劉金玲，魏　澍，趙玉軍，何劍斌*

(1．沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，沈陽 110866；2．遼寧省動物疫病預防控制中心，沈陽 110164)

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牛病毒性腹瀉病毒感染對牛外周血來源樹突狀細胞表型及其分泌Th1/Th2細胞因子的影響

劉金玲1，魏澍2，趙玉軍1，何劍斌1*

(1．沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，沈陽 110866；2．遼寧省動物疫病預防控制中心，沈陽 110164)

摘要：旨在探究BVDV感染對牛外周血來源的樹突狀細胞成熟及Th1和Th2型細胞因子分泌水平的影響，進一步揭示BVDV感染對機體免疫機能的影響機制。從牛外周血分離單核細胞，誘導培養(yǎng)為樹突狀細胞后接種BVDV共培養(yǎng)，采用顯微鏡觀察細胞的形態(tài)，流式細胞術分析細胞表面標志分子，半定量RT-PCR法檢測Th1型細胞因子IL-12p40和Th2型細胞因子IL-10的mRNA轉錄水平。結果顯示，獲得形態(tài)及表型典型的樹突狀細胞，誘導純度為93.81%；BVDV接種組樹突狀細胞表面的MHCⅡ類分子、CD40分子、CD80分子均明顯低于未接種組，差異極顯著(P<0.01)；BVDV接種組的IL-12p40 mRNA轉錄水平低于未接種組，差異顯著(P<0.05)；而IL-10 mRNA轉錄水平高于未接種組，差異顯著(P<0.05)。結果說明BVDV感染影響樹突狀細胞的成熟及功能，并能通過高效表達Th2型細胞因子IL-10、降低Th1型細胞因子IL-12p40而影響Th1/Th2的平衡。

關鍵詞：牛病毒性腹瀉病毒；樹突狀細胞；免疫表型；Th1/Th2

牛病毒性腹瀉病(BVD)是危害養(yǎng)牛業(yè)的一種重要疾病。其病原牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員[1]。主要引起牛的病毒性腹瀉、母畜流產(chǎn)、呼吸道疾病以及機體的免疫抑制[2-4]。最新的調查數(shù)據(jù)顯示，新疆地區(qū)奶牛BVDV的陽性率為43%，基因型為BVDV-Ib和BVDV-Ic亞型，表明該病在我國的流行較為嚴重，對養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展存在著嚴重威脅[5-6]。目前現(xiàn)有的藥物和疫苗并不能完全對該病進行防治，造成該病在局部地區(qū)暴發(fā)。因此闡明BVDV對機體的致病機制對于研制出更加安全可靠有效的疫苗、控制BVD發(fā)生和蔓延就顯得尤為重要。機體免疫系統(tǒng)對外來病原的抗感染免疫應答首先反映在抗原提呈細胞對抗原的攝取和處理。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是分布廣泛的專職抗原提呈細胞(antigen-presenting cells，APC)。未成熟DCs具有極強的抗原吞噬能力，在攝取抗原或受到某些因素刺激時即分化為成熟DCs，而成熟的DCs表達高水平的共刺激因子和黏附因子。DCs在清除抗原抗體復合物、吞噬殺傷病原體，抵抗病原體入侵過程中起到非常重要的作用，也是唯一能夠啟動初始T細胞活化的重要免疫細胞，是天然免疫和獲得性免疫應答的關鍵連接[7-9]，其功能狀態(tài)直接影響細胞免疫和體液免疫應答，在抗病毒的細胞免疫中起重要作用。因此，DCs的功能是免疫應答的關鍵環(huán)節(jié)。本研究擬采用BVDV感染牛外周血來源的DCs，觀察BVDV感染對DCs免疫表型和Th1/Th2型細胞因子的分泌水平的影響。探究BVDV感染對DCs調控Th1和Th2型免疫應答的潛在機制，對于進一步揭示BVDV感染對機體免疫機能的影響及致病機制具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料

RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Bioland公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gbico公司，淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物技術公司，牛源樹突狀細胞免疫磁珠購自德國Miltenyl Biotec公司，重組牛源GM-CSF、IL-4以及鼠抗牛源CD34、CD11c、CD8、CD71、CD56熒光標記抗體購自Kingfisher Biotech公司，RT-PCR試劑購自大連寶生物試劑公司，BVDV (OregonAV69)標準毒株由遼寧省動物疫病預防控制中心惠贈。

