郭興道，郜苗苗，李婷婷，張癸榮

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24 h快速眼動睡眠剝奪大鼠血清的蛋白質(zhì)組學初步研究

郭興道1，2，郜苗苗1，李婷婷1，2，張癸榮1

目的探討睡眠剝奪大鼠血清蛋白質(zhì)組中差異表達蛋白質(zhì)及其意義。方法采用改良多平臺水環(huán)境法建立24 h快速眼動睡眠剝奪大鼠模型。采用隨機數(shù)字表法將大鼠均分為模型（M）組、模型對照（MC）組、空白對照（BC）組，每組8只大鼠。觀察大鼠體質(zhì)量變化，采用Morris水迷宮實驗檢測睡眠剝奪對大鼠學習記憶能力的影響，并用雙向電泳技術(shù)篩選血清差異蛋白，LC-MS/MS技術(shù)鑒定差異蛋白。結(jié)果BC組和MC組大鼠建模前后體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義。M組大鼠毛發(fā)光澤下降，精神稍差，較亢奮，體質(zhì)量在睡眠剝奪后顯著降低。24 h快速眼動睡眠剝奪對大鼠學習記憶能力無顯著性影響。各組之間蛋白質(zhì)點數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義。質(zhì)譜鑒定出4種表達下降的蛋白，分別為Serotransferrin；Glutathione peroxidase 3；Ig kappa chain C region，B allele；Collagen alpha-2（I）chain。結(jié)論短期睡眠剝奪對機體的損傷可能與鐵離子代謝、氧化應(yīng)激和免疫功能等有關(guān)。

睡眠剝奪；血清；記憶；學習；蛋白質(zhì)組學；大鼠，Wistar

睡眠不足或睡眠質(zhì)量低下造成的睡眠紊亂及帶來的一系列不良后果即睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）綜合征。由于疾病、噪聲和人工照明、工作壓力等諸多因素，SD正成為當代社會的普遍現(xiàn)象。SD能夠引起機體損傷，如學習記憶能力下降［1］、警覺性降低［2］、免疫力下降［3］、心臟損傷［4］、胃腸疾?。?］等。然而，由于SD對機體的影響極其復(fù)雜，其對機體損傷的原因和發(fā)生機制尚不清楚。蛋白質(zhì)組學通過大規(guī)模、高通量、系統(tǒng)化地研究整個基因組在不同時空編碼的全部蛋白質(zhì)的組成、表達、結(jié)構(gòu)、功能及相互之間的作用和活動規(guī)律［6-7］，從而在蛋白質(zhì)整體水平上揭示生命活動的基本規(guī)律，并為相關(guān)疾病病理生理機制提供理論依據(jù)，也為疾病的診斷和治療提供新的蛋白靶點。血清蛋白質(zhì)是血液的重要組成部分，其在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、物質(zhì)運輸及免疫防御等方面具有重要作用，對其進行蛋白質(zhì)組學研究在醫(yī)學、生物學等多個領(lǐng)域具有重要意義。因此，本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學方法，對24 h快速眼動睡眠剝奪（rapid eye movement sleep deprivation，REM SD）大鼠的血清蛋白表達變化情況進行初步研究，為進一步SD研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗動物24只健康雄性Wistar大鼠，SPF級，體質(zhì)量（160±10）g，周齡6～8周，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心［scxk-（軍）2012-0004］，飼養(yǎng)于總后衛(wèi)生部藥品儀器檢驗所動物實驗室［syxk-（軍）20120008］，自由進食飲水，飼養(yǎng)溫度18～24℃，濕度45%～55%，12 h交替照明。

1.2主要試劑三氯乙酸、丙酮、硫酸銨均為國藥集團產(chǎn)品，兩性電解質(zhì)為軍事醫(yī)學科學院產(chǎn)品，Bradford考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒為北京索來寶產(chǎn)品，尿素、硫脲、CHAPS、考馬斯亮藍G-250、三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺和過硫酸銨為AMRESCO產(chǎn)品，cocktail蛋白酶抑制劑為roche產(chǎn)品，DTT為merck產(chǎn)品，預(yù)染蛋白Marker為thermo產(chǎn)品，固相pH梯度干膠條（pH 4～10，17 cm）、低熔點瓊脂糖溶液和礦物油為Bio-Rad產(chǎn)品，Trypsin Gold酶為promega產(chǎn)品，Milli-Q水由Millipower儀制得。

