廖紅海，林亞秋，鄔楊楠，朱武政，李　倩，王　永*，陳　娟

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

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山羊DLK1基因分子克隆、生物信息學(xué)分析及表達(dá)研究

廖紅海1，2，林亞秋1，鄔楊楠1，朱武政1，2，李倩1，2，王永1，2*，陳娟1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

摘要：本研究旨在克隆山羊DLK1基因，預(yù)測(cè)編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，同時(shí)研究該基因在山羊組織器官中的表達(dá)規(guī)律及其與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性。以簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，采用RT-PCR克隆DLK1基因序列，結(jié)合生物信息學(xué)方法分析其生物學(xué)特性，熒光定量檢測(cè)DLK1mRNA表達(dá)情況，并將表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，克隆得到山羊DLK1長(zhǎng)度為1 137bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為927bp(GenBank登錄號(hào)：KP686197)，編碼308個(gè)氨基酸，山羊核苷酸序列和氨基酸序列與牛的相似性最高(97%)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明山羊與牛親緣關(guān)系最近；生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白屬于不穩(wěn)定酸性疏水蛋白；有8個(gè)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)；亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(44.4%)、高爾基體(33.3%)和質(zhì)膜(22.2%)，屬于分泌跨膜蛋白；具有5個(gè)表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域和2個(gè)表皮生長(zhǎng)因子家族特有的保守結(jié)構(gòu)域EGF-CA；預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)由12.99%β-折疊和87.01%無(wú)規(guī)則卷曲組成的非常規(guī)蛋白。熒光定量PCR結(jié)果顯示，DLK1基因在山羊不同組織中都存在表達(dá)，其在腎中表達(dá)水平最高，在脂肪組織中表達(dá)水平最低；DLK1基因在羔羊背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)水平最高，高于育成羊和成年羊，但差異不顯著(P>0.05)；相關(guān)分析顯示，山羊背最長(zhǎng)肌、腿肌、臂三頭肌中 DLK1mRNA表達(dá)與肌內(nèi)脂肪含量分別呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.6，P<0.05)、無(wú)顯著正相關(guān)(R=0.2，P>0.05)和無(wú)顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.2，P>0.05)。研究結(jié)果顯示，DLK1可能對(duì)山羊肌內(nèi)脂肪沉積起著重要作用。本結(jié)果為進(jìn)一步研究DLK1在肌內(nèi)脂肪沉積過(guò)程中的作用提供了參考。

關(guān)鍵詞：山羊；DLK1；克??；組織表達(dá)；時(shí)序表達(dá)；肌內(nèi)脂肪

羊肉具有高營(yíng)養(yǎng)、低脂肪、低膽固醇，口感好，獨(dú)特風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn)，并且羊以草食為主，很少飼喂添加劑，羊肉中藥物殘留量極低，符合當(dāng)今綠色安全食品的消費(fèi)觀念，受到人們的親睞。肌內(nèi)脂肪(Intramuscularfat，IMF)是骨骼肌內(nèi)沉積的脂肪[1]，對(duì)肉的風(fēng)味、嫩度和多汁性有著重要的影響[2]，它的含量與肉的嫩度、口感和多汁性等呈正相關(guān)[3-4]。IMF的沉積主要取決于肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的發(fā)育及其相互作用，深入挖掘影響肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)候選基因是當(dāng)前畜牧工作者研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