1.2實驗動物的篩選

根據(jù)農業(yè)部規(guī)定的標準選取4周齡幼牛，即口腔黏膜、糞便、血液分別通過RT-PCR和PCR檢測牛病毒性腹瀉黏膜病毒(BVDV)、豬瘟病毒(HCV)、牛傳染病鼻氣管炎病毒(IBRV)抗原均為陰性，并且ELISA法檢測BVDV、HCV、IBRV 抗體陰性。無菌采集牛的外周血，肝素(100 μg·mL-1)抗凝。

1.3牛外周血來源樹突狀細胞的誘導培養(yǎng)及鑒定

將采集的100 mL牛外周血2 000 r·min-1離心5 min，棄血清。加入等量帶有酚紅指示劑的Dulbecco’s-Hanks(去鈣、鎂離子)，混勻后加入到淋巴細胞分離液上，常溫2 500 r·min-1離心15 min，離心后液體分層，用移液管將分層中白色渾濁層小心吸出于另一離心管，2倍Dulbecco’s-PBS混勻后常溫2 000 r·min-1離心10 min，棄上清，反復洗滌兩遍后并以2×106·mL-1的細胞密度接種細胞培養(yǎng)瓶，次日用RPMI-1640基礎培養(yǎng)液輕輕洗出懸浮細胞，用免疫磁珠純化后，添加含GM-CSF (20 ng·mL-1)和IL-4(10 ng·mL-1)的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃過夜培養(yǎng)，3 d半量換液一次，并用倒置顯微鏡觀察不同時間點樹突狀細胞形態(tài)的變化。培養(yǎng)至第7天，用吸管輕輕吹打后收集所有懸浮細胞，即為富集的牛外周血來源的樹突狀細胞，經(jīng)流式細胞儀分選鑒定樹突狀細胞，并測定其純度。

1.4BVDV對牛外周血來源樹突狀細胞形態(tài)學及表型的影響

將上述流式分選鑒定后的樹突狀細胞分為兩組，一組接種毒價為108.5TCID50·mL-1的BVDV，未接毒組作為對照組。接毒2 h后，各試驗組添加LPS至終濃度為1 μg·mL-1，3 d后，觀察各組細胞的形態(tài)學變化，并將各組樹突狀細胞用PBS懸浮，濃度調為1×106·mL-1，加入流式管后，分別加入熒光標記抗體CD11c-FITC，CD40-APC，CD80-Percp，MHCⅡ-PE各1 μL，4 ℃避光放置30 min，然后PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測誘導的樹突狀細胞共刺激分子的表達情況。對照為FITC、PE、Percp 或APC 交聯(lián)的同型對照抗體。

1.5BVDV病毒載量的檢測

分別在接毒第1、2、3天后，采用半定量RT-PCR法檢測BVDV的E2基因，觀察BVDV的增殖情況。

1.6BVDV對牛外周血來源樹突狀細胞Th1和Th2型細胞因子分泌的影響

收集接毒3 d后各組樹突狀細胞，離心后重新懸浮，調整細胞密度為1×105·mL-1，TRIzoL裂解提取細胞的總RNA并反轉錄，以cDNA為模板分別擴增Th1型細胞因子IL-12p40和Th2型細胞因子IL-10的mRNA，同時以GADPH作為內參照，以靶基因/GADPH灰度比值作為mRNA的相對表達豐度進行半定量檢測，從細胞因子轉錄水平分析BVDV感染對樹突狀細胞的Th1和Th2偏轉的影響。

1.7統(tǒng)計學處理

2結果

2.1牛外周血來源樹突狀細胞的誘導培養(yǎng)

在誘導培養(yǎng)第1天，觀察到大部分細胞邊界清晰、呈圓形、細胞質透亮、細胞懸浮于細胞液中。第3天可見半數(shù)細胞變大，細胞呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)。第5天形成細胞集落，多數(shù)細胞有細微絲狀刺突。于培養(yǎng)第7天可見細胞胞體拉長、具有游離的細微絲狀刺突、呈半懸浮生長，具有典型的樹突狀細胞突起的外形，見圖1。

圖1　牛外周血來源樹突細胞第1、3、5、7天的情況(400×)Fig.1　Dendritic cells derived from bovine peripheral blood on the day 1，3，5，7(400×)

2.2牛外周血來源樹突狀細胞的鑒定和純度測定

收集誘導培養(yǎng)7 d的樹突狀細胞懸液0.1 mL至流式管中，分別加入牛樹突狀細胞、巨噬細胞、NK細胞、CTL細胞標志性表型抗體Anti-CD11c-FITC、Anti-CD71-PE、Anti-CD56-APC、Anti-CD8-Percp染色后，采用流式細胞儀對牛外周血來源性樹突狀進行檢測，檢測結果顯示細胞純度為93.81%，表明牛外周血來源的樹突狀細胞經(jīng)免疫磁珠分離，誘導劑誘導能夠達到較高的誘導純度，見圖2。

