張　壽，?！√m*，雷乃虎，2，馬艷芳，沈明華

(1.青海大學 農(nóng)牧學院動物醫(yī)學系，西寧 810016； 2.青海省天峻縣畜牧獸醫(yī)工作站，天峻 817200)

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不同海拔條件下牦牛頸動脈體組織微細結(jié)構(gòu)的比較研究

張壽1，常蘭1*，雷乃虎1，2，馬艷芳1，沈明華1

(1.青海大學 農(nóng)牧學院動物醫(yī)學系，西寧 810016； 2.青海省天峻縣畜牧獸醫(yī)工作站，天峻 817200)

摘要：旨在揭示牦牛在不同程度低氧下頸動脈體的結(jié)構(gòu)特征。本研究采用組織學、免疫組織化學方法和透射電子顯微鏡技術(shù)，對青海省不同海拔的成年健康牦牛頸動脈體的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行觀察，并運用顯微體視學方法比較Ⅰ型細胞(明細胞、暗細胞)、Ⅱ型細胞和血管的體密度(Vv)、面密度(Sv)、面數(shù)密度(NA)、比表面(δ)。結(jié)果表明，牦牛頸動脈體中明細胞數(shù)量多、暗細胞較少，胞質(zhì)含大量線粒體和特有的電子致密核心囊泡，隨著海拔升高，線粒體和EDCV的大小和數(shù)量無明顯變化；Ⅱ型細胞分布于Ⅰ型細胞的周圍，細胞小而少。間質(zhì)中分布有豐富的毛細血管，管腔隨海拔升高逐漸變大。明細胞的Sv、NA隨著海拔的升高逐漸增大，各海拔組之間差異顯著；暗細胞的Vv、Sv和NA隨著海拔的升高逐漸增大，海拔4 600 m與2 800 m組間差異均顯著；Ⅱ型細胞的Sv、NA隨著海拔的升高逐漸增大，海拔4 600 m組與其它兩組間(海拔2 800 m組和3 800 m組)差異均顯著；頸動脈體微血管的Sv、δ隨著海拔的升高逐漸減小，且Sv在海拔4 600 m與2 800 m組之間差異顯著，δ各組之間差異均顯著。綜上表明，隨著海拔升高，牦牛頸動脈體Ⅰ型細胞和Ⅱ型細胞數(shù)量明顯增多、微血管明顯擴張。

關鍵詞：結(jié)構(gòu)；體視學；頸動脈體；牦牛；不同海拔

頸動脈體(Carotid body，CB)是機體內(nèi)感受動脈血的化學感受器，位于頸總動脈分叉處、血管壁外周的結(jié)締組織中。CB可感受血液中的化學變化，如血液中出現(xiàn)缺氧、CO2分壓升高和H+濃度增大等變化。缺氧引起Ⅰ型細胞胞漿鈣離子升高，神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加，竇神經(jīng)放電頻率增加，通過呼吸中樞，引起呼吸加深加快。頸動脈體由實質(zhì)和間質(zhì)組成，實質(zhì)細胞有兩種主要類型，即Ⅰ型細胞(或稱主細胞、球細胞)和Ⅱ型細胞(或稱支持細胞、衛(wèi)星細胞)，Ⅰ型細胞是數(shù)量最多的一種細胞，又分為明細胞和暗細胞；Ⅱ型細胞包繞在Ⅰ型細胞周圍，間質(zhì)有豐富的毛細血管、結(jié)締組織和神經(jīng)[1-3]。自發(fā)現(xiàn)頸動脈體對缺氧的敏感性以來，低氧環(huán)境下頸動脈體形態(tài)和功能的改變引起了國內(nèi)外許多學者的重視，但主要集中在人[4]、小鼠[5-7]、大鼠[8-9]和兔[10]上，而對生活在青藏高原高寒低氧生態(tài)環(huán)境下牦牛頸動脈體的研究未見報道。本研究對不同海拔牦牛頸動脈體光鏡及電鏡結(jié)構(gòu)和光鏡體視學進行研究，以揭示牦牛不同低氧程度下CB的結(jié)構(gòu)特征。

1材料與方法

1.1材料

選取生活在青海省瑪多縣(海拔4 600 m)、天峻縣(3 800 m)和湟源縣(2 800 m)的成年(5歲左右)健康牦牛各5頭，經(jīng)頸動脈放血處死后，立即取左、右兩側(cè)頸動脈體，左側(cè)頸動脈體置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.01 mol·L-1，pH 7.4)中固定48 h，用于光鏡制樣(右側(cè)頸動脈體取1 mm×1 mm×2 mm大小組織投入冷2.5%戊二醛固定液中，用于透射電鏡制樣)。

