楊立杰，張麗莉，陳 偉，宮 平，武志杰，薛 妍，房娜娜，王玲莉

1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

應(yīng)用氣-質(zhì)聯(lián)機和同位素雙標記技術(shù)對土壤微生物吸收有機氮的研究

楊立杰1, 2，張麗莉1*，陳 偉1, 2，宮 平1，武志杰1，薛 妍1, 2，房娜娜1，王玲莉1

1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

土壤微生物對小分子有機氮的直接吸收和利用是目前微生物氮素營養(yǎng)研究的新方向。本研究通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)對雙標記氨基酸(13C，15N)的測定技術(shù)探討土壤微生物對有機氮分子的直接吸收和利用。結(jié)果表明：加入土壤中的甘氨酸被微生物迅速利用，半衰期為2.9 h。培養(yǎng)4 h后在微生物體內(nèi)檢測到最大量的雙標記甘氨酸(相當于甘氨酸加入量的10%)，說明甘氨酸可以被微生物以完整分子形式所吸收。通過此手段也可檢測到土壤溶液和微生物體內(nèi)的單標記a-酮酸(雙標記甘氨酸分解后的產(chǎn)物)，但含量極少，說明加入的甘氨酸主要向微生物提供C源供其生命活動。本研究證明專性化合物同位素雙標記手段結(jié)合氯仿熏蒸技術(shù)是檢測微生物吸收小分子有機氮的有效手段。

專性化合物穩(wěn)定性同位素分析技術(shù)； 雙標記甘氨酸； a-酮酸

引 言

另一種方法是向土壤中加入13C和15N雙標記氨基酸，培養(yǎng)后測定土壤微生物體內(nèi)單標記15N和13C的量，如果二者的富集量有極顯著的線性相關(guān)關(guān)系，那么認為氨基酸被微生物直接吸收[11]。但僅僅通過比值來做出判斷依然是間接方法，近年興起的專性同位素化合物分子的分析技術(shù)為此類研究提供了新的技術(shù)手段，本研究應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)測定技術(shù)結(jié)合氯仿熏蒸方法測定土壤微生物吸收的雙標記氨基酸的量，用微生物體內(nèi)的雙標記氨基酸來證實微生物直接吸收和利用小分子有機氮。本研究證實：通過GC-MS測定15N和13C雙標記氨基酸結(jié)合氯仿熏蒸法能夠驗證微生物對小分子有機氮的直接吸收和利用。

1 實驗部分

1.1 土壤采集

供試土壤采自位于中國科學(xué)院沈陽生態(tài)實驗站(43°31′N, 123°22′E)的長期定位試驗田，土壤類型為典型的潮棕壤。該定位試驗研究自2007年開始，截止采樣時間已持續(xù)6年，此地區(qū)為玉米連作的耕作制度。該站位于松遼平原南端，遼河平原中部偏東，典型的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)，氣候類型為暖溫帶半濕潤大陸性氣候，年均氣溫7～8 ℃，>10 ℃年活動積溫為3 300～3 400 ℃，太陽總輻射量為5 409.9～5 598.9 kJ·cm-2。年降雨量為650～700 mm，干燥度為0.9，無霜期為147～164 d。

1.2 培養(yǎng)試驗

稱取相當于6 g風(fēng)干土重的濕土，置于40 mL玻璃培養(yǎng)器皿中。將包含雙標記氨基酸的溶液0.64 mL均勻加入到玻璃器皿中，調(diào)整至最大含水量的50%，加入的甘氨酸濃度為5mg N kg-1干土，相當于0.33 mmol·kg-1干土。將此培養(yǎng)器皿放置于12 L塑料容器中，蓋上蓋子，在塑料瓶內(nèi)部放置濕紙巾防止水份蒸發(fā)，在室溫條件下培養(yǎng)(22 ℃)。分別在培養(yǎng)的0, 0.5, 1, 2, 4, 12和24 h后，破壞性采取4個重復(fù)，將此四個重復(fù)分成兩份，一份樣品用30 mL 0.5 mol·L-1K2SO4溶液立即提取, 另一份樣品用氯仿熏蒸24 h后震蕩提取，氯仿熏蒸步驟參見文獻[12]。用漩渦振蕩器震蕩1 h過濾得到上清液(Fisherbrand, Q5)。

1.3 樣品衍生和測定

由于氣相色譜只能分離氣態(tài)化合物，氨基酸在測定之前需要進行衍生。衍生方法依據(jù)Smart(2010)的研究進行[15]?；静襟E為: 180 μL土壤提取液加入到試管中, 加入20 μL d-2,3,3,3-丙氨酸溶液(10 mg N L-1) 作為內(nèi)標物，之后向試管中加入167 μL甲醇，32 μL嘧啶和20 μL氯甲碳甲酯，樣品在漩渦振蕩器上震蕩30 s，再向反應(yīng)體系中加入400 μL氯仿，震蕩10 s后加入400 μL NaHCO3(50 mmol·L-1)溶液，再次震蕩10 s后，試管中的反應(yīng)液分成兩層，去掉上層的水相后，將大約200 μL的反應(yīng)液移至琥珀色玻璃小瓶中，用蓋擰緊，上機測定。上述步驟均在通風(fēng)櫥中完成，有效防止試劑揮發(fā)。所有樣品在衍生后12 h內(nèi)測定，所使用的儀器為瓦里安3 800氣相色譜和瓦里安離子俘獲質(zhì)譜儀，氣相色譜配備安捷倫VF-1701毛細管柱。氣相色譜執(zhí)行程序按Smart等所述進行設(shè)定[13]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有的數(shù)據(jù)結(jié)果按風(fēng)干土計，土壤水分含量測定時用烘箱在105 ℃條件下烘干24 h后測定。采用ECXEL2010進行數(shù)據(jù)分析，SPSS16.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘氨酸的檢測

