魏 萱，蔣璐璐，趙艷茹，邵詠妮，裘正軍，何 勇*

1.福建農(nóng)林大學機電工程學院，福建 福州 350002 2.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058 3.浙江經(jīng)濟職業(yè)技術學院，浙江 杭州 310018

小球藻生長過程脂肪含量動態(tài)變化快速無損檢測方法研究

魏 萱1, 2，蔣璐璐3，趙艷茹2，邵詠妮2，裘正軍2，何 勇2*

1.福建農(nóng)林大學機電工程學院，福建 福州 350002 2.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058 3.浙江經(jīng)濟職業(yè)技術學院，浙江 杭州 310018

微藻-生物柴油轉化生產(chǎn)要求產(chǎn)油微藻細胞內(nèi)大量積累脂肪，而藻類脂肪的積累受外界環(huán)境影響較大，因此，微藻生長過程中對藻體脂肪變化進行快速檢測和分析有著非常重要的意義。以小球藻(Chlorellasp.)為研究對象，利用可見/近紅外光譜技術和高光譜成像技術對不同光源培養(yǎng)條件下微藻生長過程脂肪動態(tài)變化和脂肪含量分布可視化分析進行了研究。研究結果表明，雖然利用兩種技術獲取的小球藻透射光譜和反射光譜有差異，利用連續(xù)投影算法進行特征波長也不完全相同，但基于兩種技術獲得的對于脂肪含量的特征波段光譜建立的小球藻脂肪含量多元線性回歸模型的預測結果接近，分別為rpre=0.940，RMSEP=0.003 56和rpre=0.932，RMSEP=0.004 23。研究中小球藻接種初期至生長指數(shù)期初期藻體內(nèi)脂肪含量相對平穩(wěn)，積累增加發(fā)生在生長對數(shù)期的末期，而在生長平穩(wěn)期時的小球藻藻液中，脂肪含量較高的藻體呈現(xiàn)出聚集生長的狀態(tài)。小球藻生長過程中生命信息快速無損檢測方法的實現(xiàn)為微藻實際生產(chǎn)培養(yǎng)和收獲策略的制定提供了理論依據(jù)和技術手段。

可見/近紅外光譜； 高光譜成像； 小球藻； 脂肪； 生物能源

引 言

潔凈能源-生物柴油由植物油或動物脂的脂肪酸烷基單酯組成，是可再生性能源中重要的一種[1]。其中，微藻具有光合作用效率高、生長周期短、生長迅速、占地面積小、單位面積生產(chǎn)力高、易于培養(yǎng)及生長過程中可高效固定二氧化碳同時減少環(huán)境污染等顯著優(yōu)勢，是生物質能源理想的原材料，有些微藻含油量可達50%以上[2]。目前，國內(nèi)外研究學者廣泛開展了微藻作為生物質能原料的研究[3-7]。微藻高效培養(yǎng)是微藻生物能源開發(fā)利用的關鍵和前提[8]，將微藻作為生物柴油生產(chǎn)的原料要求藻體內(nèi)有較高脂肪含量積累，因此，如果能夠快速獲取微藻生長過程中脂肪含量的生長信息，將有助于養(yǎng)殖者對微藻的生長環(huán)境參數(shù)(如光照、溫度、營養(yǎng)元素等)進行優(yōu)化，制定適宜微藻生長的管理和控制策略。常規(guī)的檢測方法雖然可以實現(xiàn)藻體細胞內(nèi)脂肪含量的測定，但工作量較大以及會產(chǎn)生化學試劑污染，因此，需要快速簡便的無損檢測方法對微藻的生命信息進行獲取分析，進而指導實際生產(chǎn)。

