陳　瑞，楊曉農(nóng)，曾婉秋，文　娟

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

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家兔不同發(fā)育階段和組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

陳瑞，楊曉農(nóng)*，曾婉秋，文娟

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

摘要：本研究旨在篩選出新西蘭白兔不同時期不同器官中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。以胚胎期(E28.5)、幼齡期(10d)和成年期(A)3個階段的新西蘭白兔的腎、心和肝3種組織作為研究對象，按照RT-qPCR試驗最低要求試驗信息量(MIQE)的指導(dǎo)，運用RT-qPCR和在線內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價工具RefFinder，比較6個常用的內(nèi)參基因(GAPDH、HPRT1、18S rRNA、B2M、Sdha、β-actin)mRNA的表達穩(wěn)定性。結(jié)果表明，新西蘭白兔的肝和腎組織中的6個內(nèi)參基因在3個發(fā)育階段最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH，而在心組織中最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是β-actin、HPRT1、Sdha。在新西蘭白兔胚胎期的3種組織中，最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是GAPDH、β-actin、HPRT1，而在幼齡期和成年期最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是HPRT1、GAPDH、β-actin。對新西蘭白兔的3個發(fā)育階段和3種組織的內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果分析表明，最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH。本研究證實，新西蘭白兔不同的發(fā)育時期和組織中，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因不同。推薦在進行新西蘭白兔的相關(guān)試驗時，可以選擇上述表達最穩(wěn)定的至少3個內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)RT-qPCR數(shù)據(jù)的指標(biāo)，以確保試驗組個體間的差異最小，和小變量的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)分析。

關(guān)鍵詞：內(nèi)參基因；表達穩(wěn)定性；MIQE；RefFinder

實時定量PCR基于熒光信號，可以用于定量基因轉(zhuǎn)錄水平的研究，是用來了解基因表達量和功能的技術(shù)。它是研究基因差異表達最常用的技術(shù)，具有特異、靈敏、快速和高通量等優(yōu)點，在生命科學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。在某一點cDNA擴增產(chǎn)生的可接受熒光信號會轉(zhuǎn)化成cyclethreshold(Ct)，take-offpoint(TOP)或者quantificationcyclenumber(Cq)[1-2]。在相對定量檢測中，對來自不同樣本中特定基因的mRNA表達量水平進行比較分析時，理想的條件是用于制備RNA的各樣品起始細胞數(shù)相同，RNA的提取效率及反轉(zhuǎn)錄效率相同。但實際上這些條件不可能同時得到滿足，許多因素可能導(dǎo)致測量不一致，例如測量的組織細胞不同的數(shù)量和類型、RNA提取效率、mRNA處理技術(shù)、mRNA完整性、反轉(zhuǎn)錄的方法和效率、分析檢測方法等[3-4]。為了確定結(jié)果的準(zhǔn)確性、特異性和標(biāo)準(zhǔn)化，必須控制這些因素[5]。

內(nèi)參基因是一種維持細胞最低限度功能不可缺少的基因。理想的內(nèi)參基因在不同類型細胞和組織中的表達應(yīng)無顯著差異，且不受試驗和臨床條件的影響。由于內(nèi)參基因的表達具有物種及組織特異性，所以其表達的穩(wěn)定性是相對的。為了獲得有意義的試驗數(shù)據(jù)，研究者會根據(jù)特殊的組織及試驗條件來選擇合適的內(nèi)參基因[6-7]。2009年，RT-qPCR試驗最低要求試驗信息量(MinimumInformationforPublicationofQuantitativeReal-timePCRExperiments，MIQE)的發(fā)表給所有RT-qPCR數(shù)據(jù)報道確定了一個準(zhǔn)則[8-9]。這個指南的應(yīng)用確保了發(fā)表的RT-qPCR數(shù)據(jù)更為詳細(包括關(guān)鍵參數(shù)，例如RNA完整度、RT-qPCR質(zhì)量控制和反應(yīng)效率)，同時確定了候選內(nèi)參基因的重要性。

