黃　鑫，梁劍平，高旭東，郝寶成

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

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苦馬豆素的來(lái)源、藥理作用及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

黃鑫，梁劍平，高旭東，郝寶成*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

吲哚里西啶類生物堿苦馬豆素是瘋草及其內(nèi)寄生真菌的代謝產(chǎn)物，其有良好的抗病毒、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫力的作用，具有巨大的藥用潛力。作者簡(jiǎn)要闡述了苦馬豆素的藥理作用、檢測(cè)方法、藥用價(jià)值和研發(fā)潛力，并對(duì)其來(lái)源及瘋草內(nèi)生真菌合成苦馬豆素的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以期豐富苦馬豆素的來(lái)源，為其在科研和醫(yī)療上的廣泛應(yīng)用提供保障。

苦馬豆素；來(lái)源；藥理作用；檢測(cè)方法；內(nèi)生菌合成

VeterinaryPharmaceuticalDevelopmentofMinistryofAgriculture，LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalSciencesofCAAS，Lanzhou730050，China)

苦馬豆素(swainsonine，SW)是一種吲哚里西啶類生物堿，是從部分瘋草植物及其內(nèi)生真菌中提取出來(lái)的具有抗病毒、抗腫瘤和提高免疫力等生物活性的生物堿，也是引起家畜瘋草中毒的主要原因。自20世紀(jì)70年代首次分離獲得苦馬豆素純品以來(lái)，其功能和藥理作用受到人們的廣泛關(guān)注。據(jù)相關(guān)報(bào)道，直接投喂或者注射SW均能引起山羊、綿羊、家兔和大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)相似的病理癥狀，出現(xiàn)的病理癥狀均是由SW競(jìng)爭(zhēng)性抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)溶酶體α-甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶Ⅱ的活性引起的，進(jìn)而使動(dòng)物體中低聚糖代謝紊亂、糖蛋白合成受阻、組織細(xì)胞空泡化，相關(guān)組織器官的功能紊亂甚至喪失，最終導(dǎo)致動(dòng)物的中毒或死亡[1-4]。

此外，SW 還具有良好的抗腫瘤、抗病毒和提高免疫力等藥理作用。陳基萍等[5]研究發(fā)現(xiàn)苦馬豆素還有一定的抑菌作用。但由于苦馬豆素來(lái)源有限、人工合成困難、提取效率低、真菌發(fā)酵技術(shù)不成熟及市場(chǎng)價(jià)格昂貴等原因，限制了其在抗病毒、抗腫瘤等領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展[6-7]。

1　苦馬豆素的來(lái)源

苦馬豆素的結(jié)構(gòu)為吲哚里西啶環(huán)1，2，8 位上各連有一個(gè)活性羥基基團(tuán)，故被稱為1，2，8-三羥基八氫吲哚里西啶或吲哚里西啶三醇。SW具有良好的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，因此備受相關(guān)領(lǐng)域的關(guān)注。但是，SW的來(lái)源一直是限制其在各領(lǐng)域發(fā)展的重要因素。SW的主要來(lái)源大概分為三種：化學(xué)合成、植物中提取和內(nèi)生真菌發(fā)酵。

1.1化學(xué)合成苦馬豆素

由于SW 具有良好的生物活性而天然來(lái)源含量很低，因此引起化學(xué)家對(duì)其實(shí)驗(yàn)室合成的極大興趣。自從1984年對(duì)SW 進(jìn)行首次全合成以來(lái)，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了四十多種化學(xué)合成路線[8]，但由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)環(huán)共同分享一個(gè)碳原子和一個(gè)氮原子，且環(huán)上含有3個(gè)羥基基團(tuán)，構(gòu)成了4個(gè)手性碳原子，所以對(duì)其進(jìn)行手性全合成難度很大。將現(xiàn)有的合成方法總結(jié)歸納，可分為以下四類：

