朱鳳珠，魯　梅，黃慶華，楊少華，黃艷艷，吳家強(qiáng)，譚劉剛，張秀美，崔言順，許傳田*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；3.山東濰坊工程職業(yè)學(xué)院，青州 262500)

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雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白MHCⅠ分子限制性T細(xì)胞表位的鑒定

朱鳳珠1，2，魯梅3，黃慶華1，楊少華1，黃艷艷1，吳家強(qiáng)1，譚劉剛2，張秀美1，崔言順2，許傳田1*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；3.山東濰坊工程職業(yè)學(xué)院，青州 262500)

摘要：利用生物結(jié)構(gòu)技術(shù)預(yù)測(cè)傳染性支氣管炎S1蛋白的1條細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位，并合成相應(yīng)的候選多肽(Sp6)。為了確定S1蛋白中確實(shí)存在該T細(xì)胞表位，并鑒定這條T細(xì)胞表位的正確性，構(gòu)建了含有S1基因的重組質(zhì)粒pCAGGS-S1，通過(guò)間接免疫熒光和Western blot確定該重組質(zhì)粒可以在真核細(xì)胞表達(dá)后，將該重組質(zhì)粒免疫SPF雞，間接ELISA檢測(cè)血清中的抗體。采集免疫雞的脾淋巴細(xì)胞并用合成的候選多肽刺激，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ的分泌量以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖情況，初步確定該候選肽的正確性。間接免疫熒光、Western blot和間接ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明，S1蛋白能夠在293T細(xì)胞中獲得表達(dá)并能夠引起機(jī)體的體液免疫，說(shuō)明S1蛋白具有反應(yīng)原性，為進(jìn)一步驗(yàn)證T細(xì)胞表位打下了基礎(chǔ)；熒光定量PCR結(jié)果顯示Sp6刺激后的雞的脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ的分泌量明顯增加；流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)Sp6和不相關(guān)多肽NP89-97刺激后及空白對(duì)照，CD8+T淋巴細(xì)胞增殖分別為34.8%、2.6%、0。以上結(jié)果表明，多肽Sp6能在體外誘導(dǎo)活化的雞淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，是IBV S1的CTL表位。該研究結(jié)果對(duì)傳染性支氣管炎病毒免疫機(jī)制和通用疫苗研究具有借鑒意義。此次研究結(jié)果表明多肽Sp6能在體外誘導(dǎo)活化的雞淋巴細(xì)胞產(chǎn)生CTL，是IBV S1的CTL表位。該研究結(jié)果對(duì)傳染性支氣管炎病毒免疫機(jī)制和通用疫苗研究具有借鑒意義。

關(guān)鍵詞：禽傳染性支氣管炎病毒；S1蛋白；CTL表位

傳染性支氣管炎病毒(IBV)是威脅養(yǎng)禽行業(yè)的主要病原之一，各日齡的雞均易感[1]。雖然用活疫苗或滅活疫苗能在一定程度上預(yù)防傳染性支氣管炎的發(fā)生，但由于變異株的不斷出現(xiàn)，傳染性支氣管炎仍然呈經(jīng)常流行性暴發(fā)，給養(yǎng)殖行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。多重疫苗的頻繁使用等因素使IBV在復(fù)制過(guò)程中容易出現(xiàn)缺失、插入、突變或重組，進(jìn)而導(dǎo)致IBV不斷產(chǎn)生變異，新的血清型和基因型不斷出現(xiàn)[2]。而IB疫苗在不同血清型之間僅提供很小或不能提供有效的交叉保護(hù)作用[3]。IBV表現(xiàn)出的廣泛的組織嗜性和高度的遺傳變異性大大增加了對(duì)該病的預(yù)防難度[4]。因此，研制更加高效、安全、完善的IB疫苗已成為禽病科研的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

