李鵬飛，孟金柱，于雪靜，龐鈺瑩，杜海燕，李曉明，姚曉磊，趙妙妙，呂麗華*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801)

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外源性dsRNA 對蛋雞卵泡CART基因表達及雌激素和孕酮分泌的影響

李鵬飛1，孟金柱2，于雪靜2，龐鈺瑩2，杜海燕2，李曉明2，姚曉磊2，趙妙妙2，呂麗華2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801)

摘要：旨在研究雙鏈RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)對海蘭褐蛋雞卵泡可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(Cocaine-and amphetamine-regulated transcript，CART)基因表達及雌激素(Estrodiol，E2)和孕酮(Progestin，P)分泌的影響。選擇60只20周齡海蘭褐蛋雞，全價日糧預飼30 d后，隨機平均分為3個處理組：對照組(A組)、dsRNA每5 d注射1次(B組)、dsRNA僅第1天注射1次(C組)；30 d后每組各選擇10只健康蛋雞宰殺，分別采集3～5、6～8、9～12 mm卵泡，提取總RNA進行qRT-PCR檢測；并對E2和P濃度進行測定。結果顯示：注射dsRNA后，處理組B和C組CART表達量與對照組相比均降低，且在6～8 mm卵泡CART表達量顯著低于對照組(P<0.05)；B組注射dsRNA后，可顯著提高6～8、9～12 mm卵泡E2的分泌(P<0.05)；但各處理組對各卵泡P濃度無顯著影響。表明體外靜脈注射dsRNA可抑制蛋雞卵泡CART的表達，并進一步通過促進卵泡細胞E2的分泌來影響卵泡的發(fā)育。

關鍵詞：蛋雞；卵泡；CART；雙鏈RNA；雌激素；孕酮

蛋雞卵泡發(fā)育過程中有成熟卵泡和未成熟卵泡之分。未成熟卵泡可分為直徑<2 mm小白卵泡、3～5 mm的大白卵泡、6～8 mm小黃卵泡和9～12 mm大黃卵泡[1-2]，其中每天都有6～8 mm卵泡發(fā)育成排卵前卵泡[3-4]，經(jīng)5～10 d的終分化排卵[5-6]。蛋雞卵泡閉鎖特點是胞漿內(nèi)有紅細胞、膜細胞和顆粒細胞侵入，多出現(xiàn)在2～8 mm卵泡[7]，而9～12 mm卵泡很少閉鎖[6]。蛋雞卵巢大約包含4 000個原始卵泡，每個原始卵泡都有潛力形成一枚蛋黃，但只有不足1/4卵泡能夠發(fā)育成熟和排卵，其余均在卵泡發(fā)生過程中閉鎖和退化。卵泡發(fā)育中，促性腺激素對促進卵泡細胞的生長和增殖以及誘導排卵具有重要作用。研究表明，E2對調(diào)節(jié)卵泡的遞次發(fā)育具有重要作用，E2在垂體前葉抑制FSH和排卵誘導素(OIH)的分泌，高濃度P抑制FSH和OIH的分泌，進而抑制卵泡發(fā)育和排卵。

CART是動物體內(nèi)廣泛分布的內(nèi)源性神經(jīng)肽，研究證實CART對牛[8-9]、豬[10]、綿羊[11]卵泡顆粒細胞的生長增殖及E2的分泌具有抑制作用。課題組前期研究已證實，CART在蛋雞卵泡中有表達，并獲得230 bp雞卵泡CART序列[12]。而dsRNA在動物組織或細胞內(nèi)可抑制同源序列的基因表達，引起干擾素反應。本試驗探索性研究靜脈注射dsRNA對蛋雞不同大小卵泡內(nèi)E2和P濃度的影響，探討靜脈注射dsRNA的可行性及其對雞卵泡發(fā)育的影響，為后期研究提供技術和思路上的指導。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物及組織本試驗蛋雞來自于偏關縣新牧畜禽養(yǎng)殖有限公司，選擇60只20周齡健康海蘭褐蛋雞，全價日糧預飼30 d，并經(jīng)30 d試驗，屠宰后采集不同大小卵泡，4 ℃ DPBS中保存。