1.1.1利用烯烴復(fù)分解反應(yīng)合成SW 的中間體吲哚里西啶環(huán)，該類反應(yīng)的關(guān)鍵在于將含有雜原子氮和氧的環(huán)狀手性烯烴化合物經(jīng)過釕催化烯烴復(fù)分解反應(yīng)，合成SW 的中間體吲哚里西啶環(huán)。典型反應(yīng)是N.Buschmann等[9]以具有手性的噁唑烷酮類化合物作為合成原料，經(jīng)過水解、酰胺烷基化、TBDMSOTf保護(hù)、釕催化烯烴復(fù)分解反應(yīng)得到吡咯衍生物，再經(jīng)過親核取代、脫烯丙基甲酸酯后得到不飽和的吲哚里西啶環(huán)，此反應(yīng)共經(jīng)過12步，其產(chǎn)率達(dá)到40%，因其應(yīng)用了烯烴復(fù)分解反應(yīng)產(chǎn)率較高，適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)SW。此外C W.G.Au等[10]利用分子內(nèi)的烷基化反應(yīng)合成六氫吡啶衍生物，并選擇性地獲得C-8手性構(gòu)型，然后經(jīng)過釕催化烯烴復(fù)分解反應(yīng)合成SW 中間體不飽和吲哚里西啶，此反應(yīng)共經(jīng)過10步，但其產(chǎn)率僅為12%。I.Déchamps等[11]以L-吡咯氨酸為原料經(jīng)14步反應(yīng)，總收率為14%。

1.1.2經(jīng)1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)或者雙羥基化不對(duì)稱反應(yīng)合成SW的關(guān)鍵中間體二環(huán)內(nèi)酰胺類化合物，因烯烴雙羥基化反應(yīng)具有所需反應(yīng)條件溫和，對(duì)溫度、水和氧氣等條件要求不嚴(yán)格，并且大多數(shù)烯烴能獲得高產(chǎn)率、高ee(對(duì)映體超量)值的光學(xué)活性鄰二醇等優(yōu)點(diǎn)，所以在SW合成過程中雙羥基化反應(yīng)起到了重要作用；此外，1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)是合成SW 中間體二環(huán)內(nèi)酰胺類化合物的重要方法之一[12]。

1.1.3不對(duì)稱反應(yīng)和還原氨基化反應(yīng)是合成SW的重要方法。M.Trajkovic等[13]用L-脯氨酸催化二惡烷酮衍生物發(fā)生不對(duì)稱性羥醛縮合反應(yīng)(還原胺化反應(yīng))，形成具有手性的雜環(huán)化合物，再經(jīng)過8步反應(yīng)合成SW，總產(chǎn)率為24%。不對(duì)稱氧化反應(yīng)體系的組成簡(jiǎn)單、合成容易、原料經(jīng)濟(jì)、底物具有手性選擇性；還原氨基化反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率較高、合成方便，是合成烯胺六元環(huán)的重要方法。

1.1.4H.Guo等[14]將丁內(nèi)酯和2-鋰呋喃經(jīng)羥基保護(hù)、Noyori不對(duì)稱還原、Achmatowicz反應(yīng)、Boc保護(hù)及其酯化反應(yīng)等，終得到吡喃酮類化合物，再經(jīng)糖基化反應(yīng)、二羥基化反應(yīng)、氧化還原及疊氮化反應(yīng)，最終成功合成SW。P.Rajasekaran等[15]將抗壞血酸衍生的烯丙醇進(jìn)行不同的取代，然后在加熱和鈀催化的條件下發(fā)生Overman重排反應(yīng)獲得SW。

SW 的化學(xué)合成路徑已經(jīng)超過了四十多條，其合成步驟8至20步不等，但由于SW 結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)手性碳原子，使其合成受到限制，而且合成的產(chǎn)物純度較差，所以給SW 化學(xué)合成帶來(lái)了巨大的困難和挑戰(zhàn)。如果找到一種化學(xué)合成方法，利用簡(jiǎn)單易得的合成原料，操作條件簡(jiǎn)單，能選擇性的構(gòu)建手性原子，這將給SW 的高產(chǎn)率低成本合成提供一條捷徑，這也是化學(xué)科學(xué)家一直追求的。V.Dhand等[8]試圖找到一種獨(dú)特的方法，其不需要手性分子作為合成原料，由5-氯戊醇為底物，以有機(jī)催化和不對(duì)稱R-氯化為基礎(chǔ)的反應(yīng)可以控制反應(yīng)基團(tuán)選擇性構(gòu)成手性中心，由于其操作簡(jiǎn)單，且原料容易獲得，所以這個(gè)反應(yīng)過程可能會(huì)應(yīng)用于一系列吲哚里西啶、吡咯環(huán)和類吡咯環(huán)等天然產(chǎn)物的合成。

1.2植物中提取苦馬豆素

SW是一種具有神經(jīng)毒性的生物堿，因其最初在苦馬豆(Swainsonacanescens)中被發(fā)現(xiàn)，因此命名為苦馬豆素；其也是豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物的主要毒性成分和動(dòng)物瘋草中毒的根本原因，故又稱瘋草毒素。此外，有報(bào)道稱分布于地球南半球的某些錦葵科(Malvaceae)黃花稔屬、旋花科(Convolvulaceae)的植物中也含有SW[16-19]。