DLK1(Delta-likehomolog1)是表皮生長(zhǎng)因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)家族成員之一，在細(xì)胞膜外含有6個(gè)串聯(lián)的EGF結(jié)構(gòu)域，首次發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤中。具有抑制前脂肪細(xì)胞分化的作用，又被稱為脂肪前體細(xì)胞因子l(Preadipoeytefactor-l，pref-l)，胚胎抗原1(Fetalan-tisenl，F(xiàn)AI)[5]。人的DLK1基因定位于14號(hào)染色體上，小鼠定位于12號(hào)染色體[6]，綿羊定位于18號(hào)染色體[7]，牛定位于21號(hào)染色體[8]。在機(jī)體代謝中DLK1具有重要調(diào)控作用，如調(diào)節(jié)脂肪的形成，骨骼肌的分化[9]和抑制造血干細(xì)胞分化與繁殖[10]。DLK1能影響轉(zhuǎn)基因小鼠和Callipyge綿羊的葡萄糖代謝以及組織中脂肪的積累[11]。在綿羊上Callipyge表型與DLK1有關(guān)[12]，DLK1表達(dá)上升可能是Callipyge表型肌肉肥大的主要原因[13]。另外，通過(guò)異位表達(dá)綿羊DLK1的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)全身性的肌肉肥大，當(dāng)缺乏DLK1時(shí)則表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢[14]。以上研究表明DLK1可能參與調(diào)控動(dòng)物肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

目前，對(duì)DLK1的研究主要集中在人胚胎組織、癌癥與腫瘤[10]，在豬[15]、牛[16]、小鼠[17]上均已克隆得到 DLK1的全長(zhǎng)cDNA序列，山羊上僅見(jiàn)DLK1部分cDNA序列報(bào)道[18]，未見(jiàn)關(guān)于山羊DLK1基因序列的生物學(xué)特征，及其是否可以作為肌內(nèi)脂肪沉積候選基因的報(bào)道。因此，本研究通過(guò)克隆簡(jiǎn)州大耳羊DLK1基因序列，闡明其組織及時(shí)序表達(dá)譜，并同時(shí)對(duì)肌肉組織中該基因的mRNA表達(dá)水平與IMF含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究DLK1在山羊肉質(zhì)調(diào)控中的作用提供理論依據(jù)，為山羊的品種選育提供新的思路。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料和試劑

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物及組織的采集以四川省簡(jiǎn)陽(yáng)市簡(jiǎn)州大耳羊公羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，取相同條件下飼養(yǎng)健康、生長(zhǎng)良好的羔羊、育成羊和成年羊各6頭，現(xiàn)場(chǎng)屠宰。成年羊采集心、肝、脾、肺、腎、皮下脂肪、背最長(zhǎng)肌、腿肌和臂三頭肌等樣本，迅速用DEPC處理水沖洗，裝入處理的凍存管，標(biāo)記，立即置于液氮中保存，用于提取RNA；背最長(zhǎng)肌、腿肌和臂三頭肌同時(shí)各另采集200g，錫箔紙包裹迅速保存于-20 ℃，用于測(cè)定IMF含量。羔羊和育成羊均采集背最長(zhǎng)肌樣品，迅速用DEPC處理水沖洗，裝入處理的凍存管，標(biāo)記，立即置于液氮中保存，用于提取RNA。1.1.2主要試劑Trizol、iQTMSYBR?GreenSupermix與pMD-19TVector均購(gòu)自大連TaKaRa公司，RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit和2×TaqPCRMasterMix均購(gòu)于Fermentas公司，Axygen膠回收試劑盒與DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于天根生化科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DLK1基因的擴(kuò)增及與測(cè)序用Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，根據(jù)RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit試劑盒說(shuō)明合成cDNA。參考GenBank上牛DLK1基因序列(登陸號(hào)：XM_005222112.1)，采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成?？寺◇w系：模板cDNA1μL，上下游引物10μmol·L-1，2 ×TaqPCRMasterMix12.5μL，補(bǔ)滅菌蒸餾水到25μL。反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性4min；94 ℃變性20s，60 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，39個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min。用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，產(chǎn)物與pMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，Amp+平板挑取陽(yáng)性菌落，增菌后PCR鑒定，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1　引物序列、退火溫度及PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度

S.正義鏈引物；A.反義鏈引物。GAPDH.3-磷酸甘油醛脫氫酶

S.Senseprimer；A.Antisenseprimer.GAPDH.Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase

