林堆賢 梅寶富 鄧志鋒 陳俊輝

[摘要] 目的 探討射頻消融（RFA）對肺癌患者CD4+ T淋巴細(xì)胞亞群抗腫瘤免疫功能的影響。 方法 選取本院2012年8月～2014年8月收治的30例肺癌患者作為研究對象，給予RFA治療，分別于術(shù)前、術(shù)后半個月采集外周血，比較治療前后的Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞水平。 結(jié)果 RFA術(shù)后半個月的外周血Th1水平及Th1/Th2比值顯著高于術(shù)前，Th2、Th17、Treg水平顯著低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 RFA能夠改善肺癌患者CD4+T細(xì)胞亞群的抗腫瘤免疫功能。

[關(guān)鍵詞] 肺癌；射頻消融；CD4+ T淋巴細(xì)胞亞群；免疫功能

[中圖分類號] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）03（b）-0055-03

[Abstract] Objective To explore the influence of the radiofrequency ablation （RFA） on the anti-tumor immune function of CD4+ T lymphocyte subsets in patients with lung cancer. Methods 30 patients with lung cancer from August 2012 to August 2014 in our hospital were selected as the research group，the therapy of RFA was given.Peripheral blood was collected before and after operation half a month，the level of Th1，Th2，Th17，Treg cell was compared respectively. Results The level of Th1 and Th1/Th2 ratio after RFA operation at half a month was higher than that before operation，the level of Th2，Th17，Treg cell after RFA operation at half a month was lower than that before operation，with significant difference （P<0.05）. Conclusion RFA can improve the anti-tumor immune function of CD4+ T lymphocyte subset in patients with lung cancer.

[Key words] Lung cancer；Radiofrequency ablation；CD4+ T lymphocyte subset；Immune function

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國城鎮(zhèn)居民腫瘤死亡原因中居于首位，大多數(shù)患者確診時已經(jīng)失去了手術(shù)切除的機(jī)會[1-2]。射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）的原理是應(yīng)用頻率在460～480 kHz之間的交變高頻電流使腫瘤組織內(nèi)離子發(fā)生高速震蕩，互相摩擦，將射頻能轉(zhuǎn)化為熱能，使局部溫度達(dá)到60～100℃，導(dǎo)致腫瘤組織發(fā)生凝固性壞死[2]。2000年Dupuy等[3]首次報道利用RFA治療肺癌。RFA具有安全性高、創(chuàng)傷小、療效確切、術(shù)后恢復(fù)快等特點，已成為肺癌治療的有效方法之一[2-4]。其在直接損毀腫瘤組織的同時，也可使CD4+ T淋巴細(xì)胞升高，改善機(jī)體的抗腫瘤免疫功能[5-6]。CD4+ T細(xì)胞為不均一細(xì)胞群，研究[7-8]顯示，其主要有Th1細(xì)胞（輔助性1型T細(xì)胞，type 1 helper T cells）、Th2細(xì)胞（輔助性2型T細(xì)胞，type 2 helper T cells）、Th17細(xì)胞（IL-17 producing CD4+ T cells）、Treg細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，regulatory T cell）4種不同的亞群。各淋巴細(xì)胞亞群介導(dǎo)不同的免疫功能，在體內(nèi)又相互作用、相互影響。本研究通過檢測Th1、Th2、Th17及Treg4種不同的CD4+ T細(xì)胞亞群，旨在探討RFA對肺癌患者CD4+ T細(xì)胞抗腫瘤免疫功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年8月～2014年8月本科收治的30例肺癌患者作為研究對象，術(shù)前均進(jìn)行穿刺活檢或纖維支氣管檢查，病理確診為肺癌，其中男19例，女11例；年齡31～70歲，平均48.7歲；腺癌18例，鱗癌12例；Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期17例，Ⅳ期9例。所有患者術(shù)前未接受放化療，無自身免疫性疾病。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 RFA治療

射頻消融采用美國達(dá)隆公司生產(chǎn)的RF2000射頻治療儀及可伸展錨狀射頻電極針，集束電極射頻針為套管針，可呈放射狀釋放出12根微電極針。所有患者采用氣管插管靜吸復(fù)合麻醉，在CT引導(dǎo)下行經(jīng)皮穿刺肺癌射頻消融治療。術(shù)中根據(jù)病灶的大小、位置，避開氣管、支氣管、大血管等重要結(jié)構(gòu)，確定射頻電極針的皮膚進(jìn)針點、穿刺路線及穿刺深度。穿刺射頻針到達(dá)病灶后，釋放微電極，開始RFA治療，局部病灶內(nèi)溫度可達(dá)90～100℃，治療過程由計算機(jī)自動控制。退針時行針道消融。

