張朋艷，于　雪，姚建亭，段德麟

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海帶磷酸甘露糖變位酶（PMM）基因的克隆與表達分析

張朋艷1，2，3，于雪1，2，3，姚建亭1，2，段德麟1，2

（1.中國科學院海洋研究所實驗海洋生物學重點實驗室，山東 青島 266071； 2.青島海洋科學與技術國家實驗室實驗海洋生物學與生物技術實驗室，山東 青島 266071； 3.中國科學院大學，北京 100049）

摘要：磷酸甘露糖變位酶（PMM）是褐藻膠和巖藻聚糖合成過程中的關鍵酶之一。本研究利用cDNA末端快速克?。≧ACE）技術，獲得2條海帶PMM基因（Sjpmm1，Sjpmm2）序列。其中，Sjpmm1的開放閱讀框（ORF）長 759 bp，其編碼的SjPMM1為鹵酸脫鹵酶（HAD）超家族成員，含 252個氨基酸，分子量約為28.51 kDa； 而Sjpmm2的 ORF長1866 bp，其編碼的SjPMM2屬于磷酸己糖變位酶超家族的成員，含621個氨基酸，分子量約為66.49 kDa。海帶PMM的二級結構均以α-螺旋為主。進化分析表明，Sjpmm1來自于原始真核生物，而 Sjpmm2來源于質體的第一次內(nèi)共生作用。實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，海帶受到高溫或低溫脅迫時，Sjpmm1和 Sjpmm2轉錄水平上升，以合成巖藻聚糖抵抗環(huán)境影響。此外，利用pMAL-c5X載體對SjPMM1進行體外表達，得到高濃度的可溶性融合蛋白，為后續(xù)的SjPMM功能分析提供基礎。

關鍵詞：海帶； 磷酸甘露糖變位酶； 巖藻聚糖； 褐藻膠； 實時定量PCR分析

［Foundation： National Key Technology Research and Development Program（2013BAB01B01）； Ocean Public Welfare Scientific Research Project（201405040）］

海帶（Saccharina japonica）是一種冷溫水性潮下帶褐藻，原產(chǎn)于日本海沿岸，自 1927年引入中國，通過不斷地馴化與適應，逐漸適應了中國的淺海環(huán)境，目前，已成為中國海藻養(yǎng)殖最主要品種［1］。中國海帶年產(chǎn)量約為490萬噸（鮮質量），約占世界總產(chǎn)量86%（FAO，2012）。海帶含有褐藻膠、巖藻聚糖等代謝產(chǎn)物，可廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域［2］。目前，有關海帶褐藻膠、巖藻聚糖的代謝機制尚未得到全面了解，因此，解析其褐藻膠、巖藻聚糖合成途徑中關鍵酶具有重要意義。

磷酸甘露糖變位酶（phosphomannomutase，PMM）是海帶碳代謝過程中的一種關鍵酶，在Mg2+及甘露糖-1，6-二磷酸作用下，可催化甘露糖-6-磷酸向甘露糖-1-磷酸方向轉化。其催化產(chǎn)物可被進一步催化生成 GDP-甘露糖，參與褐藻膠和巖藻聚糖的合成，維持細胞結構的完整性并參與細胞對外界環(huán)境的應答［3］。在細菌及各類真核生物中，PMM還參與細胞壁多糖［4］、抗壞血酸［5］以及糖基化蛋白和脂質的寡糖中心的合成［6］。

PMM 基因在某些真核生物中對溫度誘導的適應性調(diào)節(jié)起重要作用［7］。酵母PMM突變株能夠增強酵母對溫度的敏感性，使其無法在 37℃條件下生存［8］。Hoeberichts等［9］也發(fā)現(xiàn)擬南芥中PMM功能的缺失突變株能夠增強其在高溫下對氧化脅迫的敏感性，并提高死亡率。雖然藻類領域對PMM基因的研究有報道［3，10］，但對PMM基因數(shù)目、來源及其對環(huán)境的響應與適應依然缺乏全面的了解。而人類、細菌等的PMM晶體結構的解析為分析海帶中PMM酶的結構提供了依據(jù)［11-12］。

本研究針對海帶中褐藻膠和巖藻聚糖合成過程中的關鍵酶之一 ——PMM進行了克隆與分析，通過對序列的結構、進化分析，以及溫度誘導下轉錄水平的差異分析驗證該基因的特征與功能，為解析海帶褐藻膠、巖藻聚糖的合成途徑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