自20世紀(jì)70年代末，澳洲科學(xué)家Colegate首次從灰苦馬豆(Swainsonacanescens)中分離獲得SW以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后從斑莢黃芪(AstragalusmembranaceusBunge)、黃花棘豆(Oxytropisochrocephala)、變異黃芪(AstragalusvariabilisBunge)、莖直黃芪(AstragalusstrictusGrah.ExBend.)、絹毛棘豆、甘肅棘豆(Oxytropiskansuensis)、急彎棘豆(OxytropisdeflexaDC．)、寬苞棘豆(OxytropislatibracteataJurtz)、冰川棘豆(OxytropisglacialisBenth)等種屬的植物中提取出了SW。A.D.Vallotton等[20]在實(shí)驗(yàn)室中移植了3種密柔毛黃芪屬(Astragalusmollissimus)的植物，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這3種密柔毛黃芪屬的植物都能產(chǎn)生SW，但其產(chǎn)SW 的能力并不相同。B.C.Hao等[21]采用纖維素酶法提取西藏莖直黃芪中SW，并用氣相色譜檢測(cè)其含量，試驗(yàn)中采用單因素設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)等方法確定了提取SW 的最佳條件：在粉碎篩為40目，料液比為1∶40，溫度為50 ℃的條件下加入3.5%的纖維素酶酶解3 h，其提取效率最高，此種方法可以更加高效快速、方便節(jié)能地提取莖直黃芪中的SW。宋巖巖等[22]將急彎棘豆植物的草粉經(jīng)過酸化堿化處理后，分別用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等萃取，然后將萃取液在薄層板上展開，用歐式液(Ehrlich’s)顯色后分析，結(jié)果顯示萃取物中含有SW，這說(shuō)明急彎棘豆屬于瘋草類植物。五爪吉祥草[Reineckiacarnea(Andr.) Kunth]屬于旋花科植物[22]，D.Cook等[23]在檢測(cè)巴西草原上五爪吉祥草時(shí)發(fā)現(xiàn)其中含有SW，其含量是隨著季節(jié)的變化而變化。S.Takeda等[24]在研究中發(fā)現(xiàn)，蒙古西部的許多山羊、綿羊、牛和馬因攝入小花棘豆而出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、全身麻痹、肌肉震顫等神經(jīng)癥狀，因此他們將干燥的小花棘豆植物處理后進(jìn)行化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些植物中含有0.02%～0.05%的SW。

雖然從上述植物中可以提取分離到SW，但此類植物分布面積廣泛，且大多生長(zhǎng)在寒冷或干旱的環(huán)境惡劣地區(qū)，從植物中大量提取SW會(huì)對(duì)草原草場(chǎng)造成不可恢復(fù)性的破壞。而且從植物組織中提取SW過程十分復(fù)雜，提取所用溶劑不僅污染環(huán)境，且對(duì)原料利用率較低，因此在植物中提取SW的方法，環(huán)保性和可行性較差。

1.3內(nèi)生真菌發(fā)酵

1.3.1瘋草內(nèi)生真菌內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指某種真菌短暫或者長(zhǎng)期地寄生于活的植物組織內(nèi)部，但對(duì)寄生植物不會(huì)造成明顯的病害癥狀，這種內(nèi)生真菌包括病原真菌、腐生真菌和菌根菌[25]。1985年K.Braun[26]首次從綠僵菌(M.anisopliae)中分離獲得SW，開創(chuàng)了從內(nèi)生真菌中獲得苦馬豆素的先例。因此，部分研究人員認(rèn)為瘋草內(nèi)生真菌與SW之間也可能存在一定聯(lián)系。K.Braun從3種瘋草植物中分離得到內(nèi)生真菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定均屬于Undifilum屬真菌，并將分離到的真菌在體外培養(yǎng)后，在代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到了SW，這是首次在人工體外培養(yǎng)的條件下從瘋草內(nèi)生菌中獲得SW。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究，金龜子綠僵菌(Anisopliae)、豆類絲核菌屬(Leguminicola)和埃里格孢屬(Undifilum)等主要真菌都能產(chǎn)SW。截至目前，從各種瘋草中分離出的內(nèi)生真菌均為埃里格孢屬真菌(Undifilum)[27]。D.Cook等[28]為了分析SW、瘋草植物和內(nèi)生真菌之間的關(guān)系，調(diào)查了豆科中黃芪屬、棘豆屬和苦馬豆屬等能產(chǎn)生SW的3個(gè)屬的植物，結(jié)果如表1所示。

