陳曉勇，孫洪新，袁　明，康振江，敦偉濤*，趙興波

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193； 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000；3.河北省畜牧良種工作站，石家莊 050000)

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綿羊線粒體基因變異與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析

陳曉勇1，2，孫洪新2，袁明3，康振江3，敦偉濤2*，趙興波1*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193； 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000；3.河北省畜牧良種工作站，石家莊 050000)

摘要：本研究旨在分析mtDNA變異與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)系。以杜泊、陶賽特、薩?？司d羊為研究對象，通過線粒體基因組測序、基因型分析等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，杜泊羊線粒體基因組編碼區(qū)存在25個突變位點，包括rRNA突變位點2個，tRNA突變位點2個，多肽編碼基因突變位點21個(包括錯義突變9個和同義突變12個)；陶賽特羊線粒體基因組編碼區(qū)存在20個突變位點，包括rRNA突變位點5個，tRNA突變位點1個，多肽編碼基因突變位點14個(包括錯義突變3個和同義突變11個)；薩福克羊線粒體基因組編碼區(qū)存在77個突變位點，包括rRNA突變位點7個，tRNA突變位點3個，多肽編碼基因突變位點67個(包括錯義突變7個和同義突變60個)。杜泊、陶賽特綿羊mtDNA各突變位點均與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)不顯著；薩?？司d羊中發(fā)現(xiàn)的14個變異位點與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05)，其中單個突變位點(T7759C)和單倍型(ATTCATTAAACTTT)最大效應(yīng)均為0.22只·胎-1。結(jié)果表明，杜泊、陶賽特綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀線粒體基因效應(yīng)不顯著；薩福克綿羊mtDNA變異與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)。

關(guān)鍵詞：線粒體編碼基因；產(chǎn)羔數(shù)；綿羊；遺傳變異；基因效應(yīng)

在動物育種中，線粒體基因(mtDNA)作為核外遺傳物質(zhì)，其遺傳效應(yīng)對經(jīng)濟性狀的作用不容忽視，畜禽核外遺傳效應(yīng)最早于20世紀(jì)80年代在奶牛產(chǎn)奶性狀的研究中提出，之后在豬、雞、鴨、綿羊等畜種上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。如雞的屠宰性狀[1]、奶牛的產(chǎn)奶性狀[2-3]、肉牛的生長[4]和肉質(zhì)性狀[5-6]、豬的繁殖[7]和肉質(zhì)性狀[8]、綿羊的生長性狀[9]和繁殖性狀[10]等。盡管mtDNA影響畜禽重要經(jīng)濟性狀的研究時有報道，但長期以來存在爭議[11-12]。因此，開展系統(tǒng)的線粒體基因組遺傳變異研究，驗證其基因效應(yīng)是動物遺傳育種理論的重要補充和完善。

產(chǎn)羔數(shù)是綿羊生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟性狀之一，長期以來，產(chǎn)羔數(shù)性狀的研究主要集中在核基因上，線粒體基因變異與產(chǎn)羔數(shù)性狀存在關(guān)聯(lián)的研究也有報道，但存在較大爭議。自20世紀(jì)90年代以來，我國從國外引入了一些肉用綿羊品種，包括杜泊、陶賽特、薩?？搜虻?。從基因組角度研究線粒體基因與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)系，將有助于全面認(rèn)知綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的遺傳機理。因此，本研究以杜泊、陶賽特、薩?？?個肉用綿羊品種為研究對象，進(jìn)行線粒體基因組遺傳變異分析，并對線粒體基因功能變異與產(chǎn)羔數(shù)性狀作關(guān)聯(lián)分析，目的是分析產(chǎn)羔數(shù)性狀線粒體基因效應(yīng)。