海帶幼孢子體（中科2號，長15～20 cm）采自于山東榮成高綠水產(chǎn)養(yǎng)殖公司的海帶養(yǎng)殖筏架。將采集的海帶用無菌海水沖洗3遍，然后于培養(yǎng)箱黑暗條件下培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)溫度為10℃。次日將其置于光照為50 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)6 h后，再分別置于不同溫度（5、10、15、20、25、30℃）下培養(yǎng)2 h，分別取出3棵海帶，液氮冷凍保存，用于后續(xù)的RNA制備。

RNA提取試劑盒（RNeasy Plant Mini Kit ）購自Qiagen公司； cDNA合成試劑盒（PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、3′- cDNA末端快速克?。?′-RACE）試劑盒（3′-Full RACE Core Set Ver.2.0）、pMD19-T Simple Vector 購自 TaKaRa公司； 5′-cDNA末端快速克?。?′-RACE）試劑盒（SMARTer RACE cDNA Amplification Kit）購自Clontech公司；pMAL-c5X 質粒、克隆感受態(tài)細胞（DH5α）、NEB 表達用大腸桿菌感受態(tài)細胞均由實驗室保存。

1.2實驗方法

1.2.1cDNA的合成

按照Qiagen試劑說明提取海帶總RNA，通過分光光度計檢測其質量，選取高純度的 RNA（OD260/280為 1.8～2.1）用于后續(xù) cDNA的合成。全長擴增所用cDNA按照TaKaRa單鏈cDNA合成說明書方法進行。5′-RACE及3′-RACE所用cDNA也按照相應的試劑盒說明書要求分別合成。

1.2.2海帶 PMM1基因（Sjpmm1）和 PMM2基因（Sjpmm2）的擴增

根據(jù)本研究組前期完成的海帶轉錄數(shù)據(jù)信息（注冊號GSE33853）［13］，設計3′-RACE特異引物（PMM1-3O、PMM1-3I、PMM2-3O、PMM2-3I）和 5′-RACE特異引物（PMM1-5O、PMM1-5I、PMM2-5O1、PMM2-5I1、PMM2-5O2、PMM2-5I2）（表 1）。按照RACE 擴增體系及要求，采用LA Taq DNA聚合酶，進行3′-RACE套式PCR反應，同時采用HiFi高保真DNA聚合酶進行5′-RACE巢式PCR反應。將所獲得的片段進行回收，連接于 pMD19-T載體上，轉化至大腸桿菌（DH5α）中，挑選PCR檢測為陽性的克隆送至上海生物工程有限公司進行測序。

1.2.3序列分析及比對

通過BLAST比對分析，將RACE得到的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫相關序列進行比對，選擇候選海帶PMM基因片段序列，利用 BioEdit軟件將其與已知序列進行拼接。使用 ORF finder軟件預測 Sjpmm1 和Sjpmm2的cDNA序列的開放閱讀框（ORF），并將其 ORF序列翻譯為氨基酸序列。利用 ProtParam［14］預測其分子量和等電點（PI）。利用SOPMA［15］對海帶PMM1和PMM2（SjPMM1和SjPMM2）的二級結構進行預測，并利用DNAman 6.0軟件將兩個SjPMM分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的3種PMM的氨基酸序列進行多重序列比對，預測這2種SjPMM的結構與功能。

表1　海帶PMM基因擴增及實時定量分析所用引物信息Tab.1　Primer sequences used in the amplification and real-time PCR analysis of Sjpmm

為了比較與其他物種 PMM 的進化關系，在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得 21個其他物種的 PMM氨基酸序列，使用MEGA 6.0軟件將其與海帶的PMM氨基酸序列進行比對，選用鄰接法（NJ）設置重復1000次，構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4實時定量PCR分析

為了研究溫度刺激對Sjpmm1和Sjpmm2轉錄情況的影響。選擇β-Actin為內(nèi)參基因，以qPMM1-F、qPMM1-R和qPMM2-F、qPMM2-R為引物（表1），對Sjpmm進行定量分析。所用的聚合酶為SYBR Premix Ex Taq II酶，擴增程序為： 94℃預變性30 s； 94℃變性5 s，55℃復性10 s，72℃延伸20 s，45個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算相對定量結果，并利用 SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.2.5SjPMM1的體外原核重組表達