近紅外光譜與有機分子中含氫基團(O—H，N—H，C—H)振動的合頻和各級倍頻的吸收區(qū)一致，利用該技術可以快速實現(xiàn)樣品定性或定量分析測定，已經(jīng)廣泛被用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品檢測等領域[9-10]。高光譜具有光譜包含豐富的物質內(nèi)部信號的優(yōu)點，又擁有圖像包含豐富的空間分布信息的優(yōu)點[11-12]，可為微藻的生命信息快速無損檢測提供新的方法和手段。

本文利用可見/近紅外光譜和高光譜-圖像兩種技術對在不同組合光源培養(yǎng)條件下對微藻生長過程中的脂肪含量變化和可視化分布進行分析研究。對比分析獲取小球藻藻液的透射光譜和反射光譜對檢測結果的影響，探討這兩種技術在微藻生長過程中脂肪快速無損檢測的可行性，為微藻生命信息快速獲取提供技術支持和理論基礎。

1 實驗部分

1.1 材料

小球藻(Chlorellasp.)藻種購買于中國科學院淡水藻種庫(Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology，F(xiàn)ACHB-collection)培養(yǎng)于BG11培養(yǎng)基。實驗室室內(nèi)溫度保持在25 ℃，相對濕度在80%左右，置于四種不同組合光源培養(yǎng)條件下(100%紅光、90%紅光+10%藍光，70%紅光+30%藍光，50%紅光+50%藍光)，白光為對照組，光強均為2 500 Lux，光照周期為12L∶12D。每個培養(yǎng)瓶中放入磁力轉子，利用磁力攪拌器早中晚各三次進行攪拌，以確保CO2在瓶中的溶解量。同時利用血球計數(shù)板在奧林巴斯CX31三目生物顯微鏡(Optical Analysis Corp., Nashua, NH)下進行計數(shù)。

1.2 BG11培養(yǎng)基

1 L BG11培養(yǎng)基中包含100 mL濃度為15.0 g·L-1的NaNO3，10 mL濃度為2 g/500 mL的K2HPO4，10 mL濃度為3.75 g/500 mL的MgSO4·7H2O，10 mL濃度為1.8 g/500 mL的CaCl2·2H2O，10 mL濃度為0.3 g/500 mL的檸檬酸，10 mL濃度為1.0 g/500 mL的EDTANa2，1 mL微量元素混合液A5。其中，每1 L的A5微量元素混合溶液包括2.86 g的H3BO3，1.86 g的MnCl2，0.22 g的ZnSO4·7H2O，0.39 g的Na2MoO4·2H2O，0.08 g的CuSO4·5H2O，0.05 g的Co(NO3)2·6H2O。培養(yǎng)基用去離子水配制，配制完后置于高溫高壓滅菌鍋內(nèi)在121 ℃條件下滅菌30 min，待冷卻至室溫后，在超凈臺內(nèi)進行接種。

1.3 脂肪含量測定

小球藻分6個批次進行培養(yǎng)，根據(jù)生長曲線分別采集生長適應期、指數(shù)期和平穩(wěn)期的小球藻樣本。采集樣本前，在顯微鏡下采用血球計數(shù)板計數(shù)檢驗，根據(jù)微藻數(shù)目進一步對應生長曲線中的天數(shù)。在采集小球藻可見/近紅外透射光譜和高光譜反射光譜之后，對小球藻的脂肪含量進行測定。每種培養(yǎng)條件分別采樣，每只培養(yǎng)瓶進行3次重復試驗，然后取平均獲得一個樣本數(shù)據(jù)。脂肪提取時，取30 mL藻液，50 ℃烘干至恒重，稱重后加入2 mL水、4 mL甲醇、2 mL氯仿，超聲震蕩輔助提取，靜置4 h后離心取上層氯仿層移至干燥的培養(yǎng)皿中，25 ℃烘箱中烘至恒重稱重，用式(1)進行計算

X=(m3-m2)/(m1-m0)

(1)