K.Braun等[25]為了了解內(nèi)生真菌與SW 的關(guān)系，采集了11種有毒瘋草植株，并從其中的8種有毒瘋草植株的花、葉、莖和種子中分離出真菌，經(jīng)檢測(cè)均能產(chǎn)生SW，在進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其具有很厚的橫向隔，在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度十分緩慢，偶爾會(huì)產(chǎn)生分生孢子。將體外培養(yǎng)的18株菌株的菌絲體采用PCR 技術(shù)擴(kuò)增出菌絲體B-微管蛋白編碼區(qū)域rDNA 的ITS 序列，并對(duì)其進(jìn)行序列分析，分析結(jié)果顯示不同宿主植物、寄生在同一植株不同部位的所有的內(nèi)生菌ITS 序列基本相同，結(jié)果提示內(nèi)生菌是通過植物種子垂直傳播。形態(tài)學(xué)和ITS 區(qū)序列的分析結(jié)果表明，內(nèi)生菌與埃里格孢屬真菌的關(guān)系最為密切。B.M.Pryor等[29]通過觀察發(fā)現(xiàn)，瘋草棘豆屬產(chǎn)SW 的內(nèi)生真菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與埃里格孢屬菌真菌(Undifilum)非常相似。結(jié)合形態(tài)學(xué)與線粒體小亞基rDNA基因分析，B.M.Pryor 將棘豆屬瘋草中產(chǎn)SW的內(nèi)生真菌劃分為子囊菌綱(Ascomycetes)假球殼目(Pleosporales)假球殼科(Pleosporaceae)埃里格孢菌屬(Undifilum)。D.Cook等[30]在南美洲的旋花科植物五爪吉祥草中發(fā)現(xiàn)了一種產(chǎn)生SW 的內(nèi)生真菌，體外培養(yǎng)并提取DNA，在對(duì)其ITS1F 和ITS4 基因序列進(jìn)行測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)其為五爪吉祥草內(nèi)共生菌，并在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上能夠緩慢生長(zhǎng)。用殺菌劑處理五爪吉祥草種子的試驗(yàn)證明該內(nèi)生真菌通過植物種子進(jìn)行垂直傳播。

1.3.2瘋草內(nèi)生真菌合成苦馬豆素SW是從部分瘋草植物內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中也可以獲得的具有生物活性的生物堿SW。有學(xué)者報(bào)道，瘋草中SW的含量與瘋草感染內(nèi)生真菌的數(shù)量具有較高的相關(guān)性[31]。E.Oldrup等[32]在一種瘋草植物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis，在利用PCR定量技術(shù)測(cè)定瘋草植物中所含內(nèi)生真菌的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，植物中所含內(nèi)生真菌的濃度與其所含SW的含量成正相關(guān)；在沒有檢測(cè)到SW 的瘋草植株中也沒有檢測(cè)到Undifilumoxytropis內(nèi)生真菌的存在。結(jié)果表明，瘋草植物中SW 是由植株中的共生內(nèi)生菌合成產(chǎn)生。D.Cook等[33]指出，內(nèi)生真菌的基因型可能是影響SW 在不同植株中含量不同的原因。其在同一生長(zhǎng)條件下種植同種絹毛棘豆植株，在這些植株中檢測(cè)SW 的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，在同一生長(zhǎng)條件下不同的植株之間SW 的含量是有差異的，這說(shuō)明了不同植株所侵染的內(nèi)生真菌的基因型不同，其產(chǎn)生苦馬豆素的能力不同。

表1黃芪屬、棘豆屬和苦馬豆屬瘋草植物中產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生菌種類及檢測(cè)方法[28]

Table 1Species of the swainsonine Fungal endophyte inAstragalus，OxytropisandSwainsonaplant and the detection methods of these endophytes

