陳根殷，王旭光

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右美托咪定對布比卡因所致神經(jīng)細(xì)胞毒性的保護作用

陳根殷，王旭光

摘要：目的探討右美托咪定對布比卡因所致神經(jīng)細(xì)胞毒性的保護作用。方法體外培養(yǎng)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株N2a細(xì)胞，取對數(shù)期細(xì)胞分為4組：對照組細(xì)胞培養(yǎng)液不加任何藥物；布比卡因組細(xì)胞中加入1 000μmol/L布比卡因；50、200μmol/L右美托咪定濃度組細(xì)胞中加入1 000μmol/L布比卡因后，再分別加入50、200μmol/L右美托咪定。各組細(xì)胞加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以MTT法檢測細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、活性氧（ROS）水平、線粒體膜電位及Caspase-3的表達。結(jié)果在1 000μmol/L布比卡因作用下，各藥物組N2a細(xì)胞的存活率明顯降低，同時線粒體膜電位顯著下降，而細(xì)胞的凋亡率、胞內(nèi)ROS水平和Caspase-3表達則顯著升高；50、200μmol/L右美托咪定可抑制布比卡因引起的N2a細(xì)胞毒性，使細(xì)胞的存活率及線粒體膜電位均明顯升高，同時降低細(xì)胞的凋亡率、胞內(nèi)ROS水平和Caspase-3表達，200μmol/L右美托咪定的變化較50μmol/L更為明顯。結(jié)論右美托咪定可減輕布比卡因?qū)2a細(xì)胞的毒性作用，其可能是通過抑制ROS的生成、改變線粒體膜電位、降低Caspase-3的表達，從而抑制細(xì)胞的凋亡來實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：右美托咪定；布比卡因；細(xì)胞凋亡；活性氧；流式細(xì)胞術(shù)；神經(jīng)損傷；線粒體膜電位

布比卡因作為一種酰胺類局部麻醉藥，因具有良好的麻醉和鎮(zhèn)痛效果而被廣泛應(yīng)用于硬膜外鎮(zhèn)痛、神經(jīng)阻滯和椎管內(nèi)麻醉。然而研究發(fā)現(xiàn)其對神經(jīng)元有一定的損傷作用，布比卡因神經(jīng)毒性的機制尚未完全闡明，有研究認(rèn)為與其引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性抗凋亡分子表達下調(diào)或活性下降，從而導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和凋亡有關(guān)，其神經(jīng)毒性已引起麻醉學(xué)與疼痛治療學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注［1-2］。右美托咪定是一種新型高選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮及抑制交感神經(jīng)活性，減少應(yīng)激反應(yīng)等特性。有研究表明右美托咪定可通過增加抗凋亡蛋白生成和減少促凋亡蛋白生成，降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而增強神經(jīng)細(xì)胞的生存能力［3-5］。但右美托咪定對布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是否也有影響，目前尚少見報道。本研究探討右美托咪定對布比卡因所致神經(jīng)損傷的影響，并進一步探討其可能作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株N2a細(xì)胞購自上海通派生物科技有限公司；右美托咪定購自江蘇恒瑞制藥有限公司；MEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；布比卡因和MTT購自美國Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、活性氧（ROS）檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、Caspase-3檢測試劑盒和流式細(xì)胞儀（型號：FACSCantoⅡ）均購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)N2a細(xì)胞，到80%單層融合時傳代。

1.3MTT法檢測神經(jīng)細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期細(xì)胞，1×105cell/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加100μL，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，分別加入1 000μmol/L布比卡因和不同濃度的右美托咪定（0、10、20、50、100、200、400μmol/L），對照組加入相應(yīng)體積的PBS，每組設(shè)8個平行孔。用藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入20μL MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。傾去培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO溶解，以測定波長為570 nm，參考波長為450 nm于酶標(biāo)儀測定其吸光度，重復(fù)3次。根據(jù)公式計算存活率：細(xì)胞存活率（%）=處理組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.4實驗分組根據(jù)MTT及預(yù)實驗結(jié)果，本實驗設(shè)4組，對照組：細(xì)胞培養(yǎng)液不加任何藥物。布比卡因（Bup）組：細(xì)胞中加入1 000μmol/L布比卡因。50μmol/L右美托咪定濃度（Dex1）組、200μmol/L右美托咪定濃度（Dex2）組：細(xì)胞中加入1 000μmol/L布比卡因后再分別加入50、200μmol/L右美托咪定。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞加藥培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，取約5×105重懸的細(xì)胞，加入500μL Annexin V-FITC結(jié)合液混勻，再加入5μL Annexin V-FITC，然后加入5μL PI染色液，混勻后避光室溫放置15 min，隨即進行流式細(xì)胞儀檢測。