式中：X為微藻中脂肪含量(%)。

m0為50 mL離心管重量，m1為藻粉和50 mL離心管重量，m2為培養(yǎng)皿重量，m3為藻油和培養(yǎng)皿重量。

1.4 可見/近紅外光譜與高光譜-圖像獲取與分析

可見/近紅外光譜和高光譜成像系統(tǒng)獲取藻液光譜方式分別如圖1(a)和圖1(b)所示?？梢?近紅外光譜采用美國ASD公司的Handheld Field Spec光譜儀，其光譜采樣間隔1 nm，測定范圍為325～1 075 nm，掃描次數(shù)30次。采集前，藻液充分混合均勻，以空培養(yǎng)皿作為空白，然后將搖勻后的藻液倒入培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)瓶中采集3組光譜，然后求平均得到檢測時刻的一條光譜曲線。

高光譜成像系統(tǒng)(ImSpector V10E, Spectral Imaging Ltd., Oulu, Finland)光譜相機的光譜分辨率為2.8 nm，所采集的光譜范圍為380～1 030 nm。高光譜儀器采集裝置的參數(shù)設置為：曝光時間2.0 ms，載物移動平臺移動速度為3.5 mm·s-1。在獲取藻液的反射光譜時，為了消除光源等儀器差異因素等對樣本的影響，在采集高光譜圖像前進行黑白板矯正，對獲得的圖像用以下的公式進行校正

R=(I0-Idark)/(Iwhite-Idark)

(2)

其中，I0是采集的樣本原始光譜圖，Idark是全黑圖像(反射率約0%)；Iwhite是白色聚四氟乙烯板全白圖像(反射率約100%)。

圖1 (a)獲取小球藻透射光譜的可見/近紅外光譜系統(tǒng)圖； (b) 獲取小球藻反射光譜的高光譜成像系統(tǒng)圖

1.5 分析方法和軟件

采用化學計量學和圖像處理進行數(shù)據(jù)建模分析。采用偏最小二乘回歸(partial least squares regression，PLSR)和多元線性回歸(multivariable linear regression, MLR)兩種方法進行光譜建模分析，利用連續(xù)投影算法(successive projections algorithm，SPA)進行特征波段提取。運算過程通過Unscrambler version 9.6 (CAMO PROCESS AS，Norway)，ENVI 4.6((ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO))和Matlab 7.10 R2010b (The MathWorks, Natick, USA)等數(shù)據(jù)處理軟件實現(xiàn)。

2 結果與討論

2.1 小球藻生長曲線

小球藻接種后，分別在接種后隔天即第2，4，6，8，10，12，14和16 d用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)前，首先搖勻，靜置片刻，然后取少量藻液進行計數(shù)。圖2為繪制的小球藻一個生長周期的生長曲線圖，各試驗組小球藻的生長階段相似，第2天到第6天生長都比較平緩，呈緩慢增長趨勢，到第6天開始，不同組合光源培養(yǎng)條件下，小球藻均進入了生長指數(shù)期，速度略有差異，持續(xù)時間不完全相同，在16 d左右，小球藻生長均已完全進入生長平穩(wěn)期。

圖2 小球藻生長曲線

2.2 脂肪含量分析

按照測得的脂肪含量多少排序，將2/3的樣本作為校正集，剩余1/3為預測集，保證校正集脂肪含量范圍包含所有的預測集，小球藻校正集與預測集脂肪的統(tǒng)計值見表1。

表1 小球藻脂肪含量統(tǒng)計分析

2.3 光譜分析

圖3中實線光譜是小球藻可見/近紅外吸收平均透射光譜轉變后的吸收光譜。由于光譜數(shù)據(jù)在采集范圍的首端與末端產(chǎn)生了部分噪音，因此選用400～1 049 nm的光譜范圍進行分析。采用ImSpector V10E高光譜成像儀采集的微藻高光譜圖像如圖4(a)所示。利用ENVI 4.6軟件中的ROI(Regions of Interest)功能獲取培養(yǎng)皿中的微藻圖像[圖4(b)]。從圖中提取每個波段下感興趣區(qū)內(nèi)所有像素點的平均光譜值，從而得到一條平均光譜值的光譜曲線，去掉噪音范圍，選取400～1 020 nm波長范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)進行分析，轉變成為吸光度值，如圖3虛線所示。從平均光譜來看，兩種信息獲取方式轉變成為藻液吸光度后波峰與波谷差值差異較大，但是主要的吸收峰位置基本一致，450和675 nm附近色素吸收波段以及975 nm附近水分的吸收波段均有顯著的吸收峰[13]。