瘋草種類Locoweed內(nèi)生菌種類Endophyte苦馬豆素檢測(cè)方法Detectionmethodoftheswainsonine真菌檢測(cè)方法Detectionmethodoffungi分離培養(yǎng)IsolationandcultivationPCRAstragalusallochrousUndifilumsp.酶法AstragalusasymmetricusTLCAstragalusdidymocarpusTLCAstragaluslentiginosusUndifilumfulvumTLC、LC-MS××Astragalusdrummondii酶法AstragaluspurshiiAstragalusamphioxysLC-MS×AstragalusvariabilisUndifilumoxytropisGC-MS、LC-MS××AstragalusemoryanusTLC、MS、酶法AstragalusbisulcatusTLC、酶法AstragalusstrictusUndifilumoxytropisGC-MS×Astragalusmissouriensis酶法Astragalusflavus酶法Astragalushumistratus酶法Astragaluslonchocarpus酶法AstragalusmollissimusUndifilumcinerumTLC、LC-MS、酶法××AstragalusnothoxysAstragalusoxyphysusTLCAstragaluspycnostachyusTLCAstragaluspehuenchesTLCAstragaluspraelongusTLC/酶法AstragaluspubentissimusUndifilumsp.LC-MS××AstragaluswootoniUndifilumsp.TLC、LC-MS××Astragalustephrodes酶法Astragalusthurberi酶法OxytropisglacialisUndifilumoxytropisGC-MS×OxytropiskansuensisUndifilumoxytropisGC-MS×OxytropisbesseyiOxytropisglabraUndifilumoxytropisGC-MS、LC-MS××OxytropiscampestrisOxytropissericeaUndifilumoxytropisTLC、LC-MS、酶法OxytropislambertiiUndifilumoxytropisTLC、GC-MS、LC-MS、酶法××OxytropisochrocephalaUndifilumoxytropisGC-MS×OxytropissericopetalaUndifilumoxytropisGC-MS××SwainsonagreyanaGC-FIDSwainsonacanescensUndifilumsp.GC-FID、LC-MS××SwainsonagalegifoliaGC-FID

“×”表示首次檢測(cè)到此種真菌的檢測(cè)方法

× means the method detected the fungi first time

近年來(lái)，瘋草內(nèi)生真菌合成SW 的學(xué)說(shuō)已經(jīng)被大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)同。為了提高瘋草內(nèi)生真菌產(chǎn)生SW 的產(chǎn)量，張蕾蕾等[34]研究不同環(huán)境因素對(duì)內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis產(chǎn)生SW 的能力及生長(zhǎng)的影響，設(shè)計(jì)了不同培養(yǎng)條件對(duì)瘋草內(nèi)生真菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件對(duì)其真菌的生長(zhǎng)和SW的產(chǎn)量均有影響，且U.oxytropis真菌具有自我調(diào)節(jié)適應(yīng)環(huán)境的能力，偏酸或偏堿條件均可促進(jìn)SW合成。L-哌可酸、L-賴氨酸和α-酮戊二酸等可能是合成SW的前體物質(zhì)，所以均會(huì)對(duì)SW的合成產(chǎn)生影響，且各物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度與SW 的產(chǎn)率密切相關(guān)。郭偉等[35]設(shè)計(jì)了對(duì)產(chǎn)生SW 真菌埃里格孢菌FEL3 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，最后通過測(cè)定菌絲中SW 的含量確定最佳培養(yǎng)條件：碳源為燕麥片、氮源為豆粉、無(wú)機(jī)鹽為CuSO4·5H2O、培養(yǎng)基初始pH 為6.5～7.0、接種量為體積分?jǐn)?shù)的8%時(shí)，埃里格孢菌FEL3 菌絲和菌液中SW 濃度都顯著高于其他組。陳基萍等[36]對(duì)產(chǎn)生SW 的內(nèi)生菌菌株Aspergillusustus的培養(yǎng)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，結(jié)果表明，菌株Aspergillusustus在豆粕培養(yǎng)基，硝酸鉀、麥芽糖分別為16、80 mg·L-1，pH為6.0，溫度為35 ℃的條件下培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，且SW的產(chǎn)量顯著高于其他組。真菌原生質(zhì)體的制備是研究真菌遺傳轉(zhuǎn)化和基因組學(xué)的重要工具，瘋草內(nèi)生真菌原生質(zhì)體可以進(jìn)一步確定瘋草內(nèi)生真菌合成SW的相關(guān)基因功能，闡明分子調(diào)控機(jī)制，提高瘋草內(nèi)生真菌合成產(chǎn)生SW 的產(chǎn)量。張蕾蕾等[37]對(duì)產(chǎn)SW內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis進(jìn)行酶解，把菌體的細(xì)胞壁用溶壁酶溶解后將原生質(zhì)體釋放，然后把原生質(zhì)體接種于PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，最后經(jīng)過對(duì)原生質(zhì)體再生菌絲中SW的含量測(cè)定，結(jié)果顯示再生菌絲中SW的含量略高于野生菌株的菌絲。

2　苦馬豆素的藥理作用

SW 具有良好的抗病毒、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫力作用，并能夠很好地抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增長(zhǎng)。