本研究嚴(yán)格按照MIQE的指導(dǎo)，檢測在胚胎期、幼齡期和成年期3個階段新西蘭白兔的3個器官(腎、心、肝)中6個常用的內(nèi)參基因(GAPDH、HPRT1、18S rRNA、Beta-2-microglobulin(B2M)、Sdha、β-actin)的表達穩(wěn)定性[10]。使用最新的內(nèi)參基因穩(wěn)定性在線評價軟件RefFinder(http://www.leonxie.com/referencegene.php) 確定最適合的內(nèi)參基因，即受年齡發(fā)育狀態(tài)影響和不同組織影響最小的基因[11]。RefFinder是基于4種常用算法(geNorm、BestKeeper、NormFinder和comparativedelta-CT)的幾何平均數(shù)的指定權(quán)重法來排列基因穩(wěn)定性的[12-15]。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所有組織來自9只新西蘭白兔。分為胚胎期(E28.5d)、幼齡期(出生后10d)和成年期(A)3組，每組3只。每只采集腎、心、肝部組織，置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2總RNA提取和cDNA合成

腎、心、肝50mg剪碎后加入1mLRNAisoReagent(TaKaRa，日本)，進行總RNA提取。獲得的RNA用50μLDEPC水稀釋，-80 ℃保存。使用分光光度計(BioSpec-nano，日本)測定RNA的濃度和質(zhì)量。并用瓊脂糖凝膠電泳測定28S/18S核糖體RNA的比值，對RNA完整度進行評估。所有RNA樣品的OD260nm/OD280nm比值都為1.7～2.0，而且RNA的完整度較高。cDNA的合成按RTReagents試劑盒(TaKaRa，日本)說明書進行。獲得的cDNA10倍稀釋，置于-80 ℃保存。

1.3引物的特異性鑒定及陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

引物[16](表 1)由生工生物工程有限公司合成(上海，中國)。使用cDNA作為模板進行PCR，擴增6個內(nèi)參基因的目的片段，反應(yīng)條件：95 ℃ 5min； 95 ℃變性40s，60 ℃退火40s，72 ℃延伸30s；72 ℃總延伸10min；16 ℃結(jié)束反應(yīng)。循環(huán)數(shù)為30個?？侾CR反應(yīng)體系為25μL：Mix(TaKaRa，日本)12.5μL，上下游引物各1μL(10μmol·mL-1)，cDNA2μL，ddH2O8.5μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，100V、80mA電泳30min。使用DNA膠回收試劑盒(Axygen，美國)回收目的片段，溶于20μLddH2O。與pMD19-TVector質(zhì)粒載體(TaKaRa，日本)連接。連接體系為SolutionⅠ 5μL，DNA4μL，PMD19-TVector1μL，時間為1h。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TaKaRa，日本)。提取質(zhì)粒(Axygen，美國)，送生工生物工程有限公司進行測序驗證(上海，中國)。質(zhì)粒濃度測定基于全質(zhì)粒，用分光光度計測量濃度(BioSpec-nano，日本)，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。10倍梯度稀釋陽性質(zhì)粒，采用10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-87個濃度梯度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1　擴增6個候選內(nèi)參基因所用的引物

1.4RT-qPCR擴增

使用CFX96(BioRad，美國)熒光定量PCR儀進行兩步法擴增。每個階段的家兔組織都有3個生物學(xué)重復(fù)，每個樣品中各內(nèi)參基因都進行3次RT-qPCR擴增，分別得出各樣本的各內(nèi)參基因Ct值。RT-qPCR前先使用梯度PCR確定最佳退火溫度。10倍梯度稀釋陽性標(biāo)準(zhǔn)品，確定各基因的擴增率和最低檢測下限。RT-qPCR反應(yīng)使用20μL反應(yīng)體系：SYBRGreenⅡ(TaKaRa，日本) 10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA2μL，ddH2O7.2μL。RT-qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3min；95 ℃ 15s；60 ℃ 30s；循環(huán)數(shù)為40個。熔解曲線為55～95 ℃，每15s增加0.5 ℃，用以確定擴增特異性。