未標記甘氨酸分子量為75，經(jīng)過衍生后，形成分子量為147的物質(zhì)[圖1(a)]而雙標記甘氨酸分子量為77，經(jīng)過衍生后，形成分子量為149的物質(zhì)[圖1(b)]。

圖1 甘氨酸分子結(jié)構(gòu)式及衍生后形成的新物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式

圖2 質(zhì)譜檢測的甘氨酸衍生物的結(jié)構(gòu)碎片

表1 使用GC-MS檢測的化合物的相關(guān)參數(shù)

*未標記甘氨酸的m/z比標記的甘氨酸小2個單位，未標記乙醛酸鹽的m/z比標記的小1個單位

*Them/zfor unlabeled glycine is two units lower, for unlabeled keto acid 1 unit lower

圖3 使用GC-MS檢測的樣品峰圖

(a): 樣品整體出峰圖(m/z10～660); (b): 內(nèi)標物出峰圖(m/z106); (c): 未標記甘氨酸峰圖(m/z88); (d): 雙標記甘氨酸峰圖(m/z90)

Fig.3 Sample peaks detected by GC-MS

(a): All the detected peaks(m/z10～660); (b): Peak of standard substance(m/z106); (c): Peak of unlabeled glycine(m/z88); (d): Peak of double labeled glycine(m/z90)

圖3是從儀器上截取的出峰圖，從上至下分別為樣品的整體出峰圖[圖3(a)] ，內(nèi)標物質(zhì)出峰圖[圖3(b)], 未標記氨基酸出峰圖[圖3(c)]以及雙標記甘氨酸的出峰圖[圖3(d)]。由圖3(c)和(d)所示：由于加入土壤中的甘氨酸為雙標記態(tài)物質(zhì)，在m/z值為88的位置沒有檢測到衍生物質(zhì)，而在m/z為90處則有明顯的出峰，說明微生物以完整分子形式吸收了甘氨酸。通過峰面積和標準曲線獲得樣品中所測定物質(zhì)的量。

2.2 土壤和溶液中的甘氨酸

表2 土壤溶液和微生物體內(nèi)的雙標記甘氨酸濃度(mg N kg-1 烘干土)

注：表中所有數(shù)據(jù)均為重復(fù)的平均值(n=4)，括號中數(shù)據(jù)表示標準偏差。在同一列中相同字母指具有顯著差異(p<0.05)

Note: All data are means(n=4) with SE given in parathesis.Means followed by a different within each column are significantly different atp<0.05

表3 土壤溶液和土壤微生物體內(nèi)來源于雙標記甘氨酸的酮酸(μmol·kg-1soil)

Table 3 Keto acid originating from the double-labeled glycine extracted from soil solution and the microbial biomass(μmolkg-1soil)

時間/h土壤溶液微生物00.328(0.026)0.132(0.013)0.50.265(0.036)0.169(0.021)10.148(0.014)0.424(0.039)20.204(0.012)0.245(0.016)40.109(0.004)0.016(0.003)120.278(0.006)0.026(0.002)160.178(0.009)0.016(0.001)200.098(0.004)0.017(0.002)240.027(0.004)0.016(0.001)

圖4 氮(氨基酸和在土壤和溶液中的分布

3 結(jié) 論

證明同位素雙標記技術(shù)結(jié)合氯仿熏蒸方法可以區(qū)分和測定土壤和微生物體內(nèi)的自由氨基酸和酮酸。通過此方法明確了氨基酸分子確實可以被土壤微生物直接吸收和利用。本研究亦證實專性氨基酸同位素分析技術(shù)是研究土壤微生物對小分子有機氮利用的有效手段。

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(Received Oct.23, 2014; accepted Feb.21, 2015)

*Corresponding author

The Study of Organic Nitrogen Uptake by Soil Microorganisms Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry and Double Isotope Labeling Technique

YANG Li-jie1, 2，ZHANG Li-li1*，CHEN Wei1, 2，GONG Ping1，WU Zhi-jie1，XUE Yan1, 2，F(xiàn)ANG Na-na1，WANG Ling-li1

1.Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

The direct absorption and utilization of low-molecular weight organic nitrogen (N) by soil microbial is a new subject in the research of microbial N nutrition.The study used gas chromatography-mass spectrometry to trace dual-labeled (13C,15N) glycine from the soil solution and microorganisms.The results showed that glycine added to the soil was quickly taken up by soil microorganisms, with the half-life of glycine being 2.9 h.Withthe incubation of 4 h, the maximum amount of dual-labeled glycine in the microbial biomass was measured (equivalent to 10% of glycine added), indicating that added glycine was absorbed as intact molecular by soil microorganisms.The single labeled-Keto acid was detected in soil solution and in the microorganisms (decomposed production by double labeled glycine), but the content is extremely low, suggesting that added glycine mainly served as carbon (C) source for soil microbial life activities.This study demonstrated that compound specific stable dual labeled isotope analysis combined with chloroform fumigation technique was an effective method for detecting the low-molecular organic N utilized by soil microorganisms.

Compound specific stable isotope analysis； Double labeled glycine； a-Keto acid

2014-10-23，

2015-02-21

國家自然科學(xué)基金項目(41571290)，公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201303095-9)和國家科技支撐計劃項目(2011BAD11B04，2012BAD14B02)資助

楊立杰，1988年生，中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所博士研究生 e-mail: ylj402@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: llzhang@iae.ac.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)05-1478-05