1.2.2DLK1生物信息學(xué)分析利用NCBI網(wǎng)站中的ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找開(kāi)放閱讀框；ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性質(zhì)；NCBI網(wǎng)站上BLAST軟件進(jìn)行同源比對(duì)；MEGA5.0和clustalx1.83構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)；TMHMM預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；NetPhos2.0、NetOGlyc3.1、NetNGlyc1.0分析預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)；PSORTⅡPrediction進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、SMART程序分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；SignalP4.1Server進(jìn)行信號(hào)肽分析；PredictProtein預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)、PHYRE2Server預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3山羊DLK1mRNA表達(dá)分析根據(jù)克隆的山羊DLK1cDNA片段以及內(nèi)參基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)設(shè)計(jì)特異引物(表1)。分別以成年羊的心、肝、脾、肺、腎、脂肪和背最長(zhǎng)肌等組織的cDNA為模板，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)DLK1mRNA在成年羊組織的差異表達(dá)；分別以羔羊、育成羊和成年羊的背最長(zhǎng)肌cDNA為模板，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)DLK1mRNA的時(shí)序表達(dá)；分別以成年羊背最長(zhǎng)肌、腿肌和臂三頭肌cDNA為模板，熒光定量PCR，用于DLK1mRNA表達(dá)量與IMF相關(guān)性分析。反應(yīng)體系為20μL： 包括SYBRGreen10μL，cDNA1μL，上、下游引物各 1μL，RNaseFreeddH2O7μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3min；95 ℃變性10s，65 ℃/60 ℃退火 20s，72 ℃延伸30s，39個(gè)循環(huán)，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。1.2.4IMF含量的測(cè)定與數(shù)據(jù)分析肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，采用索氏抽提法測(cè)定(GB/T5009.6-2003)。熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行處理計(jì)算，試驗(yàn)結(jié)果用SPSS18.0中ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，以Duncan法進(jìn)行多重比較。用SPSS18.0中CORR程序?qū)LK1mRNA表達(dá)量與IMF含量進(jìn)行相關(guān)性分析，以Pearson作相關(guān)系數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果

2.1山羊DLK1基因克隆鑒定和序列分析

2.1.1目的基因片段的鑒定通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)(圖1)，得到克隆產(chǎn)物條帶單一特異片段，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期目的片段大小相符。

M.DL2000 marker；1.DLK1圖1　DLK1 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　Amplification of DLK1 gene in goat

2.1.2核苷酸序列分析測(cè)序長(zhǎng)度為1 137bp，并提交至GenBank(登錄號(hào)：KP686197)，其ORF長(zhǎng)度為927bp，共編碼308個(gè)氨基酸(圖2)。進(jìn)一步分析其堿基序列組成，A=16.6%，C=35.6%，G=29.6%，T=18.2%，X=0.0%。G+C=65.2%，高于(A+T)%，說(shuō)明DLK1基因CDS區(qū)DNA雙鏈較穩(wěn)定。

上面為核苷酸序列，下面為氨基酸序列；*表示終止子；陰影部分為信號(hào)肽序列；預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)用下劃線表示The upper sequence indicates the nucleotide and the lower shows the amino acids；Asterisk represents stop codon；The shade indicates the signal peptide sequence；The predicted transmembrane domains is underlined圖2　DLK1 cDNA序列及其分析Fig.2　DLK1 cDNA sequence and analysis

2.2山羊DLK1與其他物種同源比較

通過(guò)NCBI進(jìn)行同源性在線分析，將山羊DLK1基因與GenBank已經(jīng)公布的物種牛(BC120429.1)、野豬(DQ309458.1)、人(U15981.1)、小家鼠(NM_001190704.1)以及大鼠(BC167752.1)等5個(gè)物種核苷酸序列以及氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示(表2)，山羊與牛的相似性最高。通過(guò)MEGA5.0和clustalx1.83構(gòu)建核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。結(jié)果顯示，山羊與牛聚為一支，符合物種進(jìn)化規(guī)律。

2.3DLK1編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.3.1理化性質(zhì)分析山羊DLK1蛋白分子式