1.5表達數(shù)據(jù)分析

通過CFXManager軟件獲得各樣本的原始數(shù)據(jù)，輸入Excel進一步分析。用RefFinder分析所有基因表達的穩(wěn)定性。

2結(jié)果

2.1內(nèi)參基因引物的特異性

對GAPDH、HPRT1、18S rRNA、B2M、Sdha和β-actin 6個基因PCR的擴增產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖電泳(圖1)。6對引物特異性均較好，無引物二聚體，膠回收產(chǎn)物及克隆測序結(jié)果均與目的基因序列完全一致，能夠滿足試驗需要。

M.Marker；1.GAPDH；2.HPRT1；3.18S rRNA；4.B2M；5. Sdha；6.β-actin圖1　目的片段的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1　Agarose gel electrophoresis of target products

2.2陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

采用分光光度計測定質(zhì)粒OD260nm/OD280nm，計算質(zhì)粒濃度和檢測下限(表1)。將10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進行RT-qPCR擴增。熔解曲線分析結(jié)果顯示，RT-qPCR產(chǎn)物只有一個特異峰，無非特異性擴增峰和無引物二聚體。GAPDH、HPRT1、18S rRNA、B2M、Sdha和β-actin 6個內(nèi)參基因的熔解溫度分別為(84.75±0.25)、(82.25±0.25)、86.50、(82.25±0.25)、84.00、(84.75±0.25)℃。以獲得的Ct值為縱坐標(biāo)，拷貝數(shù)對數(shù)值LogCO為橫坐標(biāo)做線性回歸曲線。由圖2和圖3可知，各基因在系列稀釋梯度內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖2　18S rRNA、B2M和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curves of 18S rRNA，B2M and β-actin

圖3　GAPDH、HPRT1和Sdha的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curves of GAPDH，HPRT1 and Sdha

2.3內(nèi)參基因在各組織不同時期的表達穩(wěn)定性

通過對心、肝、肺組織中6個內(nèi)參基因在胚胎期、幼齡期、成年期的表達穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，腎和肝中最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH(圖4)，而在心組織中最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次β-actin、HPRT1、Sdha。在心和肝中，18S rRNA是表達最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因，但在腎中，表達最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是B2M。

2.4內(nèi)參基因在各時期不同組織的表達穩(wěn)定性

在家兔胚胎期的心、肝和肺，最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是GAPDH、β-actin、HPRT1(圖5)，而在幼齡期和成年期最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是HPRT1、GAPDH、β-actin。B2M是胚胎期和幼齡期表達最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因，18S rRNA是成年期表達最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

2.5內(nèi)參基因在不同時期不同組織的表達穩(wěn)定性

分析家兔3個發(fā)育階段和3種組織的內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果表明，表達最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH，而18S rRNA顯示最差的穩(wěn)定性(圖6)。

3討論

已經(jīng)證實，由于內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化過程中的夸大和縮小效應(yīng)，微小的差異很難通過RT-qPCR來定量[12]。內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達對RT-qPCR的標(biāo)準(zhǔn)化是很重要的，但目前并沒有發(fā)現(xiàn)一個內(nèi)參基因在所有細胞、組織、時期或在不同的試驗處理下都能夠穩(wěn)定地表達[17]。在某個組織或時期表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因在其他組織或時期的表達可能相對不穩(wěn)定。其原因可能是動物不同組織在不同時期具有不同的功能和代謝特征，內(nèi)參基因作為維持機體最低限度功能的基因其表達存在差異。為了獲得有意義的試驗數(shù)據(jù)，研究者應(yīng)根據(jù)各自特殊的組織及試驗條件來選擇合適的內(nèi)參基因。