通用疫苗的研發(fā)基于重組蛋白質(zhì)、病毒樣顆粒、病毒載體、DNA疫苗等技術(shù)[5]。表位疫苗是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型疫苗，其免疫效力在動(dòng)物試驗(yàn)中得到驗(yàn)證，表位疫苗主要選取保護(hù)性抗原基因中決定抗原特異性的簇團(tuán)。S1基因是IBV的免疫原基因，可誘導(dǎo)產(chǎn)生血凝抑制和中和抗體，還能誘導(dǎo)雞的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。周繼勇等研究表明，用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的IBV S1蛋白免疫后，雛雞可以對(duì)致病性IBV產(chǎn)生血清中和抗體，其脾可在體外分泌IL-2并發(fā)生T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[6]。通過(guò)遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed typehyper sensitivity，DTH)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，S1蛋白的亞單位免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的DTH反應(yīng)，這充分證實(shí)了細(xì)胞介導(dǎo)免疫在IBV感染后的免疫保護(hù)中起著重要作用[7-8]。作為細(xì)胞介導(dǎo)免疫的重要一步，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞通過(guò)識(shí)別主要組織相容性抗原(MHC)Ⅰ類分子結(jié)合抗原來(lái)識(shí)別并殺傷靶細(xì)胞[9]。

作者前期研究表明，免疫過(guò)活疫苗的SPF雞，在免疫后2周用IBV強(qiáng)毒攻毒，沒(méi)有雞死亡，但是攻毒前沒(méi)有檢測(cè)IBV中和抗體，到了免疫后第三周才檢測(cè)到IBV中和抗體。因此推測(cè)，在免疫的前期，主要是細(xì)胞免疫在發(fā)揮作用。為了證明這一點(diǎn)，需要確認(rèn)在IBV 的S1蛋白中，確實(shí)有CTL 能識(shí)別的 MHC-Ⅰ結(jié)合表位肽存在。因此，作者通過(guò)生物結(jié)構(gòu)學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)了IBV S1蛋白的1個(gè)潛在的 T 細(xì)胞表位多肽Sp6，用表達(dá)S1基因的重組質(zhì)粒免疫SPF雞，之后采集免疫雞的脾淋巴細(xì)胞并用合成的候選肽刺激，利用流式細(xì)胞術(shù)和SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR方法檢測(cè)脾CD8+T淋巴細(xì)胞增殖以及分泌IFN-γ的含量等指標(biāo)來(lái)驗(yàn)證候選肽的正確性，為研制具有免疫保護(hù)的通用疫苗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1病毒株及雞胚

分離株327毒株，是本實(shí)驗(yàn)室在2008年從山東肉雞上分離的一株可以引起腎病變的IBV毒株。SPF雞胚和SPF雞購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞研究中心。

1.2引物、菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞、多肽和主要試劑

引物參考GenBank中IB全基因組序列，設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增S1基因的特異性引物(上游引物：5′-GGAATTCGCCACCATGTTGGGGAAGTCACT-G-3′；下游引物：5′-CCGCTCGAGTCAACGCCTGCGACGATGTGA-3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；DH5α、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS購(gòu)自優(yōu)寶生物；293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；Trizol Reagent RNA 抽提試劑、One-Step RT-PCR試劑盒和DNA Marker DL 2000均購(gòu)自山東賽恩斯科技有限公司。IB陽(yáng)性血清(雞源)由本實(shí)驗(yàn)室制備；FITC標(biāo)記的兔抗雞抗體(FITC-IgG)、HRP標(biāo)記的兔抗雞抗體(IgG-HRP)、封閉抗體mouse-IgG、羧甲基熒光素乙酰乙酸(CFSE)均購(gòu)自Sigma公司；LipofectamineTM3000購(gòu)自Invitrogen公司；Sp6多肽(NQFYIKLT)及不相關(guān)多肽NP89-97(PKKTGGPIY)由上海生工合成。雞臟器淋巴細(xì)胞分離液KIT購(gòu)自TBD(LTS1090CP)；Mouse Anti-Chicken CD8-PE 購(gòu)自SouthernBiotech。熒光定量?jī)x器Light Cycler 480Ⅱ(Roche)、雷杜酶標(biāo)分析儀Rayto RT-6100(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)；流式細(xì)胞儀BD FACSDiva 7.0(購(gòu)自BD公司)。

