申云霞，趙艷麗，張 霽，金 航，王元忠*

1.云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650200 2.云南中醫(yī)學院中藥學院，云南 昆明 650500

不同采收期滇龍膽的紅外光譜鑒別研究

申云霞1, 2，趙艷麗1，張 霽1，金 航1，王元忠1*

1.云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650200 2.云南中醫(yī)學院中藥學院，云南 昆明 650500

采收是中藥生產的重要環(huán)節(jié)，采收時間直接影響中藥質量和產量，是中醫(yī)臨床安全有效用藥的前提，開展中藥適時采收期的研究具有重要意義和應用價值。采用傅里葉變換紅外光譜法對72份不同采收期的滇龍膽進行鑒別研究，用TQ8.0軟件對原始光譜進行一階導數(shù)(first derivative, FD)、二階導數(shù)(second derivative, SD)、標準正態(tài)變量(standard normal variate, SNV)、多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)和平滑(savitaky-golay filter, SG)預處理，樣品按3∶1分為校正集和預測集，同時建立主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least square discriminant analysis, PLS-DA)模型。結果顯示，選取1 800～600 cm-1波段范圍的光譜，去除光譜噪音； SNV結合二階導數(shù)光譜和SG(15, 3)平滑，預處理結果滿意。主成分分析表明，前三個主成分方差貢獻率為92.47%，5月、9月和10月份采收的樣品差異較小。偏最小二乘判別分析建立判別模型，決定系數(shù)R2和校正均方根誤差(RMSEE)分別為0.967 8和0.086 0，可對18個預測集樣品進行準確分類。紅外光譜法結合主成分分析、偏最小二乘判別分析對不同采收期滇龍膽的分類和判別效果較好，為不同采收期的中藥鑒別提供理論依據。

滇龍膽； 不同采收期； 傅里葉變換紅外光譜； 主成分分析； 偏最小二乘判別分析

引 言

中藥質量控制和評價是中藥研究、應用及發(fā)展的熱點及難點[1]。品種、產地、采收加工、炮制和制劑工藝是影響中藥品質的重要因素，同時影響其藥性和藥效[2]。中藥規(guī)范化生產有利于確保中藥材、飲片、中成藥質量的穩(wěn)定和用藥的安全有效。采收加工是中藥生產的源頭，合理采收對中藥材質量與產量具有一定影響，是中藥產業(yè)實現(xiàn)質量穩(wěn)定、可控的重要前提[3]。

近年來，適時采收對中藥質量的影響備受關注。研究表明，白術的收獲期以摘蕾前五月下旬到六月上旬為宜，此時白術內酯含量最高[4]。前胡在12月份到翌年2月份，香豆素類成分含量達到最高階段，與傳統(tǒng)采收時間相吻合[5]。不同采收期香加皮中4-甲基水楊醛的含量差異較大，夏季的平均含量最高位0.71%，春、秋兩季的含量分別為0.22%和0.39%，夏季為最佳采收期，與傳統(tǒng)香加皮采收期為春、秋兩季有差別[6]。不同采收期的美花石斛多糖含量存在差異，九月到次年一月多糖含量相對較高[7]。金銀花的最佳采收期為“二白”和“大白”期采摘，此時綠原酸和木犀草苷含量最高[8]。水紅花子的最佳采摘期為十月中旬，此時槲皮素的含量最高，為0.697 mg.g-1[9]。因此，對中藥采收期的研究具有重要意義。

滇龍膽(GentianarigescensFranch.)為龍膽科植物，是治療肝膽疾病常用中藥[10]。沈濤等[11]采用高效液相色譜法對不同采收期、不同部位的滇龍膽進行研究，發(fā)現(xiàn)不同部位的樣品所含萜類物質具有差異，9月—11月為其最佳采收期。目前，主要以單一指標成分及藥用部位的產量作為中藥的采收期評價指標，由于地域、生產環(huán)境的差異，難以客觀地對中藥采收期進行評價。紅外光譜法具有特征性強、快速、無損和簡便等優(yōu)點，能夠反映樣品化學成分整體信息，已廣泛應用于農作物[12-13]、食品[14-17]及中藥[18-19]的鑒定及質量分析。本實驗采用傅里葉紅外光譜法結合主成分分析和偏最小二乘判別分析法對不同采收期滇龍膽進行研究，取得滿意的結果，以期為其合理采收和質量控制提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 材料

樣品采自云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所種質資源圃，于2008年4月播種，2009年3—10月，每月采收9份樣品，共72份。經云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所金航研究員鑒定為滇龍膽根及根莖。在50 ℃條件下烘48 h，粉碎過100目篩，備用。樣品采集時間和編號見表1。