2.3BVDV感染對牛外周血來源樹突狀細胞形態(tài)的影響

接種BVDV后第3天，用倒置顯微鏡觀察到接種組樹突狀細胞，不規(guī)則細胞增多，外形輪廓模糊，細胞壁溶解界限不清，細胞碎片增多，而未接種組細胞質透明，細胞刺狀突起明顯，呈典型的樹突狀細胞形態(tài)，見圖3。

2.4BVDV感染對牛外周血來源樹突狀細胞重要表型的影響

接毒3 d后，分別收集接毒組樹突狀細胞和未接毒組樹突狀細胞，分別加入FITC、PE、APC和Percp標記的單克隆抗體，通過流式細胞儀收集要測定的細胞群并檢測不同熒光標記強度，從而分析各組樹突狀細胞表面標志的表達情況。流式分析結果表明，BVDV接毒組樹突狀細胞表面的MHCⅡ類分子、CD40分子、CD80分子均明顯低于未接毒組，差異極顯著(P<0.01)，表明BVDV感染影響樹突狀細胞的成熟，見圖4。

圖2　樹突狀細胞(DC)流式細胞儀純度檢測Fig.2　Dendritic cells(DC) purity of flow cytometry detection

圖3　BVDV對樹突狀細胞(DC)形態(tài)的影響(400×)Fig.3　Morphology influence of dendritic cells(DC) by BVDV(400×)

**.P<0.01圖4　樹突狀細胞(DC)表面標志分子的分析Fig.4　Analysis of surface molecules on dendritic cells(DC) by FCM

2.5BVDV病毒載量的檢測

采用半定量RT-PCR方法擴增牛外周血來源樹突狀細胞接毒組cDNA中E2基因及其內參基因GDPAH，用1.2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，PCR擴增基因片段大小與預期相符。結果表明，BVDV在樹突細胞中的持續(xù)性存在。病毒含量在第1、2、3天中增殖不明顯，無顯著性差異(P>0.05)，見圖5。

M.DL1000 DNA相對分子質量標準；1.第1天；2.第2天；3.第3天M.DL1000 DNA marker；1.The 1st day；2.The 2nd day；3.The 3rd day圖5　BVDV病毒載量分析Fig.5　Analysis graph of viral load

2.6樹突狀細胞Th1和Th2型細胞因子mRNA轉錄水平分析

采用半定量RT-PCR方法擴增牛外周血來源樹突狀細胞IL-12p40、IL-10基因及其內參基因GDPAH，與正常對照組相比，接毒組IL-12p40的mRNA轉錄水平低于正常對照組，差異顯著(P< 0.05)，而IL-10的mRNA轉錄水平則高于對照組，差異顯著(P<0.05)，以上研究結果表明BVDV感染的樹突狀細胞降低了刺激Th1細胞的IL-12p40基因轉錄水平，同時提高了刺激Th2細胞的IL-10基因轉錄水平，誘導免疫反應向Th2型極化漂移，抑制了樹突細胞的免疫功能，見圖6。

1.DC組；2.DC+BVDV組；*.P<0.051.DC group；2.DC+BVDV group；*.P<0.05圖6　IL-12p40、IL-10 mRNA轉錄水平Fig.6　The transcription of IL-12p40 and IL-10 for DC at mRNA level