1.3主要儀器離心機（thermo），等電聚焦電泳儀、垂直電泳系統(tǒng)（Bio-Rad），液相色譜儀（Agilent），MicrOTOF-QⅡTMLC-MS/MS（Bruker）。

1.4動物分組與模型建立采用隨機數(shù)字表法將大鼠均分為3組，分別為模型（M）組、模型對照（MC）組、空白對照（BC）組，每組8只。建模前，將M組和MC組大鼠放在水環(huán)境上適應(yīng)1周，每天適應(yīng)1 h。采用改良多平臺水環(huán)境法（MMPM）制備REM SD模型，水溫保持在22℃左右，水面距平臺約1.0 cm，將大鼠放于睡眠剝奪箱內(nèi)平臺上。為排除水環(huán)境造成的影響，設(shè)MC組，采用與M組大小一樣的鼠箱，但在其底部并不放置平臺，而是放置一面細密鐵絲網(wǎng)，將大鼠放在網(wǎng)上，網(wǎng)下置水距離網(wǎng)格1 cm，以形成與M組相似的環(huán)境，其他環(huán)境與M組相同。BC組則于籠中正常飼養(yǎng)。建模期間12 h光照/12 h黑暗（8：00—20：00），大鼠自由飲食和飲水。建模前后稱量大鼠體質(zhì)量。

1.5水迷宮實驗首先進行適應(yīng)性實驗，持續(xù)2 d，每日1次，時間8：00—11：30，將大鼠置于水迷宮中（無平臺）自由游泳90 s。第1天入水點為S（南），第2天入水點為N（北）。大鼠適應(yīng)性實驗完成后，開始定位航行實驗（place navigation test，PNT），連續(xù)5 d，每天訓練4次，時間8：00—14：30。直徑12 cm的黑色平臺調(diào)整為高出池底23.5 cm，放置于SW（西南）象限的中央，加水使水面高出平臺約1.5 cm。同一天的4次訓練入水點均不同，從N、E（東）、NW（西北）、SE（東南）4個點中隨機選擇，同次訓練時所有大鼠入水點相同。訓練時，將大鼠從某個入水點面向池內(nèi)壁放入水中，允許大鼠自由游泳90 s，如在90 s內(nèi)大鼠能找到隱藏于水下的平臺，則記錄從入水至到達平臺的時間為潛伏期，允許其在平臺上停留15 s，觀察四周的空間線索，然后用毛巾擦干放回籠中。如超過90 s仍未找到平臺，則引導其到平臺上，伏期記錄為90 s，同樣允許其在平臺上停留15 s，然后擦干放回籠中。使用攝像頭跟蹤記錄大鼠在水迷宮內(nèi)的運動軌跡，通過計算機分析得出相應(yīng)的潛伏期。大鼠完成連續(xù)5 d的空間學習訓練后，建立24 h REM SD模型，建模后再進行一次PNT實驗。最后進行空間探索實驗（Spatial probe test），撤去平臺，將大鼠從平臺對側(cè)放入水中，測量大鼠于平臺所在目標象限（goal quadrant）中游泳時間所占水中總時間百分比。

1.6血清收集水迷宮實驗完成后，乙醚麻醉大鼠，并立即斷頭處死取血。血液于4℃靜置1 h后，3 000 r/min離心45 min。取上清液再次3 000 r/min，離心10 min。收集血清，并分別將各組的8只大鼠血清等體積混勻，分裝，儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7血清中高豐度蛋白的去除每20 μL血清加入80 μL 含10%TCA的丙酮溶液（V：V），混勻并于-20℃條件下靜置90 min后，在4℃，15 000×g條件下離心20 min。棄去上清，加入1.5 mL預(yù)冷的丙酮清洗血清蛋白沉淀，充分混勻后，在冰中靜置15 min，之后再次4℃，15 000×g離心20 min，棄去上清，再重復(fù)此步驟3次。最后凍干蛋白，用100 μL含cocktail蛋白酶抑制劑的裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、20 mmol/L TRIS、60 mmol/L DTT、0.2%兩性電解質(zhì)）超聲溶解凍干蛋白，分裝并保存于-80℃。