1.3pCAGGS-S1的構(gòu)建

將IB分離株327接種9～11日齡SPF雞胚，37 ℃溫箱培養(yǎng)72 h(棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚)，無(wú)菌收集尿囊液，離心，按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組RNA。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR程序?yàn)椋?5 ℃4 min；94 ℃30 s；52 ℃30 s；72 ℃1 min 30 s；72 ℃10 min；30個(gè)循環(huán)?；厥誔CR擴(kuò)增的S1基因，回收產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切處理后與pCAGGS載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR初步鑒定后，由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，并將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pCAGGS-S1。

1.4間接免疫熒光檢測(cè)pCAGGS-S1蛋白瞬時(shí)表達(dá)

待293T細(xì)胞長(zhǎng)至70%～90%時(shí)轉(zhuǎn)染pCAGGS-S1，轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備好爬片，轉(zhuǎn)染前12 h進(jìn)行鋪板。轉(zhuǎn)染48 h后，吸掉細(xì)胞上清，加入等體積的PBST洗3次，每次5 min。加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min，PBST洗3次，每次5 min。加入通透劑0.2%TritonX-100，10～15 min，PBST洗3次，每次5 min。加入稀釋后的一抗(傳支陽(yáng)性血清)，室溫作用1 h，PBST洗3次，每次5 min。加入稀釋后的二抗(FITC標(biāo)記的兔抗雞抗體)，室溫避光作用1 h，PBST洗3次，每次5 min。加入3～5 μL指甲油進(jìn)行封片，靜止5 min，用倒置熒光顯微鏡，在495 nm 下，觀察熒光。

1.5Western blot 檢測(cè)pCAGGS-S1蛋白瞬時(shí)表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染48 h后的293T細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后，進(jìn)行SDS-PAGE，并電轉(zhuǎn)至NC膜。將NC膜置于5%脫脂奶粉封閉液，4 ℃過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min。加入5%脫脂奶粉300倍稀釋的傳支陽(yáng)性血清作為一抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min。加入5%脫脂奶粉8 000倍稀釋的羊抗雞IgG-HRP二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min。DAB顯色，觀察條帶。

1.6 重組質(zhì)粒免疫后血清中S1抗體的檢測(cè)

24只3周齡SPF雞平均分成兩組：A組，免疫重組質(zhì)粒pCAGGS-S1；B組作為對(duì)照，免疫空載體。免疫劑量為100 μg·只-1[10]；免疫途徑為腿部多點(diǎn)肌肉注射；免疫后21 d以相同的劑量和方式加強(qiáng)免疫一次。所有試驗(yàn)雞于免疫后7、14、21 d采血，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將原核表達(dá)的S1蛋白以不同濃度包被ELISA板，對(duì)IBV陽(yáng)性血清及陰性血清也以不同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。最終確定S1蛋白的最佳包被濃度為4.2 μg·mL-1，血清的最佳稀釋倍數(shù)為1∶120。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：OD450 nm值< 0.43為陰性血清，P/N≥2.1為陽(yáng)性血清。采用SD方差對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.7候選肽的鑒定