表2　山羊DLK1基因核苷酸和氨基酸序列與其他動(dòng)物的一致性分析

圖3　采用MEGA5.0構(gòu)建DLK1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3　Phylogenetic tree of DLK1 gene constructed by MEGA5.0

為C1412H2194N390O445S39，相對(duì)分子質(zhì)量33.00ku，理論等電點(diǎn)(pI)4.66，說(shuō)明該蛋白為酸性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定系數(shù)為43.09，說(shuō)明該蛋白屬于不穩(wěn)定性蛋白[19-20]。疏水指數(shù)73.08，疏水性平均值為0.014，說(shuō)明該蛋白為疏水蛋白。含有20種常見(jiàn)氨基酸殘基中Cys(11%)、Gly(10.1%)、Leu(8.4%)頻率較高，帶負(fù)電荷的氨基殘基(Asp+Glu=36)多于帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys=18)。

2.3.2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析TMHMM在線跨膜分析顯示(圖4)，在230～252位存在一個(gè)跨膜螺旋，表明該蛋白為跨膜蛋白，同時(shí)預(yù)測(cè)1～229氨基酸殘基位于膜外，253～308位于膜內(nèi)。

圖4　DLK1跨膜蛋白分析Fig.4　DLK1 protein transmembrane region analyses

2.3.3DLK1蛋白修飾結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)DLK1蛋白修飾結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)顯示，DLK1蛋白存在8個(gè)磷酸化位點(diǎn)；分別在第120、143、210和280位氨基酸序列共4個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)，第93和95位共2個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)，第111和264位共2個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)。無(wú)O-糖基化位點(diǎn)。在第100位對(duì)應(yīng)天冬氨酰氨殘基的酰胺氮原子存在一個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)，其概率為0.69。

2.3.4亞細(xì)胞定位和蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)DLK1蛋白亞細(xì)胞定位顯示，該蛋白主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(44.4%)、高爾基體(33.3%)和質(zhì)膜(22.2%)中發(fā)揮生物學(xué)作用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(圖5)預(yù)測(cè)表明，山羊DLK1含有5個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域，分別位于25～55、56～86、91～125、130～168和173～206，跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembraneregion)位于230～252，其結(jié)果與上述預(yù)測(cè)相符。利用NCBI蛋白結(jié)構(gòu)保守域分析軟件，發(fā)現(xiàn)克隆的基因具有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族特有的保守結(jié)構(gòu)域鈣結(jié)合EGF-CA區(qū)。

圖5　DLK1結(jié)構(gòu)域分析Fig.5　DLK1 domains analyses

2.3.5信號(hào)肽分析信號(hào)肽分析結(jié)果(圖6)表明，DLK1蛋白N端有一段疏水性極高序列，其中第24位氨基酸殘基的C-score和Y-score均達(dá)到最大值，分別為0.872和0.908，預(yù)測(cè)該信號(hào)肽區(qū)域位于1～23位氨基酸肽鏈，信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于23～24位氨基酸。

圖6　DLK1信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.6　Prediction of signal peptide in DLK1

2.3.6高級(jí)預(yù)測(cè)與分析二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊占12.99%，無(wú)規(guī)則卷曲占87.01%，無(wú)α-螺旋，沒(méi)有表現(xiàn)出α-類蛋白和β-類蛋白以及α-β類蛋白特性，預(yù)測(cè)該蛋白為非常規(guī)蛋白。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，山羊DLK1蛋白序列與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中c4cbzA模板序列相似性高達(dá)99.5%(圖7)，該結(jié)果同時(shí)也表明山羊DLK1由β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

圖7　DLK1三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7　Putativetertiary structure prediction of DLK1

