。miR-376a和miR-376c抑制胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)的表達[25]，而IGF1R則促進脂肪組織的生成[26]，由此推斷，miR-376a/c也可抑制脂肪組織的生成。此外，miR-370直接靶向肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1α(Carnitine palmitoyl transferase 1α，Cpt1α)的3′UTR區(qū)，且下調(diào)Cpt1α的表達[27]。而Cpt1α促進脂肪酸β氧化[28]，所以得出，miR-370能抑制脂肪酸β氧化。

分別在廣靈大尾羊皮下和尾部脂肪中特異表達的miR-329b-5p和miR-411b-5p的作用主要與脂肪生成有關(guān)。miR-329可以促進過氧化物酶增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ)表達[29]，而PPARγ可促進脂肪細胞分化[30]，因此，miR-329對脂肪細胞的分化有一定促進作用。過表達miR-411能降低肌球蛋白重鏈1(MYH1)的表達[31]，說明，miR-411與MYH1的編碼基因存在靶標關(guān)系。而MYH1能提高人類脂肪源間充質(zhì)干細胞向肌源性細胞分化潛能[32]。所以，推斷miR-411可抑制人類脂肪源間充質(zhì)細胞向肌源性細胞分化。

基于上述研究，推測廣靈大尾羊3個部位脂肪組織中特異表達的這些miRNAs在綿羊脂肪調(diào)控中發(fā)揮著不同作用。由于腎周脂肪組織屬于深層脂肪組織，脂肪代謝比較活躍，其特異表達的這些miRNAs的功能多為抑制脂肪生成，少數(shù)抑制脂肪酸氧化；而皮下和尾部是綿羊脂肪組織的主要儲積場所，這些脂肪組織屬淺層脂肪組織，其特異表達的2個miRNAs的功能均為促進脂肪生成。

在發(fā)現(xiàn)的新miRNAs中，有66個在腎周脂肪中特異表達，30個在皮下脂肪中特異表達，34個在尾部脂肪中特異表達。這為挖掘與綿羊脂肪代謝的相關(guān)miRNAs提供了科學依據(jù)。但目前還沒有文獻報道這些新miRNAs在脂肪代謝中的具體作用，其功能尚需進一步研究。

4　結(jié)　論

通過高通量測序和生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)了一些在腎周、皮下和尾部脂肪中特異表達的保守miRNAs和新miRNAs。這些miRNAs在不同部位脂肪組織中發(fā)揮著不同作用，在腎周脂肪組織中特異表達的miRNA的功能多為抑制脂肪生成，而在皮下和尾部脂肪組織中特異表達的2個miRNAs的功能均為促進脂肪生成。

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(編輯郭云雁)

High-throughput Sequencing and Bioinformatics Analysis on microRNAs Expressed in Adipose Tissues of Sheep

ZHANG Fang#，HU Zi-qiao#，JING Jiong-jie，PAN Yang-yang，QIAO Li-ying，LI Bao-jun，LIU Jian-hua，LIU Wen-zhong*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

This study aimed to find tissue-specifically expressed miRNAs in ovine adipose tissues.Three small RNA (sRNA) libraries from perirenal，subcutaneous and tail adipose tissues were built for Solexa sequencing.The sequencing results were validated by Stem-loop qRT-PCR technology and further analyzed by bioinformatics methods.The PCR results shown that seven in eight randomly selected miRNAs were consistent with the sequencing results.In perirenal and subcutaneous adipose tissues，128 and 112 conserved miRNAs were obtained，198 and 196 novel miRNAs were found，respectively.Combined with the previous analysis results of miRNAs detected in tail adipose tissue，12 conserved and 66 novel miRNAs were specifically expressed in perirenal adipose tissue；one conserved and 30 novel miRNAs were specifically expressed in subcutaneous adipose tissue；and one conserved and 34 novel miRNAs were specifically expressed in tail adipose tissue.These results provide scientific bases for further research on the regulatory role of miRNA in fat metabolism.

sheep；adipose tissues；microRNA；Solexa sequencing；bioinformatics methods

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.003

2015-12-23

國家自然科學基金(31372292)；山西省研究生優(yōu)秀創(chuàng)新項目(2015SY28)

張方(1989-)，女，河南商丘人，碩士生，主要從事肉用綿羊的分子遺傳育種研究，E-mail：zhangfycyz@163.com；胡子喬(1991-)，女，黑龍江伊春人，碩士生，主要從事肉用綿羊分子遺傳育種研究，E-mail：ziqiaohu@163.con。二者并列為第一作者

劉文忠，教授，E-mail：tglwzyc@163.com

S813.3；S826

A

0366-6964(2016)06-1093-09