1.2.5.1Sjpmm1的ORF序列擴增

通過WatCut分析軟件，對Sjpmm1的ORF進行分析，選擇NdeI和EcoRI作為雙酶切位點，設計全長擴增引物PMM1-F和 PMM1-R（表1）。以總cDNA為模板，LA Taq DNA聚合酶擴增Sjpmm1的ORF序列。反應條件：94℃預變性10 min； 94℃變性30 s，58℃復性30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)； 72℃延伸7 min。將純化的目的序列連接至 pMD19-T載體中并轉化大腸桿菌（DH5α），對PCR檢測陽性的克隆進行測序驗證。

1.2.5.2表達載體的構建

使用NdeI和EcoRI兩種酶對pMAL-c5X載體和提取的重組質粒pMD19-T/SjPMM1進行雙酶切，電泳檢測酶切產(chǎn)物并回收pMAL-c5X載體和SjPMM1基因。用T4-DNA連接酶連接回收產(chǎn)物并轉化NEB表達用大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆，經(jīng)PCR檢測、測序驗證后用于SjPMM1的體外表達。

1.2.5.3SjPMM1的誘導與表達

取適量菌液移入含有氨芐青霉素的LB液體（4 mL）培養(yǎng)過夜，分別取2 mL菌液至含200 mL 高營養(yǎng)培養(yǎng)基（含葡萄糖和氨芐青霉素）中，在 37℃水浴中培養(yǎng)，160 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6時，分別加入 0、0.3 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），誘導表達2 h。同時以0、0.3 mmol/L IPTG誘導只含pMAL-c5X載體的NEB大腸桿菌表達細胞中，其編碼1個約42.5 kDa的MBP標簽蛋白。誘導結束取適量菌液于4000 r/mim離心20 min，收集沉淀，用于后續(xù)SDS-PAGE檢測分析。

圖1　RACE擴增產(chǎn)物電泳檢測Fig.1　Electrophoresis of RACE products

A： Sjpmm1檢測結果，其中1和2分別代表5′和3′-RACE擴增結果； B： Sjpmm2擴增結果，1～3分別表示第一輪5′-RACE結果、第二輪5′-RACE結果、3′-RACE結果

A： 1～2，5′-RACE and 3′-RACE products for Sjpmm1；B： Detection of Sjpmm2； 1～3 represent the products of the first 5′-RACE and the second 5′- and 3′-RACE，respectively

2　實驗結果

2.1Sjpmm1和Sjpmm2的獲得

取5 μL的Sjpmm1的5′-RACE和3′-RACE擴增產(chǎn)物，進行凝膠電泳檢測均顯示明顯條帶（圖 1A），測序分別得到458 bp和1391 bp的序列。對Sjpmm2擴增也分別得到424 bp和1698 bp序列，在該序列信息的基礎上，對Sjpmm2進行再次5′-RACE擴增，得到189 bp的5′端序列（圖1B）。其中3′-RACE擴增得到的序列3′末端含有明顯的AATAA加尾信號序列和polyA結構。

2.2序列分析

通過序列拼接得到2條Sjpmm的cDNA序列。其中Sjpmm1（GenBank： AIW04131.1）的cDNA全長1559 bp，5′-非翻譯區(qū)（5′-UTR）長47 bp，ORF長759 bp，3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）長753 bp。經(jīng)預測，其編碼一個含252個氨基酸，分子量約為28.51 kDa，等電點為4.89。BLAST比對分析表明其與已知PMM序列對比，SjPMM1與假微型海鏈藻CCMP1335（GenBank：EED92893.1）、 小 麥 屬（GenBank： AFV92896.1、ACV41082.1 等）、毛果楊（GenBank： ERP53127.1）的PMM 氨基酸序列同源區(qū)域的相似性達到 83%～85%，而與長囊水云的一個未注釋蛋白（GenBank： CBJ32201.1）相似性達到 95%，初步推測也可能屬于長囊水云的PMM 候選基因。Sjpmm2（GenBank： KP772272）的cDNA全長2639 bp，5′-UTR長25 bp，ORF長1866 bp，3′-UTR長748 bp，其編碼621個氨基酸，分子量約為66.49 kDa，等電點為 5.32。同源比對分析表明SjPMM2與長囊水云（GenBank： CBJ29496.1）、假魚腥藻（GenBank： AFY68962.1）、層生管孢藻（GenBank：AFY96193.1）的PMM氨基酸序列同源區(qū)域的相似性分別為77%、64%、64%。