1.6細(xì)胞內(nèi)ROS的測定細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板加藥培養(yǎng)24 h后，每孔加入濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗細(xì)胞3次，然后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)的熒光強度。

1.7線粒體膜電位檢測細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板加藥培養(yǎng)24 h后，每孔加入500μL JC-1染色工作液（5 mg/L），充分混勻，繼續(xù)37℃培養(yǎng)20 min，收集細(xì)胞，加500μL JC-1染色緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測。較高線粒體膜電位時，JC-1形成聚合體，產(chǎn)生紅色熒光；較低線粒體膜電位時，JC-1聚合體分解成單體，產(chǎn)生綠色熒光。以JC-1單體與聚合體的熒光強度比值來衡量線粒體膜電位的變化。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測Caspase-3表達的變化收集各組細(xì)胞，加入2%多聚甲醛于冰上孵育30 min，300×g離心5 min去上清；0.5 mL 0.2%的Tween緩沖液重懸細(xì)胞，室溫下孵育15 min。離心收集細(xì)胞，加入50μL染色緩沖液和10μL Alexa Flour 647標(biāo)記的Caspase-3抗體，避光孵育30 min，加入1 mL 0.1%Tween緩沖液。離心去上清，加入500μL染色緩沖液，然后上機檢測。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MTT實驗結(jié)果與對照組相比，濃度為1 000 μmol/L的布比卡因明顯抑制細(xì)胞的增殖，具有較強的細(xì)胞毒性作用；應(yīng)用20～400μmol/L右美托咪定作用于細(xì)胞能明顯抑制布比卡因的細(xì)胞毒性，提高N2a細(xì)胞的存活率，與布比卡因組（即0μmol/L濃度組）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.109，P＜0.05）。見圖1。

Fig.1　Effects of different doses of dexmedetomidine on bupivacaine-induced neurotoxicity圖1　右美托咪定對布比卡因細(xì)胞毒性的影響

2.2右美托咪定對N2a細(xì)胞凋亡的影響布比卡因作用24 h后，與對照組相比，各藥物組N2a細(xì)胞的凋亡率顯著增高（P＜0.01）。Dex1組和Dex2組細(xì)胞的凋亡率較Bup組均明顯下降，Dex2組較Dex1組下降更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表1、圖2。

2.3右美托咪定對N2a細(xì)胞內(nèi)ROS的影響與對照組相比，各藥物組N2a細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著增高（P＜0.01）。Dex1組和Dex2組ROS水平較Bup組下降，Dex2組較Dex1組下降更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表1、圖3。

Tab.1　The rate，ROS activity，and expression level of Caspase-3 in N2a cells detected by FCM表1　流式細(xì)胞術(shù)檢測N2a細(xì)胞的凋亡率、ROS水平及Caspase-3表達?。╪=5，x±s）

Fig.2　The apoptotic rates of four groups measured by FCM圖2　流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡

Fig.3　The ROS activity measured by FCM圖3　流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS的變化

2.4右美托咪定對N2a細(xì)胞線粒體膜電位的影響與對照組相比，各藥物組N2a細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位顯著下降（P＜0.01）。Dex1組和Dex2組細(xì)胞線粒體膜電位較Bup組明顯上升，Dex2組較Dex1組上升更為顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表2、圖4。

Tab.2　The mitochondrial membrane potential（MMP）measured by FCM表2　流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位　（n=5，x±s）

Fig.4　The mitochondrial membrane potential（MMP）measured by FCM圖4　流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位

2.5右美托咪定對N2a細(xì)胞Caspase-3表達的影響與對照組相比，各藥物組N2a細(xì)胞Caspase-3表達均顯著增加（P＜0.01）。Dex1組和Dex2組N2a細(xì)胞Caspase-3表達較Bup組顯著下降，Dex2組較Dex1組下降更顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表1、圖5。

Fig.5　Caspase-3 expression of N2acells detected by FCM圖5　流式細(xì)胞術(shù)檢測Caspase-3的表達

3　討論

臨床和實驗研究均發(fā)現(xiàn)布比卡因?qū)ι窠?jīng)元具有一定損傷作用，且具有時間和劑量依賴性，并且臨床上常用的劑量就可引起神經(jīng)損傷。目前布比卡因神經(jīng)毒性的機制尚未完全闡明，現(xiàn)有研究認(rèn)為，布比卡因?qū)е禄颊叱霈F(xiàn)運動和感覺異常的原因在于其可引起神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)元壞死和凋亡［6-7］。布比卡因可通過干擾氧化磷酸化和抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，使ATP生成減少，并可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，促使電壓依賴性陰離子通道開放，導(dǎo)致Cl-流入線粒體內(nèi)，使線粒體的滲透壓增高、膜電位降低和通透性增大，釋放促凋亡因子，并激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8-9］。