2.4DLK1表達(dá)分析

2.4.1組織差異分析采用GAPDH作參照基因，熒光定量PCR檢測(cè)DLK1基因在山羊不同組織中的表達(dá)情況，以肝為對(duì)照，結(jié)果顯示(圖8)，DLK1基因在7個(gè)組織中都有表達(dá)，其表達(dá)趨勢(shì)為：腎(10.27)>脾>肝(對(duì)照)>心>肺>背最長(zhǎng)肌>脂肪(0.13)。在腎中表達(dá)最高，極顯著高于的其他組織(P<0.01)；其次是在脾表達(dá)顯著高于肝組織(P<0.05)，極顯著高于其他組織(P<0.01)；其他內(nèi)臟組織，心、肝、肺均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于脂肪和背最長(zhǎng)肌。

2.4.2時(shí)序表達(dá)分析時(shí)序表達(dá)分析顯示(圖9)，在背最長(zhǎng)肌DLK1mRNA豐度中，羔羊(2.05)>成年羊(1.39)>育成羊(1.38)，但差異均不顯著(P>0.05)。

2.5IMF含量測(cè)定及其與DLK1表達(dá)的相關(guān)分析

IMF測(cè)定結(jié)果顯示(表3)，簡(jiǎn)州大耳羊成年公羊中背最長(zhǎng)肌、腿肌和臂三頭肌3個(gè)部位的IMF含量差異不顯著(P>0.05)，并且DLK1基因在背最長(zhǎng)肌、腿肌、臂三頭肌中表達(dá)水平與各自IMF含量分別呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)、無(wú)顯著正相關(guān)(P>0.05)和無(wú)顯著負(fù)相關(guān)(P>0.05)。

n=3。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)n=3.Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05)，and different superscript capital letters indicate extremely significant difference(P<0.01)圖8　山羊DLK1基因的組織表達(dá)Fig.8　Expression of DLK1 in goat tissues

相同大寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)The same capital letters indicate no significant difference(P>0.05)圖9　DLK1基因在不同年齡山羊背最長(zhǎng)肌中的相對(duì)表達(dá)量Fig.9　Relative expression of DLK1 in longissimus dorsi of goat at different ages

3討論

3.1DLK1 基因調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化機(jī)理的探討

DLK1 基因是哺乳動(dòng)物的一個(gè)印跡基因，充當(dāng)Notch途徑抑制劑，果蠅和哺乳動(dòng)物中，DLK1能通過(guò)自身的重復(fù)串聯(lián)EGF結(jié)構(gòu)來(lái)抑制Notch通路，在維持細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要的作用[20]。DLK1蛋白為跨膜蛋白，在不同的動(dòng)物中存在不同的拼接轉(zhuǎn)錄本[21]。通過(guò)綿羊Callipyge表型[16]以及敲除DLK1的小鼠出現(xiàn)骨骼畸形以及肥胖等癥狀[22]，推測(cè)其可能對(duì)肌肉生長(zhǎng)具有作用。

表3　DLK1mRNA表達(dá)量與IMF含量的相關(guān)性分析

*.差異顯著(P<0.05)

*.Significantdifference(P<0.05)

信號(hào)肽的分泌有賴于蛋白質(zhì)N端信號(hào)肽的存在，信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，山羊DLK1信號(hào)肽位于1～23氨基酸殘基，山羊DLK1蛋白的跨膜蛋白氨基酸殘基較短，為23個(gè)氨基酸殘基。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的DLK1基因的跨膜結(jié)構(gòu)同樣較短(23aa)，但也能調(diào)控Notch通道[20]。DLK1與Notch配體有著高度的同源性，其區(qū)別在于DLK1的N端沒(méi)有Notch配體的DSL區(qū)域[23]，在3T3-L1中DLK1能降低Hes-1(Notch1下游靶細(xì)胞因子)的表達(dá)來(lái)抑制Notch1的活性，小鼠的肥胖可能與DLK1通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞Notch通道的表達(dá)有關(guān)，山羊DLK1是否具有小鼠同樣的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)有5個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域與其他研究者一致，缺乏第6個(gè)EGF，可能是第6個(gè)EGF與山羊正常發(fā)育和生理功能無(wú)關(guān)[18]。