1.7.1CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖試驗(yàn)加強(qiáng)免疫兩周后的SPF雞，無(wú)菌取出脾，置于平皿中，用Hanks洗滌三次，加入2 mL RPMI-1640培養(yǎng)液。粗剪成小塊，用無(wú)菌的注射器芯管輕輕碾碎，200目篩網(wǎng)過(guò)濾到25 mL試管內(nèi)。1 000 r·min-1，3 min，棄上清，再用Hanks清洗3次，每次800 r·min-1離心3 min。將細(xì)胞懸于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中。取細(xì)胞懸液，小心加入到等體積的細(xì)胞分離液面上。收集淋巴細(xì)胞層放入含細(xì)胞洗滌液的試管中，充分混勻后，1 200 r·min-1，20 min，棄上清留沉淀。將細(xì)胞重新懸，重復(fù)洗滌2次即得淋巴細(xì)胞。取9 μL重懸細(xì)胞液，加入1 μL的0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液，染色3～5 min，計(jì)數(shù)活細(xì)胞后，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106·mL-1。將接種于24孔板，每孔1 mL，分別加入Sp6合成肽刺激物及不相關(guān)多肽NP89-97，終質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1。同時(shí)設(shè)置正常的脾淋巴細(xì)胞為空白對(duì)照組。37 ℃，5% CO2，培養(yǎng)3 d。取出培養(yǎng)3 d后的脾淋巴細(xì)胞，將1×106的細(xì)胞放入1.5 mL的EP管中，3 000 r·min-1，5 min，棄上清，加入100 μL PBS懸浮細(xì)胞。加入封閉抗體mouse-IgG(1×106·μL-1)，室溫15 min。加入熒光抗體Mouse Anti-Chicken CD8-PE(0.2 μg·106cell-1)，4 ℃，避光，30 min。加入350 μL PBS輕輕混勻，3 000 r·min-1，5 min，棄上清。重復(fù)洗滌兩次，最后將細(xì)胞重懸于500 μL PBS中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。1.7.2不同多肽體外刺激后，熒光定量PCR檢測(cè)IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄量將淋巴單細(xì)胞懸液加入合成多肽刺激物和不相關(guān)多肽，終質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞的總RNA。

模板cDNA的合成和PCR擴(kuò)增：以提取的總RNA為模板，用One-Step RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。實(shí)驗(yàn)室已建立好的IFN-γ的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=-3.223x+35.97(圖1)，以cDNA為模板對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)?？偡磻?yīng)體系20 μL：cDNA模板1 μL、SYBR Premix Ex TaqTM10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、去離子水8 μL，混勻后在熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃10 s；55 ℃15 s； 72 ℃15 s；擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)。以雞β-actin基因作為內(nèi)參基因校正試驗(yàn)誤差。每種細(xì)胞中IFN-γ基因 mRNA的精確拷貝數(shù)由熒光曲線的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得。IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平為IFN-γ基因總拷貝/β-actin基因總拷貝。根據(jù)公式計(jì)算出每個(gè)樣本的歸一化值，歸一化值=目的基因濃度/內(nèi)參基因濃度。利用公式：

計(jì)算待測(cè)組目的基因相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)差異倍數(shù)。然后分別統(tǒng)計(jì)待測(cè)組和對(duì)照組所有樣本歸一化值的算術(shù)平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)。

圖1　IFN-γ基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of IFN-γ gene

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pCAGGS-S1的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒pCAGGS-S1經(jīng)菌液PCR鑒定，擴(kuò)增條帶與預(yù)期大小一致(圖2-A)，測(cè)序鑒定，S1基因已插入載體pCAGGS中。用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCAGGS-S1后得到約1 700和4 800 bp的兩個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2-B)。兩者均表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.pCAGGS-S1 PCR產(chǎn)物電泳；2.陰性對(duì)照；3.pCAGGS-S1雙酶切電泳；M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M1.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.The amplification products of pCAGGS-S1；2.The negative control；3.The double digestion identification of the pCAGGS-S1； M.DL2000 DNA marker；M1.DL5000 DNA marker圖2　重組質(zhì)粒pCAGGS-S1的PCR和酶切鑒定Fig.2　PCR and double digestion identification of the recombinant plasmid pCAGGS-S1

2.2間接免疫熒光和Western blot檢測(cè)S1蛋白的瞬時(shí)表達(dá)

