黃祖芳，曹 剛，孫 艷，杜生榮，李永增，

林居強1，馮尚源1，雷晉萍1

拉曼光譜技術研究男性生殖生育

黃祖芳1*，曹 剛1，孫 艷2，杜生榮2，李永增1，

林居強1，馮尚源1，雷晉萍1

1.福建師范大學，醫(yī)學光電科學與技術教育部重點實驗室，福建省光子技術重點實驗室，福建 福州 350007 2.福建省婦幼保健院生殖研究室，福建 福州 350001

拉曼光譜通過記錄光與物質作用時頻率的改變，進而獲得物質分子振動、轉動信息，從而實現(xiàn)物質分子結構及其變化的檢測。相比于常規(guī)生化檢測分析方法，拉曼光譜技術具有無損、非標記檢測及對檢測樣品要求低等優(yōu)點。拉曼光譜技術已廣泛應用于生物醫(yī)學領域的研究，如人體組織、器官、細胞以及人體體液的各種疾病診斷、檢測研究。本文主要綜述了拉曼光譜技術在人體精液的研究進展，首先介紹了拉曼光譜技術(包含表面增強拉曼光譜)在法醫(yī)學領域針對精液整體開展的研究及相關的數(shù)據(jù)處理方法，然后重點介紹拉曼光譜在男性生殖生育方面的研究，即分別介紹了可客觀反映精液質量及男性生殖生育能力的基于精液(精漿)拉曼光譜的定性和定量檢測分析；另外，介紹了基于顯微拉曼光譜技術開展的單精子水平的精子質量的刻畫和評估，以及目前研究初步獲得的有望用于優(yōu)質精子判別的拉曼光譜標記指標，最后展望了拉曼光譜技術在生殖生育領域的應用發(fā)展前景。

精子；精漿；拉曼光譜；表面增強拉曼散射(SERS)；診斷檢測；定量分析

引 言

精液是男性特征性的體液，包含細胞(精子)和非細胞(精漿)兩部分，精液中精子占5%左右，其余為精漿。精漿主要含有果糖、蛋白質、多肽、以及糖類(如葡萄糖，果糖)、酶類(如前列腺素)、無機鹽和有機小分子等。

以精液為對象的研究目前主要涉及法醫(yī)學研究和男性生殖生育的研究。法醫(yī)學中關于性犯罪現(xiàn)場的人體精液的證據(jù)收集及不同體液中痕量精液的無損、準確鑒別對于罪犯身份的確定有著至關重要的作用。精液法醫(yī)學鑒定和男性生育能力的精液精子質量評估均涉及專業(yè)技術操作，往往需要進行DNA的分析鑒定，專業(yè)要求高，對樣品檢測存在有損操作；而男性生殖生育研究方面，開展精液(包含精子和精漿)的質量檢測是目前男性生育能力的重要評估依據(jù)。目前臨床精子精液檢查主要包括精液常規(guī)分析、精子形態(tài)學染色分析、精子頂體反應分析、精子核DNA碎片分析、抗精子抗體(AsAb)檢測、精漿生化分析等。精液的分析結果容易受射精頻度，溫度，實驗條件，檢驗人員的技術熟練程度，主觀判斷能力等諸多因素影響，導致結果容易發(fā)生偏差，而精漿生化的分析檢測存在操作步驟繁雜，檢測耗時等問題。