1.8蛋白濃度測定按照Bradford考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒說明書操作。

1.9雙向電泳取1 mg蛋白與適量水化液混勻至350 μL，加至電泳槽內(nèi)，50 V條件下水化16 h，升壓程序依次為250 V線性升壓0.5 h，1 000 V快速升壓1 h，10 000 V線性升壓5 h，10 000 V至總伏小時數(shù)為70 000 Vh，1 000 V快速降壓36 h。等電聚焦結(jié)束之后，進行膠條平衡，然后以150 V 1 h，250 V 4 h進行分離膠濃度為12%的SDS-PAGE電泳。固定液（40%乙醇，10%冰醋酸）固定30 min，“blue silver”膠體考馬斯亮藍G-250染色過夜，Milli-Q水脫色至背景無色，Umax Power Look 2100 XL掃描儀在300 dpi，256色階條件下掃描。PD Quest 8.0軟件篩選出表達變化倍數(shù)大于2倍或小于0.5倍的蛋白點。

1.10差異蛋白鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索切取差異蛋白點，置于0.6 mL的EP管中，進行消化酶解，樣品采用LC-MS/MS質(zhì)譜分析，并用Mascot檢索swissprot數(shù)據(jù)庫，對蛋白質(zhì)進行鑒定。

1.11統(tǒng)計學方法用SPSS 21.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，各組研究資料用x ±s表示，大鼠體質(zhì)量和水迷宮實驗中定位航行實驗采用配對t檢驗；其他采用單因素方差分析，結(jié)合Post-hoc檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠體質(zhì)量情況比較與BC組和MC組大鼠相比，M組大鼠表現(xiàn)亢奮，毛發(fā)光澤有所下降。在SD前后，BC組大鼠體質(zhì)量為（234.21±8.45）g、（242.65± 14.03）g，MC組為（234.00±10.93）g、（238.94±15.35）g，M組為（236.06±8.09）g、（227.00±8.36）g；BC組和MC組大鼠建模前后體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義（n= 8，t分別為1.878和0.715，均P＞0.05）；M組大鼠體質(zhì)量在SD后顯著降低（n=8，t=7.010，P＜0.05）。

2.2學習記憶能力考察M、MC和BC組大鼠建模前后相比，在定位航行實驗中潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（t分別為0.255、0.770、0.289，P＞0.05）；在空間探索實驗中，M、MC和BC組大鼠于平臺所在目標象限中游泳時間所占總時間百分比差異無統(tǒng)計學意義（F=0.201，P＞0.05），見圖1。

A：潛伏期；B：空間探索實驗大鼠于平臺所在目標象限中游泳時間占總時間百分比Fig.1 The effect of sleep deprivation on learningand memory in rats圖1　睡眠剝奪對大鼠學習記憶能力的影響

2.3雙向電泳圖像分析

2.3.1大鼠血清蛋白雙向電泳蛋白點數(shù)分析BC組、MC組和M組蛋白點數(shù)、各組與主膠匹配的蛋白點數(shù)、各組匹配的蛋白點數(shù)占所在凝膠蛋白點數(shù)的百分比（匹配率1）以及各組匹配的蛋白點數(shù)占主膠中蛋白點數(shù)百分比（匹配率2）差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。此外蛋白分子質(zhì)量主要分布在10～95 ku之間，等電點主要分布在4.5～6.5之間，見表1、圖2。

Tab. 1 Comparison of 2-DE maps of rat serum between three groups表1　各組大鼠血清雙向電泳圖譜的比較

Tab. 1 Comparison of 2-DE maps of rat serum between three groups表1　各組大鼠血清雙向電泳圖譜的比較