2.2.1間接免疫熒光鑒定S1蛋白的瞬時(shí)表達(dá)重組質(zhì)粒pCAGGS-S1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h，在熒光顯微鏡下出現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光(圖3A)，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞未出現(xiàn)熒光信號(hào)(圖3B)。該試驗(yàn)結(jié)果表明：重組質(zhì)粒pCAGGS-S1在真核細(xì)胞中能夠得到正確的表達(dá)。

A.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；B.空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞A.Recombinant plasmid pCAGGS-S1 transfect in 293T cells；B.pCAGGS transfect in 293T cells圖3　間接免疫熒光檢測(cè)pCAGGS-S1的瞬時(shí)表達(dá)(400×)Fig.3　Transient expression of recombinant plasmid pCAGGS-S1(400×)

2.2.2Western blot鑒定S1蛋白的瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)染pCAGGS-S1的293T細(xì)胞樣品在90 ku出現(xiàn)明顯一條帶，與預(yù)期大小一致，而空載體和沒(méi)有轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞樣品沒(méi)有出現(xiàn)任何條帶，這表明pCAGGS-S1在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)，并且具有良好免疫原性(圖4)。

2.3免疫雞血清中S1抗體的檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)果表明，首次免疫pCAGGS-S1后，第一周雞血清S1抗體幾乎檢測(cè)不到，第二周和第三周抗體滴度變化不明顯，第三周加強(qiáng)免疫后1周，S1抗體OD值上升趨勢(shì)尤為明顯，在二免3周后S1抗體OD值達(dá)到最大(圖5)。這說(shuō)明，重組質(zhì)粒pCAGGS-S1在雞體內(nèi)獲得了表達(dá)，并且成功誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。2.3.1CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖試驗(yàn)用Mouse Anti-Chicken CD8-PE對(duì)淋巴細(xì)胞標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞儀分群計(jì)數(shù)：發(fā)現(xiàn)經(jīng)多肽Sp6刺激后 CD8+T細(xì)胞有34.8%的增殖，不相關(guān)多肽NP89-97刺激的CD8+T細(xì)胞略有增殖(2.6%)，空白對(duì)照CD8+T細(xì)胞增殖為0(圖6)。這表明肽Sp6能有效刺激活化CD8+T淋巴細(xì)胞增殖。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pCAGGS-S1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；2.pCAGGS轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；3.正常293T細(xì)胞M.Protein marker；1.pCAGGS-S1 transfect in 293T cells；2.pCAGGS transfect in 293T；3.The normal 293T cells圖4　Western blot鑒定S1蛋白的瞬時(shí)表達(dá)Fig.4　The detection of the expressed S1 protein by Western blot

誤差線采用sError bars was made by s圖5　血清中S1抗體的變化水平Fig.5　The change of the S1 antibody level in immunized chickens

圖6　不同肽刺激后CD8+T細(xì)胞增殖流式檢測(cè)結(jié)果Fig.6　CD8+T cell proliferation after stimulation

2.3.2不同肽刺激后，脾淋巴細(xì)胞IFN-γ基因表達(dá)量的檢測(cè)經(jīng)多肽刺激后，Sp6刺激脾淋巴細(xì)胞的IFN-γ基因mRNA拷貝數(shù)明顯高于對(duì)照組脾淋巴細(xì)胞(P≤0.05)(圖7A)。除去試驗(yàn)本身誤差，將拷貝數(shù)做歸一化處理后，Sp6刺激的脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ歸一化值最高為0.035，其IFN-γ基因歸一化值明顯高于空白對(duì)照組脾淋巴細(xì)胞0.002 8，NP89-97組淋巴細(xì)胞IFN-γ基因歸一化值為0.005(P≤0.05)，Sp6刺激的脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ基因歸一化值差異不顯著(P≥0.05)(圖7B)。結(jié)果表明，Sp6能夠刺激雞脾淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌，引起機(jī)體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，為潛在的T細(xì)胞表位候選多肽。