2.1抗病毒作用

SW是內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有較好的抗病毒效果。Y.Tanaka等[38]研究證明SW對(duì)3型人副流感病毒(HPIV3)具有一定的抑制作用，其作用機(jī)制是SW通過對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中α-甘露糖苷酶抑制導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能喪失，阻止了HPIV3表面蛋白血凝素—神經(jīng)氨酸酶(HN)和融合(F)蛋白的表達(dá)，降低病毒侵染細(xì)胞的能力，從而達(dá)到抗病毒的效果。劉文明等[39]使用SW 治療雞馬立克病(MD)的試驗(yàn)表明，其可以維持雞體內(nèi)的白細(xì)胞、血清磷酸酶(AKP)和乳酸脫氫酶(LDH)水平，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)SW 能有效抑制MD 腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移，具有良好的抗腫瘤作用。吳延磊等[40]研究金龜子綠僵菌次級(jí)代謝產(chǎn)物SW對(duì)雞新城疫病毒(NDV)疫苗的影響，試驗(yàn)中用14日齡雛雞建立新城疫病毒模型，將其分SW高、中、低劑量組和對(duì)照組，再使用新城疫病毒疫苗免疫治療，結(jié)果顯示，SW治療組雛雞體內(nèi)的抗新城疫病毒抗體顯著高于對(duì)照組，這說(shuō)明SW與新城疫病毒疫苗聯(lián)用可增強(qiáng)免疫效果，并對(duì)新城疫病毒有一定的抑制作用。郝寶成等[41]發(fā)現(xiàn)在一定劑量范圍內(nèi)，體外SW 能有效地抑制牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的增殖和感染，并推測(cè)其能直接滅活游離的牛病毒性腹瀉病毒。

2.2抗腫瘤作用

SW 能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，以達(dá)到治療癌癥的效果。目前，國(guó)外已進(jìn)入藥物Ⅲ期臨床階段，P.E.Goss等[42]通過靜脈注射SW的方式為腫瘤患者治療，在6周后腫瘤患者的腫瘤減小了一半，其中2位淋巴癌患者在靜脈注射SW一周后，臨床癥狀有了明顯減輕。J.Hamaguchi等[43]研究發(fā)現(xiàn)，SW能阻止大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，降低其對(duì)抗癌藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)的耐受性，能提高大腸癌的化療效果。此外，F(xiàn).M.Santos等[44]發(fā)現(xiàn)SW對(duì)艾氏腹水癌(Ehrlich ascites carcinoma，EAC)的治療藥物順鉑(cisplatin)有增效作用。N.You等[45]使用SW對(duì)HepG2、SMCC7721、Huh7、MHCC97-H 和HL-7702 等人肝癌細(xì)胞進(jìn)行治療的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)人肝癌細(xì)胞具有良好的抑制作用，但對(duì)人體正常的肝細(xì)胞并無(wú)損傷。由于MHCC97-H肝癌細(xì)胞具有高度的增殖性和致癌性，研究者選擇使用其作為肝癌細(xì)胞模型，在對(duì)其用SW治療時(shí)發(fā)現(xiàn)，其能顯著抑制MHCC97-H肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且在G0/G1 細(xì)胞周期誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。苦馬豆素是如何誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞的凋亡呢？N.You發(fā)現(xiàn)SW能使肝癌細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞周期蛋白(D1和E)減少，而細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk2的和Cdk4的)CDK抑制劑p21 和p27 蛋白增加，從而導(dǎo)致癌癥細(xì)胞凋亡。SW 能增強(qiáng)MHCC97-H 肝癌細(xì)胞中Bax基因表達(dá)的上調(diào)和Bcl-2 基因表達(dá)的下調(diào)，繼而導(dǎo)致其細(xì)胞凋亡。此外，SW 還能通過限制紫杉醇誘導(dǎo)的核因子κB(NF-κB)的積累，使其在體內(nèi)外的細(xì)胞毒性作用增強(qiáng)，這說(shuō)明SW可以直接抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，減輕紫杉醇治療肝癌細(xì)胞時(shí)的過度反應(yīng)。D.Singh等[46]用SW對(duì)HL-60白血病細(xì)胞進(jìn)行治療時(shí)發(fā)現(xiàn)其能減少細(xì)胞周期蛋白(D1和E)表達(dá)，增加細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK抑制劑p21和p27蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到對(duì)HL-60白血病細(xì)胞的治療效果?？梢姡琒W具有巨大的藥用價(jià)值和科研潛力，但是長(zhǎng)期使用又會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定的損傷，如何將其制成高效、安全的抗癌藥物將成為當(dāng)前及今后研究的熱點(diǎn)。