蛋白的二級結構預測結果表明，SjPMM1的二級結構包括α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-折疊、β-轉角，它們的比例分別為41.67%、28.57%、22.22%、7.54%；SjPMM2的二級結構包括 α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-折疊、β-轉角，其比例分別為 40.74%、28.18%、19.81%、11.27%。

SjPMM1與長囊水云（GenBank： CBJ32201.1）、一粒小麥（GenBank： AFW03829.1）、人類（GenBank：NP_002667.2）的同源序列比對分析表明，其一致性為73.39%，且都含有HAD超家族的3個保守的motif： motif I，DXDXTLX； motif II，XXSX； motif III，K-［G/S］［D/S］XXX［D/N］（圖2）。SjPMM2與長囊 水云（GenBank： CBJ29496.1）、 假 魚 腥 藻（GenBank： AFY68962.1）、綠膿桿菌（GenBank：AAG08707.1）的序列一致性為 46.02%，都含有 α-磷酸己糖變位酶超家族的4個保守motif： motif I，TXSHXP； motif II，DXDXDR； motif III，XEXS；motif IV，XRXS（圖3）。

圖2　SjPMM1多序列比對Fig.2　The alignment of SjPMM1 with PMM from other species

2.3系統(tǒng)進化分析

基于所獲得的PMM序列，作者構建了系統(tǒng)進化樹（圖4）。從中可看到，PMM序列可明顯地分為2個分支，而SjPMM1和SjPMM2分別位于不同的分支中。其中SjPMM1所在分支包含高等動植物、真菌以及各種藻類，覆蓋了大部分物種，而SjPMM2所在分支僅包括藍藻、細菌、古菌、紅藻及褐藻，這說明，這 2種SjPMM基因可能具有不同的起源。

2.4溫度對海帶pmm轉錄的影響

在10℃處理條件下，海帶Sjpmm1和Sjpmm2轉錄水平最低，隨溫度升高或者降低，其轉錄水平都表現(xiàn)逐步上升（圖5）。與10℃時相比，Sjpmm1的轉錄水平在 5、15、20和 25℃時均顯著升高（P<0.05），Sjpmm2的轉錄水平在 5、20和 25℃時均顯著升高（P<0.05）。

圖3　SjPMM2多序列比對Fig.3　The alignment of SjPMM2 with PMM from other species

圖4　基于PMM氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4　Polygenetic tree based on the amino acid sequence of PMM

圖5　溫度對Sjpmm轉錄的影響Fig.5　The effects of temperature on the transcription of Sjpmm

A： Sjpmm1轉錄水平； B： Sjpmm2轉錄水平

A： Transcription of Sjpmm1； B： Transcription of Sjpmm2

2.5SjPMM1的體外原核表達

瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)對Sjpmm1 ORF的擴增得到單一條帶，其大小與預期的 759 bp一致（圖6A）。對pMD19-T/SjPMM1和pMAL-c5X載體的雙酶切也成功得到了帶黏性末端的 Sjpmm1和線性pMAL序列（圖6B）。體外表達表明，其與未誘導組相比，誘導的細胞能成功表達出約為70 kDa的融合蛋白MBP/SjPMM1，這與預期的分子量71.01 kDa相吻合（圖7）。

3　討論

海帶中可能存在2個長度與結構不同的PMM基因。其中，Sjpmm1編碼的蛋白含252個氨基酸，與大部分真核生物中的PMM長度相似，屬于HAD超家族的成員。HAD超家族主要包括葡萄糖磷酸變位酶、磷酸酯酶、磷酸絲氨酸磷酸酶等，均含有4個保守的motif，其中motif I中的第一個天冬氨酸可作為親核劑進攻底物的磷酸基團［16］，motif II為活性位點，其中的絲氨酸殘基通過氫鍵結合到底物的磷酸基團［17］，motif III參與ASP親核劑對底物磷酸基團的定向，并結合Mg2+離子［11］。而Sjpmm2編碼的蛋白長621個氨基酸，該長度的PMM僅存在于少數(shù)物種中，屬于α-磷酸己糖變位酶超家族的成員，該家族中保守的motif I中的絲氨酸殘基為活性中心的磷酸化位點，motif II則作為金屬結合環(huán)連接Mg2+離子，motif III為糖結合位點，決定著酶對底物的特異性結合，motif IV中以精氨酸為關鍵位點對維持磷酸化后構想的穩(wěn)定起重要作用［12，18］。雖然Sjpmm1和Sjpmm2隸屬于不同的超家族，但它們同時具有絲氨酸催化中心以及金屬離子結合位點等磷酸變位酶特征性結構域，反映出它們都為海帶PMM基因。