本課題組前期實驗結(jié)果顯示，布比卡因可抑制N2a細(xì)胞的增殖，并具有劑量依賴性，其半數(shù)抑制濃度IC50為1 060μmol/L。本研究采用1 000μmol/L的布比卡因進行實驗。而在右美托咪定系列濃度組中，20μmol/L以上濃度組均可抑制布比卡因的細(xì)胞毒性，但在作用機制研究中20μmol/L濃度組和布比卡因組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，所以本實驗采用50μmol/L和200μmol/L濃度組作為低、高兩個濃度進行后續(xù)機制實驗。實驗結(jié)果顯示，在濃度為1 000 μmol/L布比卡因作用下，N2a細(xì)胞的存活率明顯降低，同時凋亡率及線粒體膜電位顯著下降，而胞內(nèi)ROS水平和Caspase-3表達則顯著升高，提示布比卡因?qū)2a細(xì)胞存在較大的細(xì)胞毒性，其原因可能在于布比卡因刺激N2a細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，從而啟動凋亡線粒體途徑，激活Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這也與以往研究結(jié)果相一致［10］。

多項研究表明，右美托咪定尚具有穩(wěn)定血流動力學(xué)及多器官保護作用［11-12］，但其對神經(jīng)系統(tǒng)的影響和作用機制尚不明確，結(jié)果也存在爭議。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗濃度范圍內(nèi)的右美托咪定對N2a細(xì)胞增殖沒有明顯的抑制作用，且一定濃度的右美托咪定可濃度依賴性地抑制布比卡因引起的細(xì)胞毒性，顯著提高N2a細(xì)胞的存活率。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可降低布比卡因誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡。ROS在布比卡因誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡的過程中起重要作用。本研究顯示，右美托咪定能抑制布比卡因誘導(dǎo)的ROS過度生成，同時升高N2a細(xì)胞線粒體膜電位，抑制胞內(nèi)Caspase-3表達，提示右美托咪定可減輕布比卡因?qū)2a細(xì)胞的毒性作用，其可能是通過抑制ROS的生成，改變線粒體膜電位，降低Caspase-3的表達，從而抑制細(xì)胞的凋亡來實現(xiàn)，但具體的作用機制還需進一步研究。

右美托咪定的多器官保護作用已越來越受到人們的關(guān)注，尤其在神經(jīng)保護和心臟保護中，右美托咪定已顯示出其獨特的優(yōu)越性。但目前針對右美托咪定的用藥劑量及其與其他麻醉藥物的相互作用等問題尚需更多、更細(xì)致的研究以使其應(yīng)用更安全、更有效。

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（2015-06-01收稿2015-11-03修回）

（本文編輯陳麗潔）

Protective effects of dexmedetomidine on bupivacaine-induced neurotoxicity

CHEN Genyin，WANG Xuguang
The Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China Corresponding AuthorE-mail：marvin009@126.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effects of dexmedetomidine on bupivacaine-induced neurotoxicity. MethodsMouse neuroblastoma cell line N2a cells were divided into four groups.The cells in the control group were incubated with no drug adding while the cells in bupivacaine group were treated with 1 000μmol/L bupivacaine for 24 h.The cells in the group Dex1 and Dex2 were incubated with 1 000μmol/L bupivacaine and 50μmol/L，200μmol/L dexmedetomidine for 24 h respectively.MTT assay was used to evaluate the cell viability.The reactive oxygen species（ROS）activity，mitochondrial membrane potential（MMP），the expression of Caspase-3 and apoptotic rate of N2a cells were detected by flow cytometry.ResultsThe cell viabilities were significantly decreased after being treated with 1 000μmol/L bupivacaine，MMP was also significantly decreased，and apoptotic rates，levels of ROS and Caspase-3 were significantly increased.The bupivacaine-induced cytotoxicity was inhibited by dexmedetomidine（50 and 200μmol/L），which resulted in the increase in the cell viability and MMP，but decrease in apoptotic rate and levels of ROS and Caspase-3.These effects were more significant in 200μmol/L dexmedetomidine group than those of 50μmol/L dexmedetomidine group.ConclusionDexmedetomidine attenuates bupivacaine-induced cytotoxicity of N2a cells，which may be related with the inhibition of ROS，the decrease in MMPand Caspase-3，and inhibitingappotosis in N2acells.

Key words：dexmedetomidine；bupivacaine；apoptosis；reactive oxygen species；flow cytometry；neurotoxicity；mitochondrial membrane potential

中圖分類號：R614.1

文獻標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/58574

作者單位：湛江市，廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（郵編524001）

作者簡介：陳根殷（1973），女，主任醫(yī)師，主要從事麻醉藥物基礎(chǔ)研究

通訊作者E-mail：marvin009@126.com