表1 滇龍膽樣品信息

1.2 儀器與設備

Perkin-Elmer Fronter型傅里葉紅外光譜儀，DTGS檢測器，光譜范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，信號累加掃描16次。壓片機為YP-2(上海山岳科學儀器儀器公司)。KBr為分析純，購于天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.3 方法

取樣品與KBr粉末(1∶100)混合研磨均勻，壓制成透明薄片，放入紅外光譜儀中測定，每個樣品平行測定三次，計算平均光譜。紅外光譜采集過程中室溫保持在23 ℃，空氣相對濕度保持在40%～48%。

1.4 光譜及數(shù)據處理

所有原始光譜數(shù)據用Nicolet Omnic8.0軟件進行基線校正、歸一化預處理； 用TQ8.0軟件進行一階導數(shù)(FD)、二階導數(shù)(SD)、標準正態(tài)變量校正(SNV)、多元散射校正(MSC)、savitaky-golay filter平滑(SG)預處理，并進行主成分分析(PCA)。SIMCA-P+11.0軟件用于建立偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型。

1.5 方法學考察

精密度實驗：取同一份滇龍膽樣品，參照1.3測定方法，連續(xù)測定5次，獲得5個紅外光譜圖，計算圖譜間的相似度及相對標準偏差。

穩(wěn)定性實驗：取同一份樣品，參照1.3測定方法，每隔一個小時測定一次，共測5次，計算圖譜間的相似度及相對標準偏差。

重現(xiàn)性實驗：取一份樣品，平行制備5個樣品片，分別測定，計算圖譜間的相似度及相對標準偏差。

2 結果與討論

精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性考察結果表明，圖譜間相似度的相對標準偏差(RSD)分別為0.03%，0.98%和0.24%； 該方法可靠、重復性和穩(wěn)定性強。

2.1 滇龍膽光譜特征

根據1.3中實驗方法，掃描72份樣品的傅里葉紅外光譜，所得光譜如圖1和圖2所示，滇龍膽不同采收季節(jié)的原始圖譜特征峰相似，難以從圖譜進行鑒別，需要采用化學計量學方法對其進行區(qū)分。

圖1 滇龍膽的傅里葉變換紅外光譜

圖2 滇龍膽的二階導數(shù)光譜

2.2 光譜預處理結果

紅外光譜在測定過程中，受樣品粒度、光的散射和儀器響應等因素的影響，產生噪音和光譜的基線漂移； 適當?shù)念A處理方法，可以提高光譜的分辨率、有效消除基線漂移和噪聲[20]。表2顯示，選取1 800～600 cm-1波段范圍內的光譜，主成分數(shù)為10的條件下，經SNV+SD+SG(15, 3)預處理后對樣品的誤判數(shù)最少，變量特征的解釋能力為96.6%，該方法可用于模型的建立。

表2 不同預處理方法的結果(主成分數(shù)為10)

2.3 主成分分析

主成分分析是一種數(shù)據降維方法，將多個相關變量簡化為少數(shù)幾個不相關變量的多元統(tǒng)計分析方法[21]。選用2.2中最優(yōu)預處理方法，對數(shù)據進行主成分分析，前三個主成分分別為65.32%, 22.01%, 5.14%，累積貢獻率大于90%，包含了原始數(shù)據的絕大部分信息和樣本的聚類信息。PC1, PC2和PC3得分散點圖見圖3，樣品按采收期的差異分為八類，在散點圖上的位置與實際有一定的相關性。5月、9月和10月采收的樣品空間分布較相近，形成一個聚集區(qū)域，即此時采收的樣品差異較小，與藥典規(guī)定的春、秋兩季采挖相符[10]； 7月采集的樣品離散程度較大，8月采集的樣品距離其他樣品較遠，顯示出較大的差異性。

圖3 不同采收期滇龍膽樣品的主成分得分圖

2.4 偏最小二乘判別分析建立與驗證

2.4.1 異常值的檢測

儀器的噪聲、基線漂移和測定條件改變等因素會產生異常光譜，利用傅里葉紅外光譜數(shù)據建模時，異常樣品的存在會影享模型的穩(wěn)健性。利用SIMCA-P+11.0軟件Hottelling T2控制圖對所有樣品進行檢測，若樣品超出99%的置信區(qū)間，即判定為異常樣品。圖4為72個樣品的異常值檢測結果，除友4個樣品在95%～99%置信區(qū)間內，剩余樣品均在95%的置信區(qū)間，表明沒有異常樣品需要剔除。