圖3 可見/近紅外光譜系統(tǒng)獲取的小球藻平均吸收光譜和通過高光譜圖像獲取的小球藻平均吸收光譜

Fig.3 The average absorbance spectra obtained by Vis/NIR spectroscopy and the spectra of ROI in the near-infrared area ofChlorellasp.obtained by hyperspectral imaging system

圖4 可見/近紅外光譜范圍內(nèi)高光譜圖像和小球藻樣本的感興趣區(qū)域示意圖

Fig.4 The hyperspectral images ofChlorellasp.and ROI area in visible/near-infrared spectral region

2.4 微藻脂肪含量光譜檢測模型

2.4.1 可見/近紅外光譜模型

對比原始光譜和不同光譜預處理之后所建立的脂肪含量預測模型結果(未列出)，Savitzky-Golay卷積平滑處理后模型效果最好，此時光譜中包含650個波長，rpre為0.962，RMSEP為0.002 45。對預處理之后光譜實施連續(xù)投影算法，進行與脂肪含量相關特征波段的優(yōu)選，選出的波段分別是664，1 017和1 043 nm。利用這三個波段對脂肪建立多元線性回歸預測模型，回歸方程和基于特征波段的脂肪預測模型結果分別如式(3)和表2所示。

從表2中可以看出，利用特征波長建立的脂肪含量預測模型預測值與真實值相關性較好。由于接種前3 d小球藻生長生物量較少，在一個生長周期內(nèi)從第4天開始，基于建立的預測模型對小球藻脂肪含量動態(tài)變化進行連續(xù)預測檢測。從圖5中可以看出，隨著接種時間的增加，在最初的8 d以內(nèi)脂肪的含量都相對穩(wěn)定，第9天開始，脂肪開始出現(xiàn)小幅上升。此時，小球藻的細胞個數(shù)增長速度開始減少，培養(yǎng)液中各種營養(yǎng)元素大量消耗，有研究表明[14-17]，微藻細胞內(nèi)的中性脂肪包括三酰甘油(TAG)、二酰甘油(DAG)和膽固醇等，通常是細胞在壓力條件下(如缺氮、高光等)積累的產(chǎn)物，用于儲存能量以便在條件適宜時重新支持細胞的生長和分裂，因此在生長對數(shù)末期氮元素的減少有利于脂肪積累。

Y=0.729A665+1.718A1 017-1.987A1 043+0.385

(3)

表2 基于可見/近紅外光譜對小球藻脂肪含量建立不同預測模型結果

根據(jù)分析可以看出，隨著營養(yǎng)元素的減少，光合作用受到抑制，生物量的增長減慢，但是脂肪的合成卻開始增長。這為微藻養(yǎng)殖培養(yǎng)過程中優(yōu)化整體脂肪產(chǎn)量提供了方法和理論基礎，在以脂肪積累為目標的培養(yǎng)過程中，首先應以提高微藻細胞生長密度為目的，在培養(yǎng)環(huán)境中提供充分的營養(yǎng)元素，以促進微藻細胞生長，待細胞大量增殖以后將它們轉移到缺乏營養(yǎng)的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)以促使細胞積累脂肪。