a.家兔心的合適內(nèi)參基因分析；b.家兔腎的合適內(nèi)參基因分析；c.家兔肝的合適內(nèi)參基因分析a.Expression stability of reference genes in different development periods of Oryctolagus cuniculus heart；b.Expression stability of reference genes in different development periods of Oryctolagus cuniculus kidney；c.Expression stability of reference genes in different development periods of Oryctolagus cuniculus liver圖4　內(nèi)參基因在各組織不同時期的表達穩(wěn)定性Fig.4　Expression stability of reference genes in different development periods of Oryctolagus cuniculus tissues

a.家兔胚胎期合適內(nèi)參基因分析；b.家兔幼齡期合適內(nèi)參基因分析；c.家兔成年期合適內(nèi)參基因分析a.Expression stability of reference genes in Oryctolagus cuniculus tissues of embryonic period；b.Expression stability of reference genes in Oryctolagus cuniculus tissues of juvenile period；c.Expression stability of reference genes in Oryctolagus cuniculus tissues of juvenile adult period圖5　內(nèi)參基因各時期不同組織的表達穩(wěn)定性Fig.5　Expression stability of reference genes in Oryctolagus cuniculus tissues in different development periods

圖6　內(nèi)參基因在不同時期不同組織的表達穩(wěn)定性Fig.6　RefFinder analysis comparing the selected reference genes for all timings and all tissues

本研究檢測了新西蘭白兔胚胎期、幼齡期和成年期3個發(fā)育階段的腎、心、肝3種組織中6個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。分析結(jié)果表明，新西蘭白兔的腎和肝組織中的6個內(nèi)參基因在胚胎期、幼齡期、成年期最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH，而在心組織中最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是β-actin、HPRT1、Sdha。在新西蘭白兔胚胎期的心、肝和肺組織中，最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是GAPDH、β-actin、HPRT1，而在幼齡期和成年期最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是HPRT1、GAPDH、β-actin。對新西蘭白兔的3個發(fā)育階段和3種組織的內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果分析表明，最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH。本研究證實不同的時期和器官中，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因不同。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在不同組織、個體、時間和試驗條件下穩(wěn)定表達，但目前沒有單個基因滿足所有這些條件。有報道顯示，使用最穩(wěn)定的至少3個內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)化RT-qPCR數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確的方法[8-9]。因此，本研究推薦研究者在進行新西蘭白兔的相關(guān)試驗時，可以根據(jù)各自試驗的特點，選擇以上表達最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)RT-qPCR數(shù)據(jù)的指標(biāo)，以確保試驗組個體間的差異最小，和微小變量的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)分析。

β-actin是一種真核細胞的細胞骨架蛋白，也是橫紋肌肌纖維中的一種主要蛋白質(zhì)成分和肌肉細絲的主要成分[18-20]。在細胞分泌、遷移及細胞質(zhì)的流動和分離過程中起著重要作用，且在不同的物種間高度保守。A.B.Nygard等[21]證明了β-actin在豬的不同組織表達水平的穩(wěn)定性。E.Jursza等[22]從貓科動物子宮內(nèi)膜的7個內(nèi)參基因中發(fā)現(xiàn)表達最穩(wěn)定的是β-actin。但β-actin作為理想內(nèi)參基因的穩(wěn)定性也一直被質(zhì)疑。M.J.Najafpanah等[23]在篩選山羊不同組織中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因時發(fā)現(xiàn)β-actin的表達變異最大。S.Mamo等[24]研究6個不同發(fā)育階段的單獨胚胎中12個常用內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)不同階段和培養(yǎng)條件下Ppia、H2afz和HPRT1基因是最穩(wěn)定的，而經(jīng)典的內(nèi)參基因β-actin顯示最低的穩(wěn)定性。β-actin的表達穩(wěn)定性存在較大差異，可能是由于研究所用的樣本及樣本間的處理不同，所選擇的共同研究的內(nèi)參種類不同和物種間的差異等。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是糖酵解、糖異生及光合作用過程中的關(guān)鍵酶，在生物進化的早期就已經(jīng)出現(xiàn)，是最為常用的內(nèi)參基因之一。W.Nachar等[25]報道，兔左心室舒張功能紊亂模型中10個內(nèi)參基因中GAPDH和HPRT1基因有高度的穩(wěn)定性。在最近的研究中，次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT1)的穩(wěn)定性得到更多的認可，常被選作內(nèi)參基因進行研究[24-25]。X.Feng等[26]在研究不同日齡梅山豬和約克夏豬骨骼肌11個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性時發(fā)現(xiàn)HPRT1穩(wěn)定性較好。