圖6　Sjpmm1 ORF擴增及雙酶切電泳檢測Fig.6　Electrophoresis analysis of Sjpmm1 amplification and digestion

圖7　融合蛋白MBP/SjPMM1的SDS-PAGE分析Fig.7　SDS-PAGE of the fusion protein MBP/SjPMM1

系統(tǒng)進化分析表明，海帶中存在的兩個 PMM基因在進化上具有不同的地位，其中，Sjpmm1所在分支包含物種廣泛，可能來自于最古老的真核生物； 而Sjpmm2所在分支僅包含少數(shù)物種，其中藍藻與褐藻親緣關系較近，作者推測其可能來自于質體的一次內(nèi)共生作用，即最原始的真核生物吞噬藍藻獲得。分析還發(fā)現(xiàn)，較原始的單細胞紅藻 Cyanidioschyzon merolae中也存在2種PMM基因，其分別位于這兩個進化支上，這從另一方面支持了作者對海帶PMM起源的推測。

自然條件下，海帶適宜生長溫度為10～15℃，當溫度過高或過低，均會對海帶產(chǎn)生生理脅迫，引起海帶體內(nèi)物質含量的變化［19］。本研究發(fā)現(xiàn)海帶中的PMM基因在10℃時表達量最低，而溫度升高或降低均會誘導其大量表達，因為巖藻聚糖具有抗氧化、抗菌等活性［20］，作者推測海帶可以通過增加 PMM 等酶的表達來加速巖藻聚糖的合成，減少環(huán)境脅迫對藻體的損傷。

大部分PMM是雙功能的變位酶，兼具葡萄糖磷酸變位酶活性，且 2種活性差別明顯。為了對海帶PMM的功能進行解析，作者還對SjPMM1進行了體外融合性表達，將其連接入 pMAL-c5X載體中，成功得到了可溶性的 MBP/SjPMM1蛋白，濃度較高，適于進行后續(xù)的功能驗證。但由于尚未獲得純化的重組蛋白，暫時未對其酶學特征進行深入分析，有待后續(xù)深入探討，完善海帶中PMM動力學特性分析。

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ZHANG Peng-yan1，2，3，YU Xue1，2，3，YAO Jian-ting1，2，DUAN De-lin1，2

（1.Key Laboratory of Experimental Marine Biology，Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266071，China； 2.Laboratory for Marine Biology and Biotechnology，Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Qingdao 266071，China； 3.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Received: Jan.13，2015

（本文編輯： 張培新）

Cloning and expression of phosphomannomutase from Saccharina japonica（Laminariales，Phaeophyceae）

Key words:Saccharina japonica； phosphomannomutase； fucoidan； alginate； real-time PCR analysis

Abstract:Phosphomannomutase（PMM）is an important enzyme involved in the synthesis of fucoidan and alginate.Two PMM genes of Saccharina japonica（Sjpmm1 and Sjpmm2）were cloned by rapid-amplification of cDNA ends（RACE）.The open reading frame（ORF）length of Sjpmm1 is 759 bp，encoding 252 amino acids（SjPMM1）with a molecular weight（MW）of 28.51 kDa which belongs to the haloacid dehalogenase（HAD）superfamily.While the ORF length of Sjpmm2 is 1866 bp，encoding 621 amino acids（SjPMM2）with a MW of 66.49 kDa which belongs to the phosphohexomutase superfamily.The α-helix is the major secondary structure for both SjPMM1 and SjPMM2.The phylogenetic analysis showed that Sjpmm1 evolved from ancient eukaryotes，while Sjpmm2 originated from primary endosymbiosis.In addition，real-time PCR analysis indicated that temperature could increase the transcriptional level of Sjpmm，which may lead to the upregulation of fucoidan.Furthermore，a high concentration of the SjPMM1 fusion protein was expressed with the pMAL-c5X vector，contributing to the further function studies.

中圖分類號：X55

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3096（2016）03-0032-08

doi：10.11759/hykx20150113001

收稿日期：2015-01-13； 修回日期： 2015-03-10

基金項目：國家科技支撐計劃項目（2013BAB01B01）； 國家海洋公益性行業(yè)科研專項（201405040）

作者簡介：張朋艷（1989-），女，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事海洋生物學研究，電話，0532-82898554，E-mail： zhangpengyan3249@ 126.com； 段德麟，通信作者，研究員，電話，0532-82898556，E-mail：dlduan@qdio.ac.cn