2.4.2 高光譜圖像可視化分析

利用高光譜成像系統(tǒng)獲取的反射光譜與通過可見/近紅外光譜獲得的小球藻透射光譜均轉化為吸收光譜之后，通過上述分析可以看出有差異。在對ROI區(qū)域獲取的光譜實施SPA方法之后，共有5個波長被優(yōu)選出來，它們分別是412.9，483.8, 670.7, 816.8和993.7 nm。造成光譜上差異的原因能來自于儀器的分辨率和波段范圍不完全相同，但建立的預測模型結果較接近。

圖5 通過預測模型獲得的不同光源培養(yǎng)條件下一個生長周期內(nèi)小球藻脂肪含量

表3 基于高光譜對小球藻脂肪含量建立不同預測模型結果

結合多元線性回歸模型，在Matlab軟件中，利用特征波段下的圖像，對高光譜圖像的每個像素點進行脂肪含量的可視化分析，結果如圖6所示。從圖中可以看出，不同光源培養(yǎng)環(huán)境下，即使是在同一生長系統(tǒng)，藻體中脂肪含量分布也并不相同，這說明各藻體細胞內(nèi)的脂肪含量有差異。這可能跟測定時藻體細胞還不完全處于同一生長時期有關。通過對脂肪可見/近紅外光譜分析可以看出，小球藻藻液的總脂肪含量隨著時間的緩慢增長而逐步積累，由此可以推測出處于不同生長時期的藻體單個細胞內(nèi)脂肪的含量并不一致，且個體差異較大。從可視化圖像看，脂肪含量更高的藻體呈現(xiàn)出聚集的趨勢，有可能是因為該生長階段的活體藻體還在不斷積累脂肪，而活體藻體往往聚集在一起，因此，從脂肪含量的可視化分析來看，脂肪的分布在藻液中也不是呈現(xiàn)均勻分布。

圖6 不同光源培養(yǎng)條件下小球藻生長平穩(wěn)期脂肪含量分布圖

3 結 論

采用可見/近紅外光譜技術和高光譜成像技術實現(xiàn)了對小球藻脂肪含量動態(tài)變化快速無損檢測。研究結果表明，這兩種技術獲取的小球藻光譜信息有差異，通過數(shù)據(jù)挖掘和特征波段提取分析，所得到的特征波段也不完全相同，后者獲得的特征波長波段多于前者，預測能力略低于前者，但預測效果均較好，預測集相關系數(shù)在0.930以上。本研究中利用可見/近紅外光譜技術實現(xiàn)了小球藻藻體脂肪含量動態(tài)變化快速無損檢測。研究結果表明小球藻在接近生長平穩(wěn)期時脂肪出現(xiàn)大量積累。利用高光譜-圖像對藻液中小球藻脂肪含量的分布分析后，發(fā)現(xiàn)生長后期脂肪大量積累時脂肪含量更高的藻體呈現(xiàn)出聚集生長的狀態(tài)。本文的研究結果為微藻生長和油脂含量等生命信息快速無損檢測提供了方法，為實際生產(chǎn)培養(yǎng)和收獲策略制定提供了理論依據(jù)和技術支持。

[1] Schenk P, Thomas-Hall S, Stephens E, et al.Bioenerg Res.，2008, 1(1): 20.

[2] Yusuf C.Biotechnol Adv.，2007, 25(3): 294.

[3] Velasquez-Orta S B, Lee J G M, Harvey A P.Biochem.Eng.J.，2013, 76: 83.

[4] Bahadar A, Bilal Khan M.Renewable and Sustainable Energy Reviews，2013, 27(0): 128.

[5] Shu C H, Tsai C C, Liao W H, et al.J.Chem.Technol.Biotechnol., 2012, 87(5): 601.

[6] Tang H, Abunasser N, Garcia M E D, et al.Appl.Energ.，2011, 88(10): 3324.

[7] Chen C Y, Yeh K L, Aisyah R, et al.Bioresource Technol.，2011, 102(1): 71.

[8] Seo Y H, Cho C, Lee J Y, et al.Bioresource Technol.，2014, 173: 193.