1材料與方法

1.1試驗動物和DNA提取

肉用綿羊血液及生產(chǎn)數(shù)據(jù)來自河北省畜牧良種工作站種羊場。杜泊綿羊共17個家系77只母羊，217次產(chǎn)羔記錄。陶賽特綿羊共 17個家系81只母羊，267次產(chǎn)羔記錄。薩?？司d羊共21個家系90只母羊，251次產(chǎn)羔記錄。試驗?zāi)秆蚰挲g為4～6歲，胎次在3胎以上。配制20 mmol·L-1EDTA(二鈉鹽)作為抗凝劑，高壓滅菌，在每個樣品管(2 mL EP管)中加入300 μL滅菌后的EDTA，放入離心管盒子待用。利用5 mL注射器由頸靜脈采集全血(每只羊一個注射器)，每個樣品采集血液1.5 mL 左右，裝入備好含有抗凝劑的2 mL EP管中，并做好耳標(biāo)標(biāo)記，將血液樣品置于含有冰盒的保溫箱內(nèi)，待采血結(jié)束后帶回實驗室。采用酚氯仿方法提取總DNA。

1.2線粒體基因組測序

參照綿羊線粒體基因組序列(GenBank No.：AF010406)，使用Primer premier version 5設(shè)計覆蓋綿羊線粒體基因組序列引物，每段序列長度1～1.2 kb，相鄰片段有100 bp左右的重疊區(qū)域。引物信息見表1。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：ddH2O 17.85 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1) 0.5 μL，上游引物(10 mmol·L-1) 1.0 μL，下游引物(10 mmol·L-1) 1.0 μL，TaqDNA Polymerase(5 U·μL-1) 0.15 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性20 s，退火30 s(退火溫度Tm見表1)，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物純化后直接測序，獲得DNA序列信息。

參考已公開的綿羊線粒體全基因組序列(GenBank No.：AF010406)，利用DNASTAR軟件中SeqMan模塊將測序獲得的每一段基因序列進(jìn)行比對、拼接，獲得綿羊線粒體全基因組序列。

1.3變異位點分析

以GenBank上公布的綿羊線粒體基因組全序列(GenBank No.：AF010406)為參考序列，使用DNAStar軟件包中SeqMan軟件將18對不同引物所測定的片段拼接為完整的基因組全序列，并根據(jù)測序峰圖和序列比對獲得遺傳變異信息。使用DNAMAN7.0選擇脊椎動物線粒體密碼子對所有位點進(jìn)行翻譯，分析突變位點。

1.4關(guān)聯(lián)分析

本研究用SAS9.0統(tǒng)計分析軟件廣義線性模型(GLM)中的LSM過程對每個品種中變異位點與產(chǎn)羔數(shù)分別進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并做方差顯著性檢驗。

Yijk為產(chǎn)羔數(shù)性狀表型值，μ為群體平均值，Si為突變位點效應(yīng)，Pj為胎次效應(yīng)，eijk為環(huán)境誤差。

表1　綿羊線粒體基因組遺傳變異分析PCR引物信息

2結(jié)果

2.1肉用綿羊線粒體基因組變異分析

杜泊綿羊線粒體基因組共檢測到25個變異位點，其中多肽編碼區(qū)21個，12S rRNA基因2個(T281C和A542T)，tRNA基因2個(A4975T/tRNA-Trp和G11668A/tRNA-Ser)，多肽編碼區(qū)有9個錯義突變(T3543A/ND1、T7063C/COII、G8264C/ATPase6、A8515G/ATPase6、G9117A/COIII、A9375G/COIII、G12571C/ND5、G13813C/ND6、G14459A/Cytb)。陶賽特綿羊線粒體基因組編碼區(qū)共檢測到20個突變位點，rRNA有5個，包括12SrRNA 3個(G711A、T809C、T958C)和16SrRNA 2個(T1112、C1162T)；tRNA 基因有1個突變位點(tRNA-Lys/T7759C)，多肽編碼區(qū)有14個變異位點，其中3個錯義突變(A7904G/ATPase 8、A8054G/ATPase 6、A8515G/ATPase 6)。薩?？司d羊線粒體基因組編碼區(qū)共檢測到77個變異位點，其中多肽編碼區(qū)共67個，12SrRNA和16SrRNA分別含有3個變異位點(C291T、A394T、A542T)和4個變異位點(A1099T、T1112C、T1933G、C2443T)，tRNA基因檢測到3個變異位點(T7719G /tRNA-Lys、T7759C/ tRNA-Lys和C11606T/ tRNA-His)，13個多肽編碼區(qū)含有7個錯義突變(A3949G/ND2、A8039G/ATPase6、A8515G/ATPase6、A8779G/COIII、C13576T/ND6、T13837C/ND6、C13855T/ND6)(表2)。