誤差線采用sError bars was made by s圖7　IFN-γ基因拷貝數(shù)和歸一化值Fig.7　The copy number and the normalized value of IFN-γ gene

3討論

S蛋白是構(gòu)成冠狀病毒最表層纖突的主要成分，由等摩爾分子的S1和S2構(gòu)成，IBV的主要T細(xì)胞表位位于S1上。IBV血清型眾多，S1是IBV變異程度最大的基因，不同毒株S1基因核苷酸變化幅度可高達(dá)50%以上，在同一血清毒株的S1基因中有25%～50%的氨基酸差異[11]。這些差異導(dǎo)致各毒株之間交叉保護(hù)性弱，本試驗(yàn)篩選S1蛋白的功能表位，為研制具有免疫保護(hù)的通用疫苗奠定基礎(chǔ)。

S1基因經(jīng)骨骼肌內(nèi)源性表達(dá)后主要通過(guò)MHCⅠ類分子提呈抗原，特別有利于CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的激活，對(duì)IBV免疫保護(hù)具有重要意義[12]。細(xì)胞免疫的重要組成部分為CTL表位，而T細(xì)胞表位具有MHC限制性[13]。MHCⅠ類分子可以識(shí)別具有特定motif的8肽或者9肽，在識(shí)別的過(guò)程中，溝槽底部的某些氨基酸與表位肽中的某些氨基酸相互作用，從而達(dá)到特異性識(shí)別的效果。

作者人工合成1條多肽片段，利用IBV毒株的S1真核質(zhì)粒免疫SPF雞，確定了針對(duì)該毒株的通用S1蛋白T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，該多肽能夠刺激IFN-γ高水平的分泌，且重復(fù)性好，可作為優(yōu)勢(shì)候選表位。

禽類細(xì)胞因子的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展滯慢，源于相應(yīng)試劑的匱乏，現(xiàn)有檢測(cè)T細(xì)胞表位的方法包括：淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，該方法只能反應(yīng)整體細(xì)胞的增殖狀態(tài)，不能從單細(xì)胞水平進(jìn)行鑒定；體外抗原提呈試驗(yàn)：這種方法通過(guò)表位肽刺激未成熟DC細(xì)胞系，根據(jù)其能否提呈抗原表位給T細(xì)胞雜交瘤來(lái)鑒定T細(xì)胞抗原表位，由于特定細(xì)胞系的要求，使其具有一定的局限性；MTT還原法：這種檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，但存在微生物污染，假陽(yáng)性結(jié)果居高；流式細(xì)胞分選法以及ELI spot檢測(cè)方法。

作者選用了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，它是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)能夠快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)，并把特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類收集。該方法可以準(zhǔn)確地把CD8+T細(xì)胞從淋巴細(xì)胞群中分離出來(lái)，并且可以檢測(cè)其增殖情況，為試驗(yàn)的順利進(jìn)行提供保障。本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)檢測(cè)IFN-γ的分泌情況，該方法是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)施實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程并對(duì)模板進(jìn)行定量分析的方法，是目前檢測(cè)基因表達(dá)的最準(zhǔn)確、靈敏、有力的方法之一，已被應(yīng)用于各種樣品中基因mRNA水平的檢測(cè)[14-16]。

淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和雞IFN-γ檢測(cè)結(jié)果顯示：多肽Sp6刺激活化T細(xì)胞后，CD8+T細(xì)胞增殖34.8%，并且雞IFN-γ的分泌量也明顯增加，表明多肽Sp6能夠誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，是IBV S1中的T細(xì)胞表位。