拉曼光譜是基于拉曼散射效應的光譜技術，屬于光的非彈性散射現(xiàn)象，通過記錄光與物質作用過程中物質分子振動能級的改變，進而獲得反映分子結構及成分特征性的光譜信息。相比于彈性散射，物質分子的拉曼散射效應通常很微弱，因而拉曼光譜技術的早期應用與發(fā)展受到很大的限制，隨著光電檢測技術的發(fā)展，常規(guī)拉曼光譜系統(tǒng)亦可獲得強熒光背景干擾下的生物組織的拉曼光譜，如采用長波長的光激發(fā)，更好的干擾光過濾技術，更加靈敏的信號檢測系統(tǒng)等。此外，值得一提的是，表面增強拉曼散射(SERS)技術，其通過測定吸附于粗糙金屬表面的樣品而實現(xiàn)拉曼信號的增強，克服常規(guī)拉曼散射截面小的缺點，進而提供更加豐富、靈敏的物質分子結構信息。目前，拉曼光譜技術已廣泛應用于組織，細胞及生物分子水平的檢測研究，成為生物醫(yī)學領域的重要研究手段之一[1]，顯示出廣闊的應用前景。近年拉曼光譜技術應用于人體體液的檢測研究備受關注，其中，基于拉曼技術的體液成分含量檢測[2]，體液中“痕量”藥物的分析檢測[3-4]，以及基于體液拉曼光譜的疾病檢測診斷[5-8]等取得很好的進展，有望為臨床生化檢測和基于體液的人體疾病無損、快速診斷研究提供新方法，開拓新方向。

本文主要綜述了拉曼光譜技術在精液(精液整體、精漿及精子)研究的情況，即拉曼光譜技術在法醫(yī)學中精液來源的鑒定和區(qū)分，以及拉曼光譜技術在臨床男性生殖生育的研究應用新進展，最后展望了基于拉曼光譜技術的精液研究的發(fā)展前景。

1 精液拉曼光譜分析在法醫(yī)學檢測方面的研究

拉曼光譜技術具備無損、不受水的干擾、可提供分析物“指紋”信息等優(yōu)點，使其在法醫(yī)學研究應用中扮演著重要的角色。2009年Kelly Virkler等[9]利用拉曼光譜測量比較了50例精液樣品的拉曼光譜信號。分析比較發(fā)現(xiàn)不同的精液樣品總體的拉曼譜峰、輪廓基本一致，樣品間總體光譜輪廓上無明顯差異。進一步通過顯著因子分析法(SFA)和交替最小二乘法(ALS)的分析處理,發(fā)現(xiàn)干燥的精液主要包含酪氨酸，蛋白、膽堿及精胺等三個主要光譜成分。結合精液中主要物質的光譜特征峰對總體的平均譜進行擬合分析，以及擬合優(yōu)度指標評估特征性數(shù)據(jù)與實驗光譜的匹配度，發(fā)現(xiàn)精液拉曼光譜具有明顯區(qū)別于血液和唾液拉曼光譜的特征，結合這些主要成分的光譜數(shù)據(jù)有望用于犯罪現(xiàn)場精液的確認與其他不同體液的區(qū)分。

法醫(yī)學中犯罪現(xiàn)場的體液鑒別檢測往往情況復雜，其中精液和血液的混合更為常見，因而容易對原本就痕量的精液檢測結果造成嚴重干擾，2012年Vitali Sikirzhytski等[10]首先分別測量了血液、精液純樣品的拉曼光譜，并測量獲得兩者不同比例混合的拉曼光譜數(shù)據(jù)，結合SVMDA方法(支持矢量機判別)針對不同比例混合的精液、血液樣品進行鑒別區(qū)分。初步實驗結果表明，結合光譜數(shù)據(jù)分析處理，拉曼光譜檢測方法可實現(xiàn)混合物中精液含量5%(甚至更低)的檢測限，雖然結果的可靠性有待真實犯罪現(xiàn)場的進一步驗證，但初步的實驗結果顯示出該方法有望推廣應用于法醫(yī)學中犯罪現(xiàn)場的精液檢測，以及各種混雜體液的鑒別區(qū)分。