均P＞0.05

組別BC組MC組M組F蛋白質(zhì)點數(shù)306.67±5.13 301.67±10.69 311.00±3.46 1.287匹配的蛋白質(zhì)點數(shù)284.33±2.52 285.33±3.51 280.00±3.61 2.283匹配率1 （%）92.33±0.58 94.00±4.58 89.33±1.15 2.221匹配率2 （%）80.33±0.58 81.00±1.00 79.00±1.00 4.000

2.3.2差異表達蛋白的篩選與鑒定與BC組和MC組相比，M組均表達變化2倍以上或0.5倍以下的差異蛋白點共有6個，見表2，并對其進行LC-MS/ MS質(zhì)譜測定和數(shù)據(jù)庫檢索。4種蛋白表達均下降，分別為Serotransferrin；Glutathione peroxidase 3；Ig kappa chain C region，B allele；Collagen alpha-2（I）chain，見圖2、表2。

A：BC組；B：MC組；C：M組Fig. 2 2-DE maps of serum sample圖2　血清2-DE圖譜

3　討論

由于當代社會快速發(fā)展，各種主客觀因素如噪聲、疾病和工作等，使得SD的發(fā)生成為常態(tài)，且其對人們生活的不良影響正日益突顯。SD作為強烈的應(yīng)激源，可誘導腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激乃至細胞凋亡以及引起血腦屏障和血-腦脊液屏障的通透性發(fā)生改變或損傷［8-9］，這使得SD后腦組織中的特有蛋白如MBP［10］在血清中發(fā)生變化。此外，SD會引起機體交感迷走神經(jīng)失衡，導致交感神經(jīng)過度興奮，血清中各種細胞因子、激素水平出現(xiàn)異常，進而加劇SD對機體的一系列損傷［11］。研究表明，短期SD即可導致學習記憶能力發(fā)生改變［12］。因此，本文對短期24 h SD模型大鼠進行血清蛋白質(zhì)組學初步研究，以篩選SD損傷機體的標志物或藥物作用靶標。

Tab.2 Identification of differentially expressed proteins表2　差異表達蛋白的鑒定

改良多平臺水環(huán)境法主要利用大鼠畏水原理，將大鼠置于四周環(huán)水的小平臺上，使大鼠進入REM睡眠后因肌張力降低接觸水面而保持覺醒狀態(tài)。MMPM法能幾乎完全剝奪REM睡眠［13-14］；且與其他水環(huán)境法相比，能有效降低各種干擾因素，如體力疲勞、活動限制、反復(fù)落水，群體穩(wěn)定性等［15］。因此，本實驗采用MMPM法建立了REM SD模型。本實驗結(jié)果顯示，與MC組、BC組相比，M組大鼠較亢奮，毛發(fā)較散亂且光澤有所下降，體質(zhì)量下降，而學習記憶能力無顯著變化。結(jié)果表明，水環(huán)境對大鼠一般情況和空間學習記憶能力無顯著不良影響；24 h REM SD可使大鼠體質(zhì)量減輕，但對大鼠學習記憶能力無顯著影響。已有研究表明，SD能夠引起大鼠體質(zhì)量下降［16-18］。本實驗未觀察到大鼠學習記憶能力發(fā)生顯著變化，可能由于大鼠進行了5 d的定位航行學習訓練，加強了大鼠學習程度并鞏固了大鼠空間記憶，因而在本實驗中24 h REM SD模型對大鼠學習記憶能力的影響并不顯著，這與王貴平［19］研究結(jié)果基本相同。