[9] Jie Dengfei, Xie Lijuan, Rao Xiuqin, et al.Postharvest Biol.Tec., 2014, 90: 1.

[10] Wu Di, Nie Pengcheng, He Yong, et al.Int.J.Food Prop., 2013, 16(5): 1002.

[11] Elmasry G, Kamruzzaman M, Sun D-W, et al.Crit.Rev.Food Sci., 2012, 52(11): 999.

[12] Wei Xuan, Liu Fei, Qiu Zengjun, et al.Food Bioprocess Technol., 2013: 1.

[13] Jie Dengfei, Xie Lijuan, Fu Xiaping, et al.J.Food Eng., 2013, 118(4): 387.

[14] Klok A J, Martens D E, Wijffels R H, et al.Bioresource Technol., 2013, 134: 233.

[15] Packer A, Li Y, Andersen T, et al.Bioresource Technol.，2011, 102(1): 111.

[16] Solovchenko A E.Russ.J.Plant Physiol., 2012, 59(2): 167.

[17] Li Yuqin, Han Fangxin, Xu Hua, et al.Bioresource Technol., 2014, 174: 24.

(Received Dec.19, 2014; accepted Apr.12, 2015)

*Corresponding author

Study on the Nondestructive Detection Methods for Dynamica Change of Lipid Content inChlorellasp.

WEI Xuan1, 2，JIANG Lu-lu3，ZHAO Yan-ru2，SHAO Yong-ni2，QIU Zheng-jun2，HE Yong2*

1.College of Mechanical and Electronic Engineering，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002, 2.College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, 3.Zhejiang Technology Institute of Economy, Hangzhou 310018, China

Microalgae based biodiesel production requires a large amount of lipid accumulation in the cells, and the accumulation is greatly influenced by the environment.Therefore, it is necessary to find fast and non-destructive methods for lipid change detection.In this paper,Chlorellasp.was adopted as the objective, which was cultured under different light condition consisted of red and blue lights with different proportion.We applied the visible near-infrared spectroscopy (Vis/NIRs) technique to detect the dynamic change of lipid during the microalgae growth processes and utilized hyperspectral imaging technology for visualization of lipid distribution in the suspension.The transmittance and reflectance spectra of microalgae were acquired with Vis/NIRs and hyper-spectroscopy, respectively.In the comparison of the transmittance and reflectance spectra, they showed some different characteristics.Meanwhile it also varied in terms of the number and the area of feature wavelengths obtained by successive projections algorithm (SPA) based on the different spectra.But the established multiple linear regression (MLR) model for lipid content prediction had similar results with rpre of 0.940, RMSEP of 0.003 56 andrpreof 0.932, RMSEP of 0.004 23, respectively.Based on the predictive model, we obtained the spectra and analyzed the lipid dynamic change in microalgae in one life cycle.In the life cycle, the lipid content inChlorellasp.was relatively stable from the beginning of inoculation to exponential phase, the increase and accumulation of lipid phenomenon occurred in the late exponential phase.Combined with the MLR model and the hypersepctral images, we studied the visualization result of microalgae suspension in the steady phase.The stimulated images showed that the microalgae with higher lipid content appeared gathering.This study compared the difference and the feasibility of the Vis/NIRs and hyperspectral imaging technique in lipid content detection applied in microalgae growing microalgae.The results are meaningful for the fast and non-destructive detection of the growth information of microalgae.It has boththeoretical and practical significance for developing microalgal culture and harvest strategy in practice.

Visible/near infrared spectroscopy (Vis/NIRs)； Hyperspectral imaging；Chlorella； Lipid； Biofuel

2014-12-19，

2015-04-12

浙江省自然科學基金項目(LY14C130008)，國家自然科學基金項目(31072247)和浙江省教育廳項目(Y201327409)資助

魏 萱，1987年生，福建農(nóng)林大學機電工程學院講師 e-mail: xuanweixuan@126.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: yhe@zju.edu.cn

TP391.41

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)05-1352-06