2 精液拉曼光譜在男性生殖生育方面的研究

2.1 精漿的拉曼光譜研究

精漿不僅是精子運輸?shù)妮d體，更是精子生長發(fā)育的“土壤”，因而精漿生化指標的檢測對于精液、精子質量的評估，以及男性生育能力的診斷具有重要的指導意義。精漿中所含的果糖，檸檬酸等物質的測定可間接反映出精液中精子的活力和質量，成為男性生殖生育領域研究關注的熱點。目前臨床關于精漿中某種特定物質的生化檢測已有成熟的試劑盒，然而這些測試存在操作繁瑣、耗時、需專門技術人員等問題。尋找操作簡便、快速的測量方法具有十分重要的意義。為此，作者本人首次結合精漿樣品預處理和拉曼光譜方法開展精漿中檸檬酸的定量檢測；即首先將精液樣品進行離心獲得精漿，然后采用截止蛋白為3 kDa的濾膜進一步過濾精漿中的大蛋白分子等，進而獲得精漿超濾液；之后通過設置適當?shù)募ぐl(fā)功率進行精漿超濾液的拉曼光譜采集，通過記錄檸檬酸的952 cm-1拉曼特征峰的強度值，并與檸檬酸標準檢測試劑盒定量測量值進行比較，獲得檢測限為1.0 mg·mL-1的檢測結果[11]。初步研究結果表明，在檢測精度要求不高的前提下，該方法有望為精液中檸檬酸含量的定量提供檢測新方法。此外，我們采用液滴涂層沉積拉曼(drop coating deposition Raman, DCDR)光譜技術針對精漿中的果糖開展定量檢測研究，實驗中利用“咖啡環(huán)效應”現(xiàn)象實現(xiàn)精漿濾液中果糖的富集，結合果糖的627cm-1特征峰，以標準濃度的果糖溶液為參考，通過強度比值獲得精漿中果糖含量的定量檢測，將拉曼方法的檢測結果與果糖標準檢測試劑盒的定量檢測結果比較發(fā)現(xiàn)，該方法的檢測相對誤差為10.23%[12]，雖實驗設計有待于進一步的優(yōu)化和提高，初步實驗表明相比于果糖試劑盒檢測方法，該方法具備操作快速、測量簡單的優(yōu)點。

男性不育往往是多因素共同作用的結果，針對單一成分的測定可能不足以客觀、全面的評估男性生育能力。采用拉曼光譜技術針對精漿整體進行檢測評估，可獲得精漿中各種物質成分的綜合拉曼光譜，有望為精漿質量評估提供全面、客觀的數(shù)據(jù)信息。2011年本課題組利用拉曼技術測量精液中分離了精子后的精漿拉曼光譜，分析比較了正常和異常精液所對應的精漿的拉曼光譜；雖然兩者在拉曼譜形上無明顯的差異(如圖1所示)，通過差譜比較可明顯發(fā)現(xiàn)歸屬于色氨基酸的1 449 cm-1譜峰與歸屬于脂質的1 418 cm-1譜峰存在著顯著差異，結合主成分分析和線性判別分析法可獲得較好的區(qū)分[13]。

圖1 正常和異常精漿光譜比較

此外，我們還利用了偏振-表面增強拉曼光譜的方法分析比較正常和異常精液的精漿偏振SERS光譜，相比于常規(guī)拉曼光譜，精漿SERS光譜具有很好的信噪比，豐富的譜峰信息。實驗中我們對比正常，左旋和右旋圓偏振光激發(fā)下正常和異常精液中的精漿SERS光譜的差異(如圖2所示)，同樣結合主成分分析等數(shù)據(jù)分析方法，對獲得的精漿SERS光譜數(shù)據(jù)進行分析比較，結果發(fā)現(xiàn)在左旋偏振激發(fā)下可獲得很好的區(qū)分[14]。

圖2 不同偏振激發(fā)下的精漿SERS光譜比較，詳見參考文獻[14]

Fig.2 Comparison of SERS spectra from seminal plasma under different types of excitation, see Ref.[14] for detail