2.4.2 PLS-DA模型的建立

PLS-DA方法是基于PLS建立的樣本分類變量與傅里葉紅外光譜特征間的回歸模型。在進行光譜預處理和異常值檢驗之后，選取2.2中經SNV+SD+SG(15, 3)預處理的光譜對訓練集樣品建立偏最小二乘判別模型，前三個主成分累積貢獻率為80.68%，R2為0.967 8，校正均方根誤差(RMSEE)為0.086，表明模型具有良好的預測能力。由圖5所示，建立的模型將樣品根據不同采收期分為8類，3月、5月、9月和10月份采集的樣品在空間分布上較相近，即所含的化學成分具有相似性。圖6顯示了所建立的模型對八個不同采集時間的滇龍膽樣品光譜數(shù)據的累積貢獻能力(R2Y(cum))和模型的預測能力(Q2Y(cum))，R2Y(cum)值均大于95.59%，Q2Y(cum)值均大于83.10%，適用于樣品的鑒別。

圖4 樣品異常值檢測

圖5 滇龍膽的偏最小二乘判別分析結果

圖6 不同采收期滇龍膽的累計貢獻率和預測率

2.4.3 PLS-DA模型的驗證

將建立好的判別模型用于驗證，隨機選取18份樣品作為驗證集，對驗證集樣品進行判定。即考察預測值Ypre與偏差Ydev，判定準則為：(1)當Ypre>0.5，Ydev<0.5，判定樣品屬于該類； (2)當Ypre<0.5，Ydev<0.5，判定樣品不屬于該類； (3)Ydev>0.5，判定不穩(wěn)定[22]。結果如表3所示，根據判別準則，建立的判別模型能對18份驗證集樣品進行準確預測。

表3 驗證集的偏最小二乘判別分析結果

注：Ypre為預測值，Ydev為偏差

Note:Ypreis predictive value，Ydevis doviation

3 結 論

采集不同采收期滇龍膽的傅里葉變換紅外光譜，考察樣品的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，試驗結果表明該方法穩(wěn)定和可靠。用TQ8.0軟件對所有原始光譜進行預處理，選取1 800～600 cm-1光譜波段，采用標準正態(tài)變量結合二階導數(shù)法及SG平滑預處理，建立主成分分析模型，前三個主成分的累積貢獻率為92.47%，能夠反映原始數(shù)據的大部分信息，顯示滇龍膽樣品成分之間的相關性，不同采收期樣品在空間中離散分布，其中5月、9月和10月采收的樣品在空間分布較近，即所含化學成分相似性較高，與藥典規(guī)定的春、秋兩季采挖相符。為了對樣品準確鑒別，利用SIMCA-P+11.0軟件，選擇預處理后的光譜，建立PLS-DA模型，根據經累積貢獻能力、R2和RMSEE對模型進行評估，表明模型的穩(wěn)定性較好。所建立的模型對驗證樣品的準確識別率為100 %； 與目前沿用的以藥用部位單一指標性活性成分結合生物產量的采收期確定方法相比，F(xiàn)TIR具有簡便、無損、真實宏觀及反應樣品綜合信息等優(yōu)點，為快速鑒別中藥不同采收期提供參考。

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(Received Dec.19, 2014; accepted Apr.15, 2015)

*Corresponding author

Study on the Discrimination of FTIR Spectroscopy ofGentianaRigescenswith Different Harvest Time

SHEN Yun-xia1, 2, ZHAO Yan-li1, ZHANG Ji1, JIN Hang1, WANG Yuan-zhong1*

1.Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650200, 2.College of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China

The harvest time of traditional Chinese medicine (TCM) is a very essential part for the production and quality of TCM which is the prerequisite for safe and effective clinical use of TCM.It is of great importance to carry out the research of timely harvest time of TCM.With Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) to study harvest time of Seventy-twoGentianaRigescenssamples.First derivative, second derivative, standard normal variate, multiplicative scatter correction and Savitaky-Golay(15,3) smoothing of all original spectra were pretreated with TQ8.0 software.Samples were divided into calibration set and prediction set at the ratio of 3∶1.Principal component analysis (PCA) and partial least square discriminant analysis (PLS-DA) model were established.The result indicated that after removing noise spectrum, the spectra range was from 1 800 to 600 cm-1, the method SNV combined with SD and SG present the best result of spectra pretreatment.The contribution rates of first three principal components were 92.47% with PCA.Small differences were found for the samples harvested in May, September and October.Same spectrum range was chosen and PLS-DA was applied to establish the model.TheR2and RMSEE were 0.967 8, 0.086 0, respectively, and the prediction accuracy is 100%.The methods of PCA and PLS-DA have good ability to classify and identify different harvest time ofGentianaRigescens.It provided a basis for the identification of different harvest time of TCM.

Gentianarigescens; Different harvest seasons; Fourier transform infrared spectroscopy; Principal component analysis; Partial least square discriminant analysis

2014-12-19，

2015-04-15

國家自然科學基金項目(81260608)和云南省自然科學基金項目(2013FD066, 2013FZ150)資助

申云霞，女, 1991年生, 云南中醫(yī)學院中藥學院研究生 e-mail：shenyunxia1991@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail：yzwang1981@126.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)05-1358-05