2.2肉用綿羊mtDNA功能變異位點與產(chǎn)羔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析

2.2.1杜泊綿羊mtDNA功能變異位點與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，杜泊綿羊mtDNA的13個非同義突變(多肽編碼區(qū)錯義突變、rRNA和tRNA基因突變位點)對產(chǎn)羔數(shù)均無顯著影響(P>0.05)(圖1)。

突變位點間柱形圖上相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。橫坐標(biāo)數(shù)字代表線粒體基因組變異位點。下圖同Same letters on the column means no significant difference between mutation sites(P>0.05).The number below abscissa represent the variation sites in the mitochondrial genome.The same as below圖1　杜泊綿羊線粒體變異位點對產(chǎn)羔數(shù)的影響Fig.1　The effects of mtDNA variant sites on litter size in Dorper sheep

2.2.2陶賽特綿羊mtDNA功能變異位點與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陶賽特綿羊mtDNA的9個非同義突變(多肽編碼區(qū)錯義突變、rRNA和tRNA基因突變位點)均對產(chǎn)羔數(shù)無顯著影響(P>0.05)(圖2)。

2.2.3薩?？司d羊mtDNA功能變異位點與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析利用SAS9.0最小二乘法對薩?？司d羊mtDNA的17個變異位點分別與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，12S rRNA區(qū)域的3個變異位點(C291T、A394T、A542T)對產(chǎn)羔數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。而16S rRNA區(qū)域的4個變異位點(A1099T、T1112C、T1932G、C2443T)、tRNA-Lys基因2個變異位點(T7719G、T7759C)、tRNA-His基因的1個變異位點(C11606T)、以及多肽編碼區(qū)的7個錯義突變位點(A3949G、A8039G、A8515G、A8779G、C13576T、T13837C、C13855T)對產(chǎn)羔數(shù)影響顯著(P< 0.05)(表3)。

表2　不同品種綿羊線粒體基因組突變位點比較

與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)的突變位點分為7個單倍型。有4個個體數(shù)小于5%的稀有單倍型(TCGTGTTAGGTCCC、TCGTGTTAAACTTC、ATGT-ATTAAACTTC、TCGTGGCAGGTCCC)，線性模型分析表明，ATTCATTAAACTTT單倍型母羊產(chǎn)羔數(shù)顯著大于其他單倍型TCGTGGCGGGTCCC(P=0.005)(表4)。產(chǎn)羔數(shù)最大單倍型效應(yīng)為0.22只·胎-1。

圖2　陶賽特綿羊線粒體變異位點對產(chǎn)羔數(shù)的影響Fig.2　The effects of mtDNA variant sites on litter size in Dorset sheep

表3　薩福克綿羊線粒體基因顯著非同義突變位點對產(chǎn)羔數(shù)的影響

表4　基于14個顯著突變位點的單倍型對產(chǎn)羔數(shù)性狀的影響

3討論

雖然很早就有報道m(xù)tDNA會影響動物的經(jīng)濟性狀，但一直存在爭議，且研究進(jìn)展較核基因慢，近年來也有mtDNA 某個基因片段多態(tài)性與經(jīng)濟性狀關(guān)聯(lián)分析的報道，但多數(shù)是基于單個基因的幾個SNP研究[10]。S.Reicher等報道，Afec-Assaf羊線粒體基因組有245個變異位點，其中26個非同義突變[10]，本研究中杜泊綿羊線粒體基因組多肽編碼區(qū)和tRNA基因有7個突變位點(T3543A、C7500A、G8264C、A9375G、G11668A、G12571C、T14055C)與Afec-Assaf羊相同[10]；陶賽特綿羊線粒體基因組多肽編碼區(qū)和tRNA基因有2個突變位點(T7759C、T14055C)與Afec-Assaf羊相同；薩?？司d羊線粒體基因組多肽編碼區(qū)和tRNA基因有5個突變位點(T7719G、T7759C、A8039G、C11606T、T14055C)與Afec-Assaf羊相同。