2.3調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力

苦馬豆素不僅具有良好的抗癌、抗病毒作用，同時(shí)還是一種具有較強(qiáng)活性的免疫調(diào)節(jié)劑。O.A.Oredipe等[47]研究發(fā)現(xiàn)SW能夠刺激骨髓細(xì)胞增殖，提高骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴細(xì)胞的能力，增強(qiáng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能。張志敏等[48]研究發(fā)現(xiàn)SW能激活小鼠腹腔免疫系統(tǒng)生成巨噬細(xì)胞，提高一氧化氮合酶的活性和TNF-α的水平，提高機(jī)體免疫系統(tǒng)功能。試驗(yàn)還表明高劑量的SW能抑制巨噬細(xì)胞的形成。因此，SW可以通過雙向調(diào)節(jié)腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫作用。

淋巴細(xì)胞是體現(xiàn)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的表征之一，T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中最為多樣和多效的一種免疫細(xì)胞。T細(xì)胞按其表面表達(dá)CD分子的不同一般分為CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞兩大類。CD4+T淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)中主要起免疫調(diào)節(jié)作用，通過此作用，使機(jī)體針對(duì)不同抗原的免疫應(yīng)答朝著定向類型發(fā)展，達(dá)到完全清除體內(nèi)病原體的目的；CD8+T淋巴細(xì)胞主要通過細(xì)胞毒作用發(fā)揮作用，殺死體內(nèi)被病毒(細(xì)菌)感染的細(xì)胞、胞內(nèi)寄生菌感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等，并將其吞噬消化。張建軍等[49]給小鼠灌服一定劑量的SW，利用流式細(xì)胞儀分析血液中T淋巴細(xì)胞的種類和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)劑量SW給藥的小鼠體內(nèi)CD4+/CD8+的比值比正常數(shù)值顯著提高。這說(shuō)明，低劑量SW能提高小鼠的免疫能力，而中、高劑量SW只能在短時(shí)間內(nèi)提高小鼠的免疫機(jī)能，高劑量長(zhǎng)時(shí)間給藥反而會(huì)降低小鼠的免疫能力。

3　苦馬豆素的檢測(cè)方法

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有的檢測(cè)SW 方法主要有薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、氣相色譜法(gas chromatography，GC)、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、α-甘露糖苷酶活性抑制分析法(α-mannosidase activity inhibition analysis，α-MIA)等[50-51]。

R.J.Molyneux等[52]采用薄層色譜法檢測(cè)SW，其建立了SW 的Ehrlich’s試劑顯色方法，該方法不僅具有特異性，而且靈敏度較高、應(yīng)用廣泛、操作方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，但檢測(cè)時(shí)易受硅膠板薄厚、硅膠粒度、板面平整度及邊緣效應(yīng)等因素影響。氣相色譜法(GC)和氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)，采用氣相色譜法檢測(cè)SW 前，需將樣品制備為容易氣化并且穩(wěn)定的衍生物，比薄層色譜方法操作復(fù)雜，但檢出率較高、靈敏度較高。氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)SW 主要是用于定性分析，可用于檢測(cè)SW是否存在[53]。在檢測(cè)SW的方法中，LC-MS和HPLC法應(yīng)用廣泛，其優(yōu)點(diǎn)是迅速、連續(xù)、高效、靈敏。HPLC法需根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器，目前常用檢測(cè)器為DAD、MS、ELSD和PAD等。LC-MS法檢測(cè)SW時(shí)，對(duì)于樣品的處理要求不高，且具有極高的靈敏度，但是儀器成本過高。由于SW陽(yáng)離子與甘露糖苷水解過程中形成的甘露糖陽(yáng)離子的半椅式空間結(jié)構(gòu)非常相似，SW競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-甘露糖苷酶活性，α-MIA法就是按這一原理間接分析SW 的含量。該法對(duì)檢測(cè)樣品的要求較低，方法簡(jiǎn)單快捷，適用于大量樣品的檢測(cè)，但是準(zhǔn)確度較差，檢測(cè)范圍較窄。此外還有熒光光譜法、離子抑制色譜法等[54-55]，各種檢測(cè)方法對(duì)照如表2所示。

表2各種檢測(cè)方法的比較

Table 2Comparison of the detection methods of swainsonine

檢測(cè)方法Method適用范圍Sample樣品條件要求Requirement最低檢出限/(mg·g-1)Lowestdetectionlimit文獻(xiàn)來(lái)源Reference薄層色譜各種樣品不嚴(yán)格0.50×10-3[56]氣相質(zhì)譜聯(lián)用提取物需制備衍生物0.10×10-9[57]液相質(zhì)譜聯(lián)用提取物需制備衍生物0.10×10-9[58]酶分析法血清、乳樣品pH、溫度限制0.50×10-3[59]熒光光譜食糜樣品、提取物需除雜0.10×10-8[54]離子抑制色譜提取物不嚴(yán)格0.29×10-4[55]