1.1.2試劑dsRNA(TaKaRa，大連)，雞E2Elisa Kit試劑盒、PROG Elisa Kit試劑盒(DRG，德國)。

1.1.3溶液的配制新合成的dsRNA為粉末狀，開蓋前離心5 min，加入滅菌超純水振蕩混勻，終濃度為0.1 mol·mL-1。

1.2試驗方法

1.2.1qRT-PCR引物設計與合成根據(jù)課題組前期測定的蛋雞CART序列設計qRT-PCR引物；以GenBank提供的雞β-actin基因作為內(nèi)參基因，Primer 5.0在線設計引物，由TaKaRa公司合成，引物見表1。退火溫度60 ℃。

表1　qRT-PCR引物

1.2.2dsRNA的設計與合成根據(jù)本課題組前期獲得雞、豬、羊CART序列結合GenBank公布的其他動物CART序列，DNAStar序列比對獲得蛋雞CART的高保守區(qū)，依據(jù)dsRNA設計原則，將5′-GAGCCCTGGACATCTACTCCGC-3′及其互補鏈作為CART dsRNA序列，交由TaKaRa公司合成。

1.2.3卵泡分離預飼30 d后，翅膀內(nèi)側(cè)翅靜脈注射dsRNA。B組每5 d注射1次，共注射6次；C組僅在第1天注射1次，每次劑量200 μL，A組以生理鹽水代替；30 d后各組分別選擇10只精神狀態(tài)較佳的蛋雞屠宰，分別采集3～5、6～8、9～12 mm的卵泡各3枚，投入4 ℃ DPBS的EP管中備用。

1.2.4總RNA的提取及qRT-PCR將不同大小卵泡分別投入液氮預冷研缽中，加液氮研成粉末，轉(zhuǎn)移至裝有RNAiso Plus EP管，樣品充分融化，4 ℃12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至裝有200 μL氯仿的EP管中，混勻后靜置5 min；4 ℃12 000 r·min-1離心15 min；吸取上清液轉(zhuǎn)移至裝有同體積異丙醇的EP管中，混勻后，靜置10 min；4 ℃12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，底部白色沉淀即RNA。

電泳檢測后，核酸蛋白測定儀檢測總RNA的濃度和純度。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進行qRT-PCR，每組樣品重復6次，技術重復3次，反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，60個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。

1.2.5抽取卵泡液在超凈臺上，分別將不同大小卵泡轉(zhuǎn)移到無菌表面皿上，手術剪剪開卵泡，刮刀小心刮取卵泡膜內(nèi)層，2.5 mL無菌注射器及5.5號針頭預潤后，緩慢抽取各組卵泡液，保存至EP管中并分別標記(注意更換注射器和針頭)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6E2和P的測定本試驗E2和P的測定使用雞E2Elisa Kit試劑盒和PROG Elisa Kit試劑盒進行測定，試驗步驟參照說明書。各組OD值都先減除空白值后分別計算。以標準品8 000、4 000、2 000、1 000、500、250、125、0 ng·mL-1為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線；并根據(jù)OD值在標準曲線圖上分別查出相應E2和P濃度，乘上稀釋倍數(shù)即為實際濃度。

1.2.7數(shù)據(jù)處理與分析檢測結果用4次重復“平均值±標準誤”表示，Excel 2010作圖，SPSS(Statistic package for social science 18.0)對各指標進行線性相關分析。

2結果

2.1不同直徑卵泡CART表達量分析

經(jīng)ΔΔCT算法對不同處理組CART在不同直徑卵泡的表達量進行分析，結果顯示：對照組中，6～8 mm卵泡CART表達量顯著高于3～5、9～12 mm卵泡；注射dsRNA后，與對照組相比，6～8 mm卵泡CART表達量顯著降低(P<0.05)，9～12 mm卵泡C處理組與對照組A差異顯著(P<0.05)；3～5 mm卵泡注射dsRNA后，與對照組相比，CART表達量不存在顯著差異，但呈下降趨勢(圖1)。該結果表明：蛋雞翅靜脈注射dsRNA后，會不同程度抑制卵泡CART表達，其中6～8 mm處理組表達量顯著下降。

上標小寫字母表示在顯著水平0.05的比較結果，字母相異表示差異顯著，字母相同表示差異不顯著。下同Superscript small letters indicate significantly different at the level of 0.05.Values with the same letters were not significantly different and values with the different letters were significantly different.The same as below圖1　不同直徑卵泡中CART表達量分析Fig.1　Analysis of CART relative expression in different diameter follicles