4結(jié)論

MIQE指南的應(yīng)用為RT-qPCR分析提供了一個標(biāo)準(zhǔn)，對提高定量轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性和精密分析具有重要意義。本研究檢測了新西蘭白兔胚胎期、幼齡期和成年期3個發(fā)育階段的腎、心、肝3種組織中6個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性。結(jié)果證實，不同的發(fā)育時期和組織中，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因不同。因此，本研究推薦研究者根據(jù)各自試驗的特點，選擇表達最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)RT-qPCR數(shù)據(jù)的指標(biāo)，以確保試驗組個體間的差異最小和小變量的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)分析。

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(編輯郭云雁)

ExpressionStabilityAnalysisofReferenceGenesinDifferentDevelopmentPeriodsandTissuesinOryctolagus Cuniculus

CHENRui，YANGXiao-nong*，ZENGWan-qiu，WENJuan

(College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China)

Abstract:ThepurposeofthisstudywastoscreenthemoststablereferencegenesindifferentdevelopmentperiodsandtissuesinNewZealandWhiterabbit.Quantitativereal-timePolymeraseChainReaction(RT-qPCR)，alatestonlinereferencegenesstabilityassessmenttoolRefFinderandMinimumInformationforPublicationofQuantitativeReal-timePCRExperiments(MIQE)guidelinewereusedtocomparetheexpressionlevelsof6commonlyusedreferencegenes(GAPDH，HPRT1，18S rRNA，B2M，Sdha，β-actin)mRNAin3tissues(heart，liver，kidney)ofrabbitatembryo(E28.5)，juvenile(10d)andadultstages(A).TheresultshowedthatthemoststablereferencegenesinliverandkidneyofNewZealandWhiterabbitin3developmentperiodswereβ-actin， HPRT1andGAPDH，successively.Butforheart，theywereβ-actin，HPRT1， Sdha.ThemoststablereferencegenesinembryoperiodofNewZealandWhiterabbitin3tissueswereGAPDH，β-actinandHPRT1，successively.Forjuvenileandadultstages，theywereHPRT1，GAPDHandβ-actin.Toall3periodsandall3tissuesofNewZealandWhiterabbit，themoststablereferencegenesweresuccessivelyβ-actin，HPRT1andGAPDH.ThisstudyconfirmedthatthemoststablereferencegenesweredifferentindifferentperiodsandtissuesofNewZealandWhiterabbit.Toensureminimalvariationbetweenindividualsinanexperimentalgroupandtheaccuratestatisticalanalysisofsmallfoldchanges，werecommendnormalizingRT-qPCRdatatothegeometricmeanofatleast3validatedreferencegenesasabovewhenrelatedNewZealandWhiterabbittrialswereperformed.

Keywords:referencegenes；expressionstability；MIQE；RefFinder

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.008

收稿日期：2015-03-04

基金項目：西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點建設(shè)項目 (2014XWD-S0906)

作者簡介：陳 瑞(1989-)，男，安徽渦陽人，碩士生，主要從事臨床獸醫(yī)研究，E-mail: 18010619617@163.com *通信作者：楊曉農(nóng)，教授，E-mail：yangxn058@163.com

中圖分類號：S829.1；S813.3

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0477-07