1.2光鏡制樣

經(jīng)4%多聚甲醛磷酸液固定的頸動脈體，常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚4 μm，分別行蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組織化學染色。

免疫組織化學染色：切片脫蠟至水，用0.01 mol·L-1PBS液(pH7.4)漂洗3次，每次8 min；切片檸檬酸修復液高壓修復2 min，自然冷卻至室溫，用0.01 mol·L-1PBS液(pH 7.4)漂洗3次，每次8 min；切片在室溫下用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育20 min，用0.01 mol·L-1PBS液(pH 7.4)漂洗3次，每次8 min；滴加非免疫動物血清(羊)，室溫下孵育45 min；棄去血清，加第一抗體(兔源性CD34多克隆抗體，工作濃度為1∶200，武漢博士德公司產(chǎn)品)，置4 ℃冰箱過夜，用0.01 mol·L-1PBS液(pH 7.4)漂洗3次，每次8 min；滴加生物素標記的羊抗兔IgG，室溫下孵育2 h，用0.01 mol·L-1PBS液(pH 7.4)漂洗3次，每次8 min；加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶溶液，37 ℃孵育30 min(SP試劑盒，福州邁新公司)，用0.01 mol·L-1PBS液(pH 7.4)漂洗3次，每次8 min；入DAB顯色劑顯色6 min，蒸餾水洗終止反應，用0.01 mol·L-1PBS液(pH 7.4)漂洗3次，每次8 min；蘇木精染液中復染、脫水、透明、封片、鏡檢。陰性對照試驗以用0.01 mol·L-1PBS液代替一抗，其余同前所述。

每枚CB經(jīng)HE和免疫組織化學染色的組織分別選取5張切片，用Olympus顯微鏡觀察，Olympus DP70圖像采集系統(tǒng)取圖，在400倍的放大倍率下每張切片選取隨機拍攝3個視野用于顯微體視學分析。

1.3透射電鏡制樣

經(jīng)2.5%戊二醛固定液(0.2 mol·L-1磷酸緩沖液50 mL，25%戊二醛水溶液10 mL，然后加雙蒸水至100 mL配制而成；25%戊二醛由天津市光復精細化工研究所生產(chǎn))中的頸動脈體組織，0.1 mol·L-1PBS漂洗后，1%鋨酸固定2 h，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，每頭做2個包埋塊，超薄切片，進行醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，用日本產(chǎn)H-7650型透射電鏡在放大3 000倍、10 000倍和30 000倍下觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.4立體定量分析方法

參照E.R.Weibel[11]和鄭富盛[12]正方測試格點計數(shù)法，繪制光鏡電子方格測量系統(tǒng)，用點計數(shù)法在光鏡照片上計數(shù)落入?yún)⒄障档臏y試點數(shù)(Pr)，參照系內(nèi)待測結(jié)構(gòu)(明細胞、暗細胞、支持細胞、血管)的數(shù)目(Nx)、待測結(jié)構(gòu)內(nèi)的測試點數(shù)(Px)、待測結(jié)構(gòu)的邊界與測試線的交點數(shù)(Ix)，按立體學公式計算出待測結(jié)構(gòu)的體積密度(Volume density，Vv)、面密度(Surface density，Sv)、比表面(Specific surface，δ)、面數(shù)密度(Numerical density on area，NA)各結(jié)構(gòu)參數(shù)。

1.5統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1不同海拔牦牛頸動脈體光鏡和透射電鏡結(jié)構(gòu)觀察