3討論

DCs是外周免疫系統(tǒng)最強的抗原提呈細胞，能夠感知和捕獲病毒、分泌干擾素、活化特定的炎性細胞因子，也是唯一能激活初始化T淋巴細胞的抗原提呈細胞[10]。DCs 通過與T 細胞相互作用來參與體內的免疫應答，其分泌細胞因子的類型決定后續(xù)免疫應答是Th1型還是Th2型。DCs通過分泌TNF-α、IFN-γ、IFN-β和IL-12可促進Th0向Th1型分化，Th1主要介導細胞免疫，在促進輔助細胞毒性T細胞、NK細胞分化成熟并激活其生物學活性方面具有重要的作用。 DCs通過分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13可刺激Th0向Th2型方向分化，Th2主要介導體液免疫，輔助B細胞增殖、分化[11]。IL-10不僅是Th2分化細胞因子，而且還是免疫反應負調節(jié)因子。IL-10可以抑制B 細胞表面MHCⅡ的表達以及T細胞、NK細胞的免疫功能，在抑制以Th1為主的細胞免疫中發(fā)揮重要作用[12]。正常情況下，Th細胞巧妙地協(xié)調著Th1/Th2的極化水平，維持著細胞和體液免疫應答的平衡[13]，一旦這種平衡發(fā)生偏離，機體將趨向疾病狀態(tài)。在本研究中，BVDV感染后對DCs分泌細胞因子的檢測結果顯示，IL-12p40的mRNA轉錄水平與未感染BVDV組相比明顯(P<0.05)降低，而IL-10的mRNA轉錄水平則顯著(P<0.05)高于未接毒組，表明BVDV感染的DCs降低了刺激Th1細胞分化的IL-12p40基因轉錄水平，同時提高了刺激Th2細胞分化的IL-10基因轉錄水平，提示BVDV在感染DCs的過程中，通過上調抑制性細胞因子IL-10的轉錄來誘導免疫反應向Th2型極化漂移。而且BVDV的感染影響了樹突狀細胞的成熟，抑制了樹突狀細胞的免疫功能，流式分析結果表明BVDV感染導致DCs表面的MHCⅡ類分子、CD40分子、CD80分子均明顯(P<0.01)低于未接毒組。但是我們也發(fā)現(xiàn)BVDV感染DCs后，病毒載量的變化不明顯，沒有顯著差異，說明DCs不是BVDV感染的主要宿主細胞。但是BVDV能夠通過感染DCs，導致DCs形態(tài)學發(fā)生改變。在本研究中觀察到BVDV接種組不規(guī)則細胞增多，外形輪廓模糊，細胞壁溶解界限不清，細胞碎片增多，而未接種BVDV組DCs細胞質透明，細胞刺狀突起明顯，呈典型的DCs形態(tài)。BVDV感染DCs后是否導致了DCs的凋亡還有待進一步的研究。綜上，本研究從DCs免疫表型和DCs誘導Th1/Th2型反應的角度揭示了BVDV對DCs的免疫抑制機制，進一步補充、完善了BVDV抑制DCs功能的現(xiàn)有理論，從新的角度揭示了BVDV的免疫抑制機制，為BVDV的防治提供新靶點和新思路，同時為更加有效地進行以 DCs為基礎的抗病毒免疫治療及BVD新型疫苗設計提供一定的實驗基礎和理論支持，對控制BVD的發(fā)生具有重要意義。

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(編輯白永平)

The Influence of BVDV on Immunophenotype and Th1/Th2 Cytokine Secretion of Bovine Peripheral Blood-derived Dendritic Cells

LIU Jin-ling1，WEI Shu2，ZHAO Yu-jun1，HE Jian-bin1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShenyangAgriculturalUniversity，Shenyang110866，China；2.ThePreventiveCenterofAnimalDiseaseofLiaoningProvince，Shenyang110164，China)

Abstract:The objective of this study was to investigate the influence of BVDV on the cell maturation and cytokine level of Th1 and Th2 type in dendritic cells (DC) derived from bovine peripheral blood，and to further reveal the immune mechanism of BVDV infection.The monocytes from bovine peripheral blood were separated and induced into DCs，and then were co-cultured with BVDV.The cell morphology and the expression of MHCⅡ，CD80 and CD40 on DCs were observed by microscopy and flow cytometry respectively，the semi-quantitative RT-PCR was used to analyzeIL-12p40 of Th1 type cytokines andIL-10 of Th2 at mRNA levels.The results showed that DCs had typical morphology and immunophenotype with 93.81% purity.Post BVDV infection，the MHCII molecules，CD40 molecules and CD80 molecules were greatly lower than that of the control groups，the differences were statistically significant (P<0.01).IL-12p40 mRNA level was down-regulated，whileIL-10 mRNA level was up-regulated，the differences were significant (P<0.05) compared with the control groups.These results indicated that BVDV infection to DC plays an important role on maturation and regulating the balance of Th1/Th2.

Key words:BVDV；dendritic cell；immunophenotype；Th1/Th2

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.016

收稿日期：2015-05-20

基金項目：遼寧省博士啟動項目(20141057);大學生科技創(chuàng)新項目(201339)

作者簡介：劉金玲(1977-)，女，遼寧沈陽人，講師，博士，主要從事微生物與免疫學研究，E-mail：ljlfree@sina.com *通信作者：何劍斌，E-mail：wsfree@163.com

中圖分類號：S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0536-07