1.3 CD4+ T淋巴細(xì)胞亞群的檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+ T細(xì)胞亞群。FACS Canto流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司，熒光素偶聯(lián)鼠抗人單克隆抗體（CD3-PE-Cy5、CD3-APC、CD4-PE-Cy5、CD8-APC-Cy7、CD25-FITC、IFN-γ-APC、IL-17-FITC、IL-4-PE、foxp3-PE）購自美國BD Bioscience公司。檢測方法：治療前及治療后半個月清晨用肝素鋰抗凝管收集肺癌患者空腹外周靜脈血5 ml，即行流式細(xì)胞術(shù)檢測。采用熒光素偶聯(lián)的單克隆抗體CD3-PE-Cy5、CD8-APC-Cy7、IFN-γ-APC、IL-17-FITC及IL-4-PE對細(xì)胞表面抗原及胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行直接標(biāo)記，通過檢測細(xì)胞因子的IFN-γ、IL-4、IL-17分析Th1、Th2、Th17的細(xì)胞水平，染色后上機(jī)測定各項指標(biāo)，以FACS Diva軟件分析Th1、Th2、Th17細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞的百分率。Treg細(xì)胞的特征表型分子是CD3+CD4+CD25+foxp3+，以熒光素偶聯(lián)的單克隆抗體CD3-APC、CD4-PE-Cy5、CD25-FITC及Foxp3-PE對特征表型分子進(jìn)行直接標(biāo)記，染色后上機(jī)測定各項指標(biāo)，以FACS Diva軟件分析Treg細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞的百分率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

RFA術(shù)后半個月的外周血Th1水平及Th1/Th2比值顯著高于術(shù)前，Th2、Th17、Treg水平顯著低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

3 討論

腫瘤患者免疫功能低下和紊亂，腫瘤細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子可抑制機(jī)體宿主的抗腫瘤反應(yīng)，免疫功能低下又促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長，增加了腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。細(xì)胞免疫在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮著主要作用，其主要免疫活性細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞，而CD4+ T細(xì)胞是效應(yīng)T細(xì)胞的重要成分[9]。根據(jù)分泌細(xì)胞因子不同，CD4+ T細(xì)胞主要包括Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞4種亞群，各亞群主要通過分泌不同的細(xì)胞因子發(fā)揮作用[7，10-11]。Th1細(xì)胞主要分泌γ-干擾素（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子β（TNF-β）等[7，10]，活化的Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子具有較強的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用。IFN-γ可抑制腫瘤血管生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；IL-2可刺激自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK細(xì)胞）殺瘤活性；TNF-β可直接造成腫瘤細(xì)胞的凋亡[10，12-13]。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13[10]，IL-4和IL-10可抑制Th1類細(xì)胞因子的應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤生長，與Th1細(xì)胞相互拮抗[15-16]，機(jī)體Thl型細(xì)胞占優(yōu)勢時有利于機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)。肺癌患者存在Th1/Th2免疫失衡，當(dāng)Th2細(xì)胞占優(yōu)勢時，能夠抑制Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使機(jī)體抗腫瘤免疫功能減弱，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞容易逃避細(xì)胞免疫的監(jiān)視，進(jìn)而加速腫瘤的進(jìn)展[12，14-15]。Th17細(xì)胞能夠特異性地分泌IL-17，而IL-17可以激活活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肺癌血管形成[17]；能夠誘導(dǎo)結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）表達(dá)，促進(jìn)肺癌侵襲與轉(zhuǎn)移[18]。Treg細(xì)胞能夠抑制正常的抗腫瘤功能，與肺癌患者分期與進(jìn)展相關(guān)[19]。通過抑制CD4+和CD8+ T細(xì)胞的活化、增殖，分泌顆粒酶、穿孔素殺傷效應(yīng)細(xì)胞，介導(dǎo)腫瘤的免疫耐受[10，20]。

已有研究[5-6]顯示，RFA術(shù)可使肺癌的外周血CD4+ T細(xì)胞升高，進(jìn)而改善細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能。本研究結(jié)果顯示，RFA術(shù)后CD4+ T細(xì)胞亞群的變化表現(xiàn)為Th1水平及Th1/Th2比值較術(shù)前升高，Th2、Th17、Treg細(xì)胞水平較術(shù)前降低。Th1水平及Th1/Th2值較術(shù)前升高有助于糾正Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡，增強Th1的抗腫瘤免疫功能；Th17細(xì)胞水平降低，IL-17分泌減少，可減弱IL-17對肺癌血管促生長及肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移作用。RFA術(shù)后外周血Treg細(xì)胞降低，有助于減弱Treg細(xì)胞對腫瘤患者免疫功能的負(fù)調(diào)節(jié)作用，改善抗腫瘤免疫功能。

綜上所述，RFA術(shù)利用高溫?fù)p毀局部腫瘤，可使其完全滅活，在一定時間內(nèi)又能夠改善機(jī)體的抗腫瘤免疫功能。其能否對遠(yuǎn)期效應(yīng)產(chǎn)生影響，尚需大樣本、多中心研究，而RFA引起淋巴細(xì)胞變化的機(jī)制也需更深入地研究。

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