牦牛頸動脈體由實質(zhì)和間質(zhì)構(gòu)成。實質(zhì)被間質(zhì)分隔成許多小葉，每個小葉由大量緊密排列的小球構(gòu)成，小球內(nèi)有豐富的實質(zhì)細胞和少量的間質(zhì)細胞。實質(zhì)細胞包括Ⅰ型細胞和Ⅱ型細胞。圖1～3表明，Ⅰ型細胞數(shù)量多，分布于小球外圍的“C”型區(qū)域內(nèi)側(cè)，常排列成簇，Ⅰ型細胞又根據(jù)細胞核的形態(tài)分為明細胞和暗細胞兩種，明細胞核膜明顯，核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，細胞體積較大、數(shù)量多，胞漿淡染并含有大小不等的空泡，暗細胞核含大量異染色質(zhì)，核深染，細胞體積比前者小。Ⅰ型細胞內(nèi)含大量線粒體和特有的電子致密核心囊泡(Electron dense-cored vesicles，EDCV)，隨著海拔升高，線粒體和EDCV的大小和數(shù)量無明顯變化。Ⅱ型細胞分布于Ⅰ型細胞的周圍，細胞小而少，呈扁的細長形，胞核呈三角形、橢圓形或梭形的，并略向主細胞彎曲，胞漿少。隨海拔的升高，Ⅰ型細胞、Ⅱ型細胞數(shù)量增多。間質(zhì)中分布有豐富的毛細血管，并且隨海拔的升高，毛細血管管腔逐漸變大。

A.海拔2 800 m;B.海拔3 800 m;C.海拔4 600 m。.小球;↑.明細胞；.暗細胞;.Ⅱ型細胞，★.毛細血管A.Altitude 2 800 m；B.Altitude 3 800 m；C.Altitude 4 600 m..Globule；↑.Light cell；.Dark cell；.Type II cell；★.Blood capillary圖1　牦牛頸動脈體光鏡結(jié)構(gòu)圖(HE染色 40×)Fig.1　Light microscopic structure of yak carotid body (HE staining 40×)

A、B、C．海拔2 800 m：A.3 000×；B.10 000×；C.30 000×?！?Ⅰ型細胞；△.Ⅱ型細胞；.電子致密核心囊泡；.線粒體A，B，C.Altitude 2 800 m：A.3 000×；B.10 000×；C.30 000×.☆.Type I cell；△.Type II cell；.EDCV；.Mitochondria圖2　牦牛頸動脈體透射電鏡圖Fig.2　Chief cell and mitochondria in carotid body of yak at different altitudes

A.海拔2 800 m；B.3 800 m；C.海拔4 600 m。★.微血管A.Altiude 2 800 m；B.Altitude 3 800 m；C.Altitude 4 600 m.★.Micrangium圖3　牦牛頸動脈體微血管(CD34免疫組織化學染色 40×)Fig.3　The carotid body micrangium of the yak (CD34 immunohistochemical staining 40×)

2.2不同海拔牦牛頸動脈體的體視學結(jié)果

2.2.1Ⅰ型細胞明細胞：由表1和圖1可知，隨著海拔的升高，牦牛頸動脈體明細胞的Sv、AN逐漸增大，到海拔4 600 m達到最高值，并且各海拔組之間差異顯著(P<0.05)；Vv、δ也均表現(xiàn)為上升趨勢，到海拔4 600 m時也達到最大值，Vv在海拔4 600 m組與海拔2 800 m、海拔3 800 m組差異均顯著(P<0.05)，但后兩組間差異不顯著(P>0.05)；δ在海拔2 800 m組與海拔3 800 m、海拔4 600 m組之間差異均顯著(P<0.05)，而海拔3 800 m和海拔4 600 m組間差異不顯著(P>0.05)。暗細胞(表1)：牦牛頸動脈體暗細胞的Vv、Sv和NA隨著海拔的升高逐漸增大，到海拔4 600 m達到最高值，且與海拔2 800 m組間差異均顯著(P<0.05)，而與海拔3 800 m間差異均不顯著(P>0.05)；δ隨著海拔升高到3 800 m時達到最大值，然后略有下降，且海拔4 600 m組與海拔2 800 m、海拔3 800 m組之間差異均不顯著(P>0.05)，但后兩組之間差異顯著(P<0.05)。

2.2.2Ⅱ型細胞由表1可知，隨著海拔的升高，牦牛頸動脈體Ⅱ型細胞的Sv、NA逐漸升高，到海拔4 600 m達到最高值，且海拔4 600 m組與其它兩組相比差異均顯著(P<0.05)，其它兩組之間相比差異均不顯著(P>0.05)；Vv隨著海拔升高至3 800 m時略有減小(P>0.05)，隨后在海拔4 600 m時升至最大值，且海拔4 600 m與其它兩個海拔組的相比差異均顯著(P<0.05)；δ隨著海拔升高到3 800m時達到最大值，然后略有下降且各海拔組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.3微血管由表1可知，隨著海拔的升高，牦牛頸動脈體微血管的Sv、δ逐漸減小，且Sv在海拔2 800 m組與海拔3 800 m、海拔4 600 m組間差異均顯著(P<0.05)，后兩組之間差異不顯著(P>0.05)，δ各組之間差異均顯著(P<0.05)；NA隨著海拔升高而增大，但3組之間差異均不顯著(P>0.05)；Vv隨海拔升高到海拔3 800 m時有所下降(P>0.05)，隨后逐漸升高，到海拔4 600 m時達到最大值(P<0.05)，但海拔2 800 m組與4 600 m組間差異不顯著(P>0.05)。