本研究對肉用綿羊線粒體基因組變異與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果杜泊和陶賽特綿羊線粒體基因組功能突變對產(chǎn)羔數(shù)性狀均無顯著影響，說明杜泊和陶賽特這兩個品種線粒體遺傳變異對產(chǎn)羔數(shù)性狀影響較小，薩?？司d羊線粒體基因組發(fā)現(xiàn)的14個mtDNA突變位點與產(chǎn)羔數(shù)性狀顯著相關(guān)，表明薩?？司d羊線粒體基因組變異影響產(chǎn)羔數(shù)，這與之前的報道結(jié)果一致[10]。此外，S.Reicher 等從基于某段mtDNA序列構(gòu)成的單倍型群中選擇1～2只個體進(jìn)行全基因組測序，對基因組突變位點與產(chǎn)羔數(shù)性狀作關(guān)聯(lián)分析[10]，本研究是隨機從大群中選擇不同母源家系，樣本選擇的隨機性更強，范圍更廣。

引進(jìn)肉用綿羊品種繁殖率低于我國地方品種小尾寒羊、湖羊、洼地綿羊等，很多研究從BMP受體基因[13-14]、性腺軸相關(guān)激素基因[15]等研究小尾寒羊繁殖性狀分子遺傳機理。關(guān)聯(lián)分析作為研究遺傳變異的一種方法，只是為解析表型性狀提供了一種可能。解釋功能基因和表型性狀的關(guān)系需要的是生物學(xué)功能驗證。對于線粒體基因效應(yīng)，轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞模型是當(dāng)前最為有效也是最前沿的研究手段。深入研究綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀線粒體基因遺傳效應(yīng)需從轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞模型方面進(jìn)行功能驗證。

4結(jié)論

杜泊、陶賽特綿羊mtDNA各突變位點均與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)不顯著；薩?？司d羊中發(fā)現(xiàn)的14個變異位點與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)(包括小尾寒羊中的3個顯著位點)，其中單個突變位點(T7759C)和單倍型(ATTCATTAAACTTT)的最大效應(yīng)均為0.22只·胎-1。

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(編輯郭云雁)

Association Analyses between Mitochondrial Coding Gene Variations and Sheep Litter Size

CHEN Xiao-yong1，2，SUN Hong-xin2，YUAN Ming3，KANG Zhen-jiang3，DUN Wei-tao2*，ZHAO Xing-bo1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryofHebeiProvince，Baoding071000，China；3.WorkstationofAnimalScienceBreedsofHebeiProvince，Shijiazhuang050000，China)

Abstract:The aim of the present study was to explore the effects of mtDNA on litter size in sheep.Genome sequencing and genotyping technologies were used for DNA variation analyses on mitochondrial coding genes in Dorper，Dorset and Suffolk sheep.In Dorper sheep，twenty-five mtDNA variations were detected，including 2 mutations in rRNA and tRNA genes，respectively，and 21 variations in polypeptide-coding genes(including 9 missense mutations and 12 synonymous mutations).For Dorset sheep，totally 20 variations，including 5 mutations in rRNA genes，1 mutation in tRNA genes，and 14 substitutions in polypeptide-coding genes(including 3 missense mutations and 11 synonymous mutations) were detected.In Suffolk sheep，there were 77 mutations in mtDNA coding genes，including 7 and 3 substitutions in rRNA and tRNA genes，and 67 mutations in polypeptide-coding genes which contained 7 missense mutations and 60 synonymous mutations.The mtDNA mutations presented poor associations with litter size in Dorper and Dorset sheep.However，in Suffolk sheep，14 mtDNA mutations were significantly associated with litter size(P<0.05)，which both of the maximal values for the effects of the single mutation(T7759C) and haplotype(ATTCATTAAACTTT) were 0.22 per parity.The mtDNA had poor effects on litter size in Dorper and Dorset sheep.Mitochondrial DNA variations were significantly associated with litter size in Suffolk sheep.

Key words:mitochondrial coding genes；litter size；sheep；genetic variation；genetic effect

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.005

收稿日期：2015-03-12

基金項目：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08009-002)；河北省科技支撐計劃項目(14226315D；15226308D)

作者簡介：陳曉勇(1980-)，男，河北灤縣人，高級畜牧師，博士，主要從事動物遺傳繁育及其生物技術(shù)研究，E-mail：chenxiaoyong-2000@163.com *通信作者：敦偉濤，研究員，E-mail:dwt_12323@sohu.com；趙興波，教授，E-mail:zhxb@cau.edu.cn

中圖分類號：S826；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0449-08