3.2DLK1表達(dá)差異分析

在不同組織中基因mRNA表達(dá)分析是研究分子調(diào)控的一種方法，為了解該基因的功能提供有效的信息。DLK1基因在山羊各組織間存在顯著或極顯著差異，這種表達(dá)的差異性可能與DLK1基因在不同組織中的功能有關(guān)。這與其他物種的表達(dá)存在差異，如在豬脂肪組織中DLK1的表達(dá)要高于在心和肝組織的表達(dá)[24]，人和鼠的胚胎時(shí)期，在多種組織中表達(dá)[25]，結(jié)合本研究的結(jié)果表明DLK1基因的表達(dá)具有物種特異性。

在時(shí)序表達(dá)中，山羊背最長(zhǎng)肌DLK1表達(dá)在羔羊中要高于成年羊與育成羊。這可能與DLK1主要在出生早期肌肉中發(fā)揮作用，同時(shí)也與DLK1基因在不同年齡段作用功能不同有關(guān)。

3.3DLK1mRNA與肌內(nèi)脂肪沉積關(guān)系的探討

某些磷酸化位點(diǎn)被磷酸化后，可以導(dǎo)致與肥胖相關(guān)基因的表達(dá)變化與功能失活，如脂聯(lián)素表達(dá)減少，胰島素表達(dá)的變化[26]。預(yù)測(cè)山羊DLK1存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，有研究表明，DLK1通過(guò)引起細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellularregulatedproteinkinases，ERK)蛋白磷酸化，從而激活促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)信號(hào)通路，抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ2(Peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ2，PPARγ)活性，進(jìn)而來(lái)抑制脂肪細(xì)胞的分化[27]。PPARγ為脂肪分化的核心調(diào)控因子，當(dāng)PPARγ被激活之后，細(xì)胞表現(xiàn)出如形態(tài)學(xué)變化以及脂肪積累等多種相應(yīng)的生理效應(yīng)[28]。同時(shí)PPAR為影響IMF含量的候選主效基因，綿羊肌肉中PPAR基因表達(dá)量與IMF的相關(guān)系數(shù)為-0.835[29]。在本研究中，DLK1mRNA表達(dá)量與背最長(zhǎng)肌和臂三頭肌中肌內(nèi)脂肪含量同樣呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，因此推測(cè)，山羊DLK1基因可能通過(guò)這種類似磷酸化機(jī)制來(lái)影響IMF的沉積。在荷斯坦公牛的肌肉中DLK1高表達(dá)(P<0.05)，DLK1通過(guò)與CCAAT/enhancer-bindingproteinbeta(CEBPB)結(jié)合在脂肪細(xì)胞骨骼肌的發(fā)育中起作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)DLK1和脂肪含量呈負(fù)相關(guān)[30]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，DLK1mRNA與藏山羊肌肉組織肌內(nèi)脂肪含量同樣存在相關(guān)性，結(jié)合本試驗(yàn)研究，提示山羊肌內(nèi)脂肪沉積可能有DLK1的參與。肉質(zhì)性狀的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受多基因的控制，目前還有很多亟待解決的問(wèn)題。

4結(jié)論

山羊DLK1分子量為33.00ku，屬不穩(wěn)定疏水酸性分泌蛋白，第1～23個(gè)aa為潛在的信號(hào)肽，有8個(gè)磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)糖基化位點(diǎn)，具有5個(gè)表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域，以及表皮生長(zhǎng)因子家族特有的保守結(jié)構(gòu)域EGF-CA區(qū)。由β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成的非常規(guī)蛋白。DLK1基因在山羊心、肝、脾、肺、腎、脂肪和背最長(zhǎng)肌等組織中均有表達(dá)，同時(shí)在羔羊背最長(zhǎng)肌的表達(dá)量高于育成羊和成年羊，背最長(zhǎng)肌、腿肌和臂三頭肌的mRNA表達(dá)與各自IMF含量具有一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究DLK1在肌內(nèi)脂肪沉積中的作用提供理論基礎(chǔ)。