3討論

表1　不同海拔牦牛頸動脈體明、暗細胞、Ⅱ型細胞和血管參數(shù)的比較

同列上標不同字母代表差異顯著(P<0.05)。n=5；Δn.照片張數(shù)

The data with different capital letters within the same column differ significantly(P<0.05).n=5；Δn.Number of photograph

頸動脈體對血漿氧和二氧化碳分壓的改變以及H+的含量十分敏感，并通過神經(jīng)體液反射性調(diào)節(jié)心血管及呼吸功能，促進機體對缺氧的適應。長期低氧刺激可引起頸動脈體體積增大，其原因除了血管增生、擴張外，主要是實質(zhì)細胞增生所致。比較正常大鼠和慢性缺氧大鼠CB組織成份，發(fā)現(xiàn)慢性缺氧大鼠CB含有較多的Ⅰ型細胞[13-14]；卜鳳珍等[4]對高原成人頸動脈體研究時發(fā)現(xiàn)高原組頸動脈體主細胞和支持細胞明顯增生，表現(xiàn)為數(shù)量增多、體積增大，并且隨著海拔高度的增加而增加。

明細胞和暗細胞被認為是相同細胞的不同轉(zhuǎn)化類型[3]，有學者稱暗細胞為“儲備”細胞，在一定的范圍內(nèi)會增殖為明細胞，向明細胞過渡[15]。也有人認為暗細胞是主細胞的幼稚階段[4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牦牛頸動脈體明細胞(執(zhí)行功能成熟氧感受細胞)的數(shù)量隨海拔升高而增加，且各海拔組之間具有明顯差異，這與卜鳳珍等[4]的研究結(jié)果相同。而牦牛頸動脈體暗細胞的數(shù)量雖然隨海拔升高而增加，但在海拔2 800 m與3 800 m組間差異顯著，而海拔3 800 m與4 600 m組間差異不顯著，這與卜鳳珍等[4]的研究結(jié)果不太一致，分析原因可能是在海拔3 800 m時，中度低氧刺激使暗細胞大量增生，部分暗細胞轉(zhuǎn)化為主細胞，而在海拔4 600 m時，低氧刺激程度增加，大部分增生的暗細胞迅速轉(zhuǎn)化成為明細胞，以執(zhí)行低氧適應的功能。隨著海拔升高，牦牛細胞內(nèi)線粒體和EDCV的大小和數(shù)量無明顯變化。牦牛雖然選自不同海拔，但是它們都世代生活在高原低氧環(huán)境中，機體受到高原低氧的持續(xù)刺激后，CB中線粒體和EDCV的數(shù)量、大小等均處在相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)。主細胞可迅速刺激呼吸中樞，研究發(fā)現(xiàn)，雖然棕色挪威大鼠的通氣反應低于SD大鼠，但棕色挪威大鼠的主細胞數(shù)量卻多于SD大鼠[16]，至于不同海拔牦牛的低氧通氣反應特征如何將有待于進一步研究。

頸動脈體支持細胞具有干細胞潛能[17]。最近的研究表明，在對低氧的應答中，低氧并沒有直接影響神經(jīng)干細胞增生，而是通過頸動脈體成熟球細胞分泌的神經(jīng)遞質(zhì)-內(nèi)皮素1(為氧感受元件)，與表達內(nèi)皮素1受體的干細胞建立大量的突觸樣聯(lián)系，誘導支持細胞增生[18]。在慢性低氧刺激下支持細胞可以分化為神經(jīng)干細胞標記物(Nestin)陽性的過渡態(tài)細胞，并可增殖分化為酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH) 陽性的球細胞[17]。牦牛為了能更好地適應低氧環(huán)境，隨著海拔升高，機體需要大量的支持細胞向明細胞過渡以執(zhí)行其功能，本研究中表現(xiàn)為支持細胞數(shù)量隨海拔升高而增多的現(xiàn)象，這也與卜鳳珍等[4]的研究結(jié)果相同。