4　結(jié)論與展望

SW 具有良好的抗病毒、抗腫瘤和提高免疫力等藥用作用和科研價(jià)值，其發(fā)展前景廣闊。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其抗病毒作用研究主要集中在3型人副流感病毒[38]、牛腹瀉病毒[41]、雞馬立克病毒[39-40]等研究上，并且證明SW 能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中α-甘露糖苷酶的活性，阻止病毒自身蛋白質(zhì)的合成，并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，提高機(jī)體的防御系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗病毒作用；但其抗病毒作用機(jī)制闡述并不是十分清楚，適用范圍也有待進(jìn)一步發(fā)掘。SW 抗腫瘤效果顯著，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，在美國(guó)SW已經(jīng)進(jìn)入抗腫瘤藥物Ⅲ期臨床階段[61]，但在國(guó)內(nèi)SW抗腫瘤研究屬于起步階段，其抗腫瘤的作用機(jī)制尚不明確，在細(xì)胞水平上的作用靶點(diǎn)和代謝通路等相關(guān)研究鮮有報(bào)道。雖然SW在抗病毒、抗腫瘤方面效果顯著，但其在植物體內(nèi)的含量較低，加之提取工藝落后，提取效率較低，人工合成的成本過高，產(chǎn)率較低，導(dǎo)致SW 的價(jià)格高昂、使用范圍有限[61]。SW的來(lái)源將成為限制其發(fā)展和應(yīng)用的最大難題，因此拓寬其新的來(lái)源將成為今后研究的主要方向。目前，許多研究人員通過真菌發(fā)酵方法來(lái)解決其來(lái)源短缺問題，瘋草內(nèi)生真菌、金龜子綠僵菌和豆類絲核真菌均能合成SW，但是SW 是如何在這些菌中合成代謝的，其合成機(jī)制與代謝途徑也不完全清楚。

近年來(lái)，合成生物學(xué)的概念逐漸被引入到天然產(chǎn)物學(xué)領(lǐng)域，已經(jīng)應(yīng)用于青蒿素、紫杉醇等多種天然藥物的合成[62]。將合成生物學(xué)、基因工程學(xué)、蛋白質(zhì)組與代謝組學(xué)等多種方法相結(jié)合，研究這些真菌合成SW的代謝途徑，找到與合成SW相關(guān)的關(guān)鍵基因。一方面，可利用基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和微生物誘變技術(shù)等，將關(guān)鍵基因?qū)敫弑磉_(dá)目標(biāo)載體，改造出一株生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量高的菌株，以便SW的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)與應(yīng)用，解決其來(lái)源問題。另一方面，可以利用基因敲除技術(shù)、RNA干擾等，將內(nèi)生菌中合成SW的關(guān)鍵基因敲除，或轉(zhuǎn)錄后沉默與其相關(guān)的基因表達(dá)，培育營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且無(wú)毒“瘋草”新品種。

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(編輯白永平)

Research Advance on Sources，Pharmacological Effects and Detection Methods of Swainsonine

HUANG Xin，LIANG Jian-ping，GAO Xu-dong，HAO Bao-cheng*

(KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProjectofGansuProvince/KeyLaboratoryof

Swainsonine，one of indole quinolizidine alkaloids，is a metabolite of locoweed and its parasitic fungi.The swainsonine has good anti-virus，anti-tumor effects and can enhance the role of immunity，has great potential for medicine development.This paper briefly expounds pharmacology，detection method，medicinal value and development potential of swansonine.And the research progress of its source and locoweed endophytic fungus synthesizing spherosin were summarized to enrich swainsonine’s source and provide the supply of abundant raw materials for its scientific and medical application.

swainsonine；source；pharmacologic action；detection method；endophytic fungi synthesis

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.001

2015-12-07

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程獸用天然藥物創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-04)

黃鑫(1992-)，男，甘肅清水人，碩士生，主要從事新型獸用天然藥物的研究，E-mail:gsau 520@sina.cn

郝寶成(1983-)，男，博士，助理研究員，主要從事獸用天然藥物的研究與創(chuàng)制研究，E-mail:haobaocheng@sina.cn

S859

A

0366-6964(2016)06-1075-11