2.2不同直徑卵泡E2和P水平測定

利用雞E2Elisa Kit試劑盒和PROG Elisa Kit試劑盒、酶標儀對各組卵泡液E2、P進行測定，經(jīng)顯著性檢驗(圖2)，結果顯示：對照組9～12 mm卵泡E2濃度顯著高于3～5、6～8 mm卵泡(P<0.05)；B組9～12 mm卵泡E2濃度顯著高于3～5、6～8 mm卵泡，且顯著高于對照組和C組(P<0.05)；C組不同直徑卵泡E2濃度不存在顯著差異(圖2A)。P濃度測定結果顯示：A組、B組、C組6～8 mm卵泡P濃度顯著高于其它直徑卵泡(P<0.05)；不同直徑卵泡各組內(nèi)P濃度差異不顯著(圖2B)。

3討論

dsRNA在干擾基因表達和功能執(zhí)行中具有(1)特異性：dsRNA只引起與其同源的mRNA降解；(2)高效性：微量dsRNA即可有效抑制目的基因表達；(3)可傳播性：dsRNA可跨膜發(fā)揮作用，局部注射能夠傳播到整個機體。因此，dsRNA干擾技術受到廣泛關注。本試驗選擇不同時間間隔通過雞翅靜脈注射dsRNA，研究dsRNA對蛋雞卵泡CART表達的抑制效果，目的在于驗證dsRNA體外注射后，血液中的相關酶類是否對dsRNA進行酶解，能否運送到卵泡發(fā)揮其干擾CART的表達；結果表明體外注射特異性dsRNA可引起蛋雞卵泡CART表達發(fā)生顯著變化。蛋雞6～8 mm 卵泡是卵泡走向閉鎖或繼續(xù)發(fā)育為優(yōu)勢卵泡的轉(zhuǎn)折點[5，12]，本研究qRT-PCR結果顯示，6～8 mm卵泡CART表達量顯著高于3～5、9～12 mm卵泡，這表明CART 可能是蛋雞卵泡發(fā)育的關鍵影響因素之一。

圖2　各處理組不同直徑卵泡中E2和P濃度顯著性分析Fig.2　Significant analysis of E2and P concentration in different diameter follicles and treatment groups

本研究中9～12 mm卵泡處理組C與對照組A差異顯著，但與處理組B不存在顯著差異，該結果還需要在后期研究中進行驗證。dsRNA每5 d注射1次(B組)及僅在第1天注射1次(C組)均會不同程度抑制卵泡CART的表達。本課題組在前期通過免疫組化技術對蛋雞不同大小卵泡CART表達進行了研究，包括直徑<2 mm卵泡在內(nèi)，CART在蛋雞卵巢卵母細胞、膜層細胞和顆粒層細胞均有表達，且膜層表達量高于顆粒層細胞，在6～8 mm 卵泡CART表達量最高[12]。在本研究中，選擇3～5、6～8、9～12 mm卵泡作為檢測CART表達量的樣本；直徑<2 mm的卵泡從顆粒細胞、膜細胞的分離、卵泡液的抽取及樣本量上，沒有可操作性，故未作為試驗樣本。

A.Sen等[13]對CART的信號傳導通路進行了研究，結果表明：CART高度抑制FSH誘導的卵泡顆粒細胞cAMP水平的升高，并抑制E2的積累以及芳香化酶mRNA的表達。Ca2+對FSH誘導的卵泡顆粒細胞cAMP水平的升高以及E2的積累是必需的，而CART能明顯抑制FSH誘導的Ca2+流入。2008年A.Sen等[8]提出牛卵泡顆粒細胞內(nèi)CART作用機制的模型。該模型表明，F(xiàn)SH刺激Erk1/2和 Akt激活，而CART則加速該信號的終止，CART單獨刺激并誘導牛卵泡顆粒細胞Erk1/2激活過程中Go/i-PKC-MEK依賴的通路。是否CART誘導Go/i蛋白直接使PKC磷酸化，然后激活MEK和Erk1/2，或者是否Erk1/2通過PKC依賴的方式被激活，這些機理仍不清楚。CART刺激Erk1/2 激活是不依賴于PKA、PI3K、和RTK，雙特異性磷酸酶5(Dual specificity phosphatase 5，DUSP5)的表達依賴于Erk1/2。CART誘導DUSP5表達，功能上需要CART誘導Erk1/2信號的終止和通過Erk1/2依賴的轉(zhuǎn)錄機制的調(diào)節(jié)。而對于蛋雞卵泡，其P的分泌是由顆粒細胞執(zhí)行該功能的，這與牛卵巢P的分泌機制不同，在整個信號傳導過程中，CART表達量及信號通路的變化也會影響到芳構化酶CYP19A1 的表達，進而影響P的分泌。