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(編輯郭云雁)

MolecularCloning，BioinformaticsAnalysisandExpressionofDLK1GeneinGoat

LIAOHong-hai1，2，LINYa-qiu1，WUYang-nan1，ZHUWu-zheng1，2，LIQian1，2，WANGYong1，2*，CHENJuan1

(1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China；2.Key Laboratory of Sichuan Province for Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Exploitation，Chengdu 610041，China)

Abstract:ThepresentstudyaimedtocloneDLK1geneofgoat，predictthestructureandfunctionofpeptoneencodedbyDLK1gene，furtherinvestigateitsexpressionregulationinorgansortissuesofgoatandanalyzethecorrelationbetweenDLK1mRNAexpressionandintramuscularfat(IMF)contentinmuscles.JianzhouDa’ergoatwasusedasexperimentalanimalsandtheRT-PCRtechniquewasemployedtoamplifytheDLK1gene.Thebiologicalcharacteristicsofthisgenewereanalyzedbybioinformatics，andthetissueexpressionspecificityaswellasthedevelopmentstageexpressionspecificityofthisgenewereanalyzedusingthefluorescencequantitativePCR.TheresultsshowedthattheDLK1cDNAwas1 137bpinlength(GenBankaccessionNo.：KP686197)，927bpforORFand308aminoacidsforproteinencoded.ThenucleotidesequenceandthededucedaminoacidssequenceofgoatDLK1shared97%homologywiththeDLK1ofcattle.Accordingly，theclosegeneticrelationshipbetweengoatandcattlewasindicatedbythephylogenetictreeanalysis.TheDLK1proteinwasanunstable，acidityandhydrophobicityprotein.Therewere8phosphorylationsitesand1N-glycosylationsitewithintheDLK1protein.Thisproteinwaslocatedinendoplasmicreticulum(44.4%)，golgi(33.3%)andplasmamembrane(22.2%)，respectivelythroughthesub-cellularlevelprediction.Itwasasecretorytransmembranceprotein.Ithad5domainsoftheEGFfamily，whichhad2EGF-CAofEGFfamilyconservativedomains.Moreover，thesecondarystructureoftheDLK1proteinwascomposedof87.01%randomcoiland12.99%β-sheet，indicatinganunconventionalprotein.Theresultsofreal-timePCRexhibitedthattheDLK1genewasexpressedinvarioustissuesatdifferentlevels.ThemRNAexpressionleveloftheDLK1genewashighestinkidneyandlowestinfat.ThemRNAexpressionleveloftheDLK1geneinlongissimus dorsioflambwasnotsignificanthigherthanthatinlongissimus dorsiofyouthandadultgoat(P>0.05).TheresultsofcorrelationanalysisshowedthatthemRNAexpressionleveloftheDLK1geneinlongissimus dorsiwascorrelatednegativelywithIMFcontent(R=-0.6，P<0.05)，inlegwasnotcorrelatedpositivelywithIMFcontent(R=0.2，P>0.05)，inarmtricepswasnotcorrelatednegativelywithIMFcontent(R=-0.2，P>0.05).TheresultssuggestthattheDLK1genemayplayanimportantroleintheIMFdepositioningoat，whichwouldlayafoundationforfurtherstudiesaboutthefunctionofDLK1geneinIMFdeposition.

Keywords:goat；DLK1mRNA；clone；tissueexpression；temporalexpression；intramuscularfat

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.007

收稿日期：2015-03-12

基金項(xiàng)目：四川省“十二五”畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目(2011NZ0099-36) ；四川省科技創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)痉豆こ讨卮箜?xiàng)目(2014NZ0003)；西南民族大學(xué)研究生“創(chuàng)新型科研項(xiàng)目”(CX2015SZ069)

作者簡(jiǎn)介：廖紅海(1988-)，男，仡佬族，貴州正安人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:liaohonghaivip@163.com *通信作者：王永，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：wangyong010101@swun.cn

中圖分類號(hào)：S827；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0467-10