方法［20］，采用TCA/丙酮法處理血清后，進行2-DE分離，對差異蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)果表明共4種蛋白發(fā)生變化，分別為：Serotransferrin；Glutathione peroxidase 3；Ig kappa chain C region，B allele；Collagen alpha-2（I）chain。轉(zhuǎn)鐵蛋白主要參與鐵的運輸與代謝［21-22］。鐵元素是多種酶和輔基的重要組成部分，其在細胞呼吸鏈電子傳遞、能量代謝、血紅素代謝、氧的運輸、細胞信息傳遞、免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。Kuhn等［23］研究表明SD第5天血清鐵含量顯著減少。本實驗發(fā)現(xiàn)24 h SD大鼠血清轉(zhuǎn)鐵蛋白表達下降，提示短期SD可能已經(jīng)導致機體內(nèi)鐵代謝紊亂，但其在各組織中的變化趨勢仍需做進一步研究。Glutathione peroxidase 3屬于谷胱甘肽過氧化物酶家族成員，通過催化谷胱甘肽，減少過氧化氫、脂質(zhì)過氧化物和有機過氧化物而保護細胞免受氧化損傷。已有研究表明SD可導致各組織器官氧化應(yīng)激：SD后腦組織中超氧化物岐化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶活性降低［24-25］；大鼠咬肌與心肌中谷胱甘肽和丙二醛增高，谷胱甘肽過氧化物酶活性降低［26-27］。本研究鑒定的蛋白質(zhì)點Glutathione peroxidase 3表達下降，證實短期SD后大鼠即處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。Ig kappa chain C region，B allele參與機體的免疫過程。本實驗24 h REM SD導致大鼠Ig kappa chain C region，B allele表達下降，表明24 h REM SD使大鼠免疫力下降。Collagen alpha-2（I）chain在組織生長和修復(fù)中起重要作用。Collagen I蛋白是心肌膠原纖維的重要組成部分。已有研究表明SD能夠引起心肌損傷［27］。在本實驗中發(fā)現(xiàn)SD后血清中Collagen alpha-2（I）chain蛋白減少，提示短期SD對機體心臟損傷可能與Collagen alpha-2（I）chain蛋白表達減少有關(guān)。

綜上所述，本研究基于短期REM SD模型，采用蛋白質(zhì)組學相關(guān)技術(shù)對大鼠血清蛋白進行研究。結(jié)果表明雖然24 h REM SD對大鼠學習記憶能力無顯著影響，但在分子水平上已引起大鼠血清蛋白發(fā)生變化，這些差異蛋白主要與鐵離子代謝、氧化應(yīng)激、免疫功能等方面有關(guān)。短期SD可能通過影響上述蛋白而引起組織細胞損傷。這為研究長期SD以及更深入研究SD提供了一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

（圖2見插頁）

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（2015-10-09收稿2015-11-30修回）

（本文編輯魏杰）

A preliminary study on serum proteomics approach in rats of 24-h rapid eye movement sleep deprivation

GUO Xingdao1，2，GAO Miaomiao1，LI Tingting1，2，ZHANG Guirong1
1 Institute for Drug and Instrument Quality Control of Health Department GLD of PLA，Beijing 100071，China；2 Hebei North University Corresponding Author E-mail：guirong_zhang@126.com

Objective To investigate the differential expressions of serum proteins by proteomics approach in rat model of sleep deprivation. Methods A rat model of 24-h rapid eye movement sleep deprivation was induced by MMPM. Twentyfour rats were randomly and averagely divided into three groups，namely，model group（M），model control group（MC）and blank control group（BC）. Changes of body mass in rats were observed. Morris water maze test was used to evaluate the effect of sleep deprivation on learning and memory ability. Serum proteins were separated by two-dimensional electrophoresis and identified by LC-MS/MS. Results There was no significant difference in rat body weight between BC group and MC group. After sleep deprivation，mental irritable，pelage dull and weight loss were found in M group，but no significant changes were found in learning and memory ability. There were no significant differences in the number of protein spots between three groups. Four proteins were down regulated：Serotransferrin，Glutathione peroxidase 3，Ig kappa chain C region，B allele and Collagen alpha-2（I）chain. Conclusion The short term sleep deprivation may be related to iron metabolism，oxidative stress and immune function in rats.

sleep deprivation；serum；memory；learning；proteomics；rats，Wistar

R338.63

A

10.11958/20150207

國家自然科學基金資助項目（30901581）

1北京，總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗所（郵編100071）；2河北張家口，河北北方學院

郭興道（1988），男，碩士，主要從事藥學相關(guān)研究

E-mail：guirong_zhang@126.com