家禽卵泡P的合成主要由顆粒細胞執(zhí)行，從原始卵泡到排卵卵泡的整個發(fā)育進程中，LH和FSH協(xié)同作用于卵泡細胞，調(diào)節(jié)并促進P和E2合成、卵泡成熟和排卵有序進行[19-20]。雄激素和E2生物合成以P作為前體物，P濃度適量時促進卵泡成熟和排卵；濃度較高則抑制FSH和LH的分泌與調(diào)節(jié)過程，進一步會抑制雞卵泡發(fā)育和排卵[21-24]。本試驗結果表明：3～5、6～8、9～12 mm卵泡各處理組內(nèi)P濃度差異不顯著，僅在6～8 mm卵泡內(nèi)P濃度顯著高于其它直徑卵泡，這也進一步證明蛋雞6～8 mm卵泡是走向閉鎖或繼續(xù)發(fā)育為優(yōu)勢卵泡的轉(zhuǎn)折點。

4結論

外源性dsRNA干擾后可不同程度降低蛋雞卵泡CART的表達，并進一步通過影響卵泡顆粒層和膜層細胞P和E2的合成與分泌，對蛋雞卵泡的發(fā)育及排卵過程發(fā)揮調(diào)控作用。

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(編輯程金華)

Effects of Exogenous dsRNA onCARTGene Expression and Secretion of Estrodiol and Progestin in Layer Follicles

LI Peng-fei1，MENG Jin-zhu2，YU Xue-jing2，PANG Yu-ying2，DU Hai-yan2，LI Xiao-ming2，YAO Xiao-lei2，ZHAO Miao-miao2，Lü Li-hua2*

(1.CollegeofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

Abstract:To investigate the effect of double-stranded RNA(dsRNA) on cocaine-and amphetamine-regulated transcript(CART) gene expression and estrodiol(E2) and progestin(P) secretion in follicles of Highland Brown Laying hen.A total of 60 healthy layers at 20-week-old were selected and randomly divided into 3 experimental groups(A group：control group；B group：with treatment of dsRNA intravenous injection every 5 d；and C group：with treatment of dsRNA one initial injection).After 30 d of feeding，the different size of 3-5，6-8，9-12 mm follicles of 10 layers from each group were collected for analyzing mRNA expression of CART and determining the concentration of E2and P.The results showed that mRNA expression of CART was decreased in group B and C，compared with the control group.Especially，mRNA expression of CART in 6-8 mm follicle was lower than that in the control group with significant difference(P<0.05);The levels of E2was increased in the follicles with the size of 6-8 and 9-12 mm in group B with significant difference(P<0.05)；However，there was no significant difference in the level of P among different treatment groups.The results suggested that intravenous injection of dsRNA could affect the follicular development through inhibiting the mRNA expression of CART and promoting the E2production in layer.

Key words:hen；follicle；CART；dsRNA；estrodiol；progestin

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.013

收稿日期：2015-08-26

基金項目：國家自然科學基金(31172211)；農(nóng)業(yè)部948項目(2010-Z43)；山西省橫向協(xié)作與委托項目(2010HX54)；山西省回國留學人員科研資助項目(2014-重點5)；山西省科技攻關項目(20130311027-2)；山西省人事廳人才引進項目；山西農(nóng)業(yè)大學引進人才博士科研啟動費(2014ZZ04) ；科研管理費資助重大項目和標志性成果培育項目(71060003)

作者簡介：李鵬飛(1978-)，男，山西偏關人，博士，副教授，主要從事動物生殖生理方面的研究，E-mail：adamlpf@126.com *通信作者：呂麗華，E-mail：lihualvsxau@126.com

中圖分類號：S831.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0515-06