2.2 精子的拉曼光譜研究

精子是男性的生殖細胞，在男性生殖生育領域中精子形態(tài)是評估其質量的重要特征之一，研究表明不育男性精液中異常形態(tài)精子所占比例高，即使正常健康的個體，精液中形態(tài)異常精子約占精子總數(shù)的25%～40%。形態(tài)異常往往意味著功能異常，且精子形態(tài)異常與染色質結構異常有關[15-17]?；谄胀ü鈱W顯微鏡的精子形態(tài)統(tǒng)計分析操作簡便，但重復性和準確性不佳；高分辨成像法，如電鏡技術，X射線成像，二次離子質譜儀等雖可實現(xiàn)精子高分辨率的結構成像分析，但存在樣品制備要求高、測量時間長等問題；此外基于精子涂片的染色技術，如Diff-quick染色、瑞士-姬姆薩染色、巴氏染色等，雖可提供簡單有效的精子形態(tài)染色評估，由于對精子樣品的有損操作性，因而不具備應用于活體精子評估分析的可能。針對這些問題，Meister等提出采用顯微拉曼光譜方法進行單個精子的刻畫，即利用拉曼光譜成像的方法對精子進行整體的刻畫，結合聚類分析方法，成功實現(xiàn)精子不同部位(頭部，頸部，中段線粒體，尾部)的拉曼光譜成像，并初步評估不同劑量紫外光對精子細胞核、線粒體等部位的影響[18]，實驗中發(fā)現(xiàn)一定劑量的紫外光照射雖然對精子形態(tài)影響不大，但拉曼光譜中來源于線粒體的751 cm-1和來源于精子細胞核的788 cm-1兩個譜峰發(fā)生明顯的變化，結果表明基于顯微拉曼光譜的精子評估，可無損獲得單個精子的生化信息，為今后開展精子的無損、快速評估提供前期的可行性研究。Victoria等[19]以流式細胞計的精子DNA損傷分析結果作為參考，對200個精子的DNA進行拉曼光譜測量，將得到的拉曼光譜數(shù)據(jù)與流式細胞計的分析結果進行比較發(fā)現(xiàn)，拉曼譜峰中同樣歸屬于DNA磷酸骨架的1 050和1 095 cm-1譜峰的強度比值(1 050/1 095)與精子DNA碎片指數(shù)成正比(如圖3所示)。

圖3 DNA碎片指數(shù)為27%的未處理精子拉曼光譜(黑色)和碎片指數(shù)為92%的氧化損傷精子拉曼光譜(紅色)的比較，詳見參考文獻[20]

Fig.3 Raman spectra of an untreated spermatozoon with 27% DFI (black) and of another after induced oxidative nDNA damage resulting in 92% DFI (red), see Ref.[20] for detail

即兩個譜峰的比值越高，精子DNA損傷越嚴重，實驗初步結果顯示1 050和1 095 cm-1兩個拉曼譜峰的比值有望作為拉曼光譜評估精子DNA損傷情況的無損、客觀新標準。2013年，上海仁濟醫(yī)院Feng Liu等[20]比較了卵子透明帶結合及未結合精子時的實時拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)在800～900和3 200～4 000 cm-1兩個波數(shù)范圍內兩者存在一定的強度差異，雖然測量獲得的拉曼光譜的整體信噪比較低，結果提示該方法有望將來用于鑒別區(qū)分透明帶結合和未結合的精子。2014年，我們小組提出結合圖像處理與拉曼光譜分析的方法，初步獲得確保形態(tài)和質量客觀評估的正常精子的快速鑒別和篩選，有望用于今后臨床開展的單精子水平的精子質量快速和客觀評估[21]。

基于拉曼光譜的精子質量刻畫和分析主要仍局限于非活動精子的測量，直接開展基于拉曼光譜檢測的活動精子質量的評估還未見報道。為此我們小組初步開展了體外活動精子的顯微拉曼光譜檢測，通過與非活動精子的拉曼光譜的比較，發(fā)現(xiàn)兩者的光譜整體差異較?。淮送?，實驗還初步獲得“正常”精子對應的特征拉曼光譜數(shù)據(jù)和評價指標，特別在活動精子的拉曼光譜中初步驗證了譜峰中歸屬于磷酸骨架的1 050和1 095 cm-1的譜峰比值與精子DNA質量高度相關。初步的實驗結果表明，基于顯微拉曼系統(tǒng)的活體精子的拉曼光譜評估方法有望服務于生殖領域中優(yōu)質活體精子的無損評估和篩選，進一步的實驗結果還在完善和統(tǒng)計中。