頸動脈體具有復雜的血管構(gòu)筑和巨大的血流量[8，10，19]，目前認為這與它的化學感受器感受功能有密切的關系，高度的血管化有利于準確地獲得動脈血液化學成分的變化。低氧下頸動脈體體積明顯增大，其原因與血管的增生及擴張有關。大鼠低氧28 d，發(fā)現(xiàn)CB血竇體密度從14%增加到31%[20]；楊風鄉(xiāng)等[8]報道進入高原7 d大鼠頸動脈體微血管體密度急劇增多，與平原組之間均有極顯著差異，但微血管比表面下降，與平原組相比顯著差異，表明微血管擴張明顯；進入高原30 d大鼠微血管體密度、面密度進一步增高，比表面繼續(xù)呈下降趨勢，表明微血管進一步擴張。本研究結(jié)果顯示，各海拔組牦牛頸動脈體中均分布有豐富的血管，并且隨著海拔的升高，血管數(shù)量呈增加趨勢，但3個海拔組之間差異不顯著；而血管的管腔隨海拔的升高明顯增大，這與楊風鄉(xiāng)等[8]研究報道基本一致，說明牦牛通過頸動脈體組織中微血管擴張，增加頸動脈體的血流量來準確地獲得動脈血液化學成分的變化，從而提高頸動脈體組織獲氧效率，以增強對低氧環(huán)境的適應能力。研究報道，兔子CB血流量的減少參與了外周化學反應敏感性的增加[21]，那么，隨著海拔的升高，牦牛CB血流量的增加，是否與低氧通氣反應鈍化有關將有待于進一步研究證實。

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(編輯程金華)

Morphological Observation and Stereologic Study on Carotid Body of Yaks at Different Altitudes

ZHANG Shou1，CHANG Lan1*，LEI Nai-hu1，2，MA Yan-fang1，SHEN Ming-hua1

(1.VeterinaryMedicineDepartmentofAgricultureandAnimalHusbandaryCollege，QinghaiUniversity，Xining810016，China；2.TianjunCountyAnimalHusbandryandVeterinaryStationofQinghai,Tianjun817200,China)

Abstract:To reveal the morphological structure characteristics of carotid body of Yak in different hypoxia.In this study,the morphological structures of carotid body observed by histologial，immunohistochemical methods and electron transmission microscopy techniques in health adult yaks at different altidudes in Qinghai Province，and the volume density(Vv)，surface density(Sv)，numerical density on area(NA) and specific surface(δ) of type Ⅰ cells(light and dark)，type Ⅱ cells and microvessels in carotid body of yaks at different altitudes were compared by light microscope and microstereology.The results showed that there were many more light cells than dark cells.The type I cells contain mitochondria and electron dense-cored vesicles in their cytoplasm，in size and number of mitochondria and electron dense-cored vesicles，no significant differences between 2 of the groups were found with height of sea level.The type Ⅱ cells surrounding type Ⅰ cells were small and little.There were rich capillaries in mesenchyme，increasing diameter of the inner lumen of the capillaries with the elevation increasing.The numerical density on area and surface density of light cells were increased with height of sea level，and there were the significant difference between any 2 of the groups.The volume density，surface density and numerical density on area of dark cells gradually increased with altitude，there was the significant difference between altitude 4 600 m and altitude 2 800 m.The surface density and numerical density on area of type Ⅱ cells gradually increased with the elevation rise，and there were the significant difference between 4 600 m and 2 800 m，3 800 m respectively.The surface density and specific surface of microvessels decreased with altitude.In surface density，there was significantly different between altitude 4 600 m and 2 800 m，in specific surface，there were significant difference between any 2 of the groups.The results suggested that these type Ⅰ cells and type Ⅱ cells increased markedly in number，and the microvessels lumina dilated obviously with height of sea level.

Key words:structure；microstereology；carotid body；yak；different altitude

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.029

收稿日期：2015-08-17

基金項目：國家自然科學基金(31360590)；青海省科技應用基礎項目(2014-ZJ-711)

作者簡介：張壽(1964-)，男，青海西寧人，教授，碩士生導師，主要從事高原動物低氧適應研究，E-mail:qhzhangshou@163.com *通信作者：常蘭，E-mail:changlan0123@163.com

中圖分類號：S852.16

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0630-07