本研究使用的SPF雞是來(lái)航雞，而該雞種是B15單倍型，即它只含有一種MHCⅠ類分子，因此可以以表位肽與B15 MHCⅠ類分子的相互作用結(jié)果來(lái)解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。這為利用分子建模和分子力學(xué)技術(shù)在S1蛋白中篩選潛在表位肽提供了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)用含有全長(zhǎng)IBVS1基因的重組質(zhì)粒pCAGGS-S1免疫SPF雞，在血清中檢測(cè)到了S1的特異性抗體，表明pCAGGS-S1可以誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫反應(yīng)。經(jīng)多肽Sp6刺激的脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ最多，而且實(shí)時(shí)熒光定量PCR證明Sp6刺激脾淋巴細(xì)胞生成的表達(dá)IFN-γ的mRNA拷貝數(shù)最高。流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)Sp6、不相關(guān)多肽NP89-97刺激后及空白對(duì)照，CD8+T淋巴細(xì)胞增殖分別為34.8%、2.6%、0。以上結(jié)果表明Sp6能夠誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，可能是 IBV S1蛋白的CTL表位。該研究結(jié)果初步確定了該多肽為IBV S1蛋白功能性T細(xì)胞抗原表位，為后續(xù)研制IBV通用表位疫苗奠定基礎(chǔ)。

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(編輯白永平)

Identification of the MHC Class Ⅰ-restricted Cytotoxic T Cell Epitope in Avian Infectious Bronchitis Virus S1 Protein

ZHU Feng-zhu1，2，LU Mei3，HUANG Qing-hua1，YANG Shao-hua1，HUANG Yan-yan1，WU Jia-qiang1，TAN Liu-gang2，ZHANG Xiu-mei1，CUI Yan-shun2，XU Chuan-tian1*

(1.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，ShandongKeyLabofAnimalDiseaseControlandBreeding，Jinan250100，China；2.CollegeofAnimalScience，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China；3.WeifangEngineeringVocationalCollege，Qingzhou262500，China)

Abstract:A T cell epitope candidate peptide Sp6 of the avian infectious bronchitis virus S1 was predicted with biological structures technology.To identify this peptide exist in S1 protein and verify validity of Sp6，the recombinant plasmid pCAGGS-S1 was constructed.While it can be expressed in eukaryotic cells after determined by indirect immunofluorescence and Western blot，using the recombinant plasmid immune SPF chickens，and the antibodies against S1 were detected by ELISA.Splenic cells were collected from inoculated chickens and stimulated with the peptides Sp6，NP89-97(PKKTGGPIY) and negative control.By SBRY Green qPCR detecting IFN-γ production of spleen lymphocytes and flow cytometry detecting the multiplication of CD8+T lymphocytes，preliminarily make sure that the candidate peptide is correct.The IFA /Western blot and ELISA results showed that the expression of S1 was confirmed in 293T and can induced the humoral immune，indicate that S1 protein is reaction to the original and lied a foundation for further validation of T cell epitope；the results of SBRY Green qPCR showed that spleen lymphocytes of chickens stimulated with the peptide Sp6 secreted significantly-increased IFN-γ.Flow cytometry assay results showed that the CD8+T lymphocytes were proliferated by 34.8%，2.6%，and 0，respectively，which indicated that the peptide Sp6 was a T cell epitope of IBV S1 and it can induce activation of chicken lymphocytes to produce cytotoxic T lymphocyte (CTL) reactioninvivo.All above results indicate that the peptide Sp6 was a T cell epitope of IBV S1 and it can induce activation of chicken lymphocytes to produce CTL reactioninvivo.The results possesses significance to mechanism of protective immunity against avian infectious bronchitis virus and the research towards universal IBV vaccine.

Key words:avian infectious bronchitis virus；S1 glycoprotein；CTL epitope

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.019

收稿日期：2015-08-06

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-42-Z12)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303033)；十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2015BAD12B03)

作者簡(jiǎn)介：朱鳳珠(1988-)，女，山東菏澤人，碩士生，主要從事動(dòng)物傳染病免疫機(jī)制研究，E-mail：zfz0530@163.com *通信作者：許傳田，E-mail:xcttaian2002@163.com

中圖分類號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0559-07