3 結 論

拉曼光譜技術擁有其他光譜技術無法兼具的非標記、無損性、特異性高等綜合優(yōu)勢，因而其在生物醫(yī)學領域的應用研究備受關注。不論是犯罪現(xiàn)場的精液痕量檢測鑒別，還是基于精液的男性生育能力的評估，拉曼光譜技術在這些領域的前期基礎研究已顯示出充分的可行性。應該指出的是，拉曼光譜技術在人體精液方面的研究還屬于初步階段，如在法醫(yī)學鑒定應用領域還無法與現(xiàn)有的常規(guī)分析和DNA分析等手段相競爭，還有待于大量基礎性及臨床性的研究和驗證工作的開展。拉曼光譜技術的進一步發(fā)展，如便攜式拉曼光譜儀的普及與應用，高性能SERS基底的發(fā)展，以及拉曼光譜數(shù)據(jù)分析方法的優(yōu)化，必將深化和發(fā)展法醫(yī)學領域和男性生殖生育領域中精液的研究，同時有望將這些研究方法推廣應用于女性的生殖生育研究領域，進而為人類的生殖生育診斷評估提供簡便、可靠的新方法，更好的造福人類。

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(Received Jun.11, 2015; accepted Nov.5, 2015)

*Corresponding author

Studies of Male Fertility with Raman Spectroscopy

HUANG Zu-fang1*, CAO Gang1, SUN Yan2, DU Sheng-rong2, LI Yong-zeng1, LIN Ju-qiang1, FENG Shang-yuan1,LEI Jin-ping1

1.Key Laboratory of OptoElectronic Science and Technology for Medicine of Ministry of Education, Fujian Provincial Key Laboratory of Photonics Technology, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China 2.Fujian Maternal and Child Health Hospital, Fuzhou 350001, China

Raman spectroscopy which belongs to scattering spectroscopy obtained molecular vibrational and rotational information to achieve detection and analysis of molecular structure and corresponding changes through recording the frequency shift when light interacted with materials.Compared with routine biochemical analysis, Raman spectroscopy has the advantage of non-invasive, label-free and no sample requirement.Raman spectroscopy has been widely applied in biomedical field such as human tissue, organs, cells and human body fluids for disease diagnosis.This article mainly focuses on recent research advances of Raman spectroscopy in human semen.Firstly, Raman spectroscopy(including surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS) employed in forensic science for semen analysis, and some related data processing methods were introduced, then Raman spectroscopy involved investigations of male fertility was highlighted, more specifically, the Raman-based qualitative and quantitative analysis which assist the objective detection and evaluation of male fertility.Furthermore, studies of single sperm cell based on micro-Raman system to characterize and evaluate sperm quality and the preliminarily obtained Raman biomarkers which indicate high-quality sperm cell were introduced.Finally, the potential development of Raman spectroscopy involved in reproduction and fertility field was also discussed.

Spermatozoa; Seminal plasma; Raman spectroscopy; Surface-enhanced Raman spectroscopy; Diagnosis; Quantitative analysis

2015-06-11，

2015-11-05

國家自然科學基金項目(61308113, 61210016，11274065)，福建省自然科學基金項目(2013J01225)，教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃” 創(chuàng)新團隊項目滾動支持計劃項目(IRT_15R10)資助

黃祖芳，1981年生，福建師范大學助理研究員 e-mail: zfhuang@fjnu.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: zfhuang@fjnu.edu.cn

Q492

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)09-2818-05