張藝齡， 張 振， 陳向東

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院皮膚科，上海 200011)

?

·基礎(chǔ)研究·

微等離子體射頻技術(shù)對(duì)人體皮膚組織及相關(guān)因子的影響

張藝齡， 張 振， 陳向東

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院皮膚科，上海 200011)

目的 探討微等離子體射頻技術(shù)治療凹陷性瘢痕及面部年輕化的可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法 使用相同治療參數(shù)的微等離子體射頻技術(shù)分別照射受試者的左背部皮膚，在術(shù)后即刻和術(shù)后1、3、5、7、14、28、90、180d，于照射區(qū)域及非照射區(qū)域分別取皮膚活檢，對(duì)活檢的皮膚標(biāo)本分別作H-E染色，Masson三色染色，Ⅰ型及Ⅲ型膠原、VEGF、熱休克蛋白70(heat shock proteins 70， HSP70)免疫組化染色。結(jié)果 微等離子體作用于皮膚后產(chǎn)生不連續(xù)分布的熱氣化區(qū)。照射后5d膠原纖維開始增多，并持續(xù)至照射后180d。照射后即刻，VEGF就開始高表達(dá)，并維持28d左右。照射3d后，HSP70就開始增加，主要表達(dá)在表皮和真皮淺層，7d到達(dá)高峰，并維持90d。結(jié)論 微等離子體射頻作用于人體皮膚組織可以刺激人皮膚真膠原纖維和彈力纖維增生，并且持續(xù)時(shí)間可達(dá)半年。

微等離子體； 膠原蛋白； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； 熱休克蛋白70

微等離子體技術(shù)是一種微創(chuàng)式剝脫性點(diǎn)陣模式新技術(shù)，臨床上主要應(yīng)用于痤瘡后凹陷性瘢痕和光老化性細(xì)紋，療效較為確切。微等離子體技術(shù)是由多點(diǎn)單極射頻在距離皮膚很微小的距離內(nèi)激發(fā)空氣中的氮?dú)夥肿?，并形成等離子放電，產(chǎn)生的電火花引起皮膚輕微的剝脫，其能量以點(diǎn)陣形式發(fā)射，形成“微剝脫區(qū)”，在皮膚上形成表皮至真皮上層可以控制的小孔；當(dāng)治療頭與皮膚接觸時(shí)，單極射頻的能量使真皮層受到高溫刺激，形成陣列樣排列的“熱損傷區(qū)”。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)微等離子體技術(shù)作用于人活體的組織病理研究，且對(duì)治療后真皮膠原含量的變化也沒有定量分析。故本研究進(jìn)行相關(guān)的測(cè)定，為臨床治療提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

健康蒙古利亞人種志愿者3名，年齡24～55歲。Fitzpatrick皮膚類型Ⅲ～Ⅳ型。排除孕婦、哺乳期、有增生性瘢痕及瘢痕疙瘩史、光敏性疾病、6個(gè)月內(nèi)服用過(guò)維A酸類藥物或接受過(guò)激光治療者、試驗(yàn)期有系統(tǒng)或局部感染者。

1.2 方法

1.2.1 微等離子體治療及取材 采用閃耀TM離子束射頻治療儀(以色列飛頓激光公司)，選擇左背部皮膚作為治療區(qū)域，相同光照條件下拍照。術(shù)前清水清潔治療區(qū)域皮膚，復(fù)方利多卡因乳膏(北京紫光制藥有限公司)封包1h麻醉，酒精清潔治療區(qū)域皮膚。治療模式采用滾輪頭，治療4遍，能量80W，釋放持續(xù)時(shí)間30s。術(shù)后創(chuàng)面避水3d。在治療后即刻，術(shù)后1、3、5、7、14、28、90、180d分別在照射部位和非照射部位取活檢。

1.2.2 標(biāo)本處理 取得的活檢標(biāo)本立刻放入0.1mol/L 磷酸酸鹽緩沖的10%甲醛溶液，固定24h。固定后的標(biāo)本脫水，石蠟包埋切片。切片后分別進(jìn)行H-E染色，Masson三色染色，Ⅰ型及Ⅲ型膠原、VEGF、熱休克蛋白70免疫組化染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 微等離子體照射后膠原纖維變化

H-E染色結(jié)果顯示，熱氣化區(qū)寬而淺，并環(huán)繞以相應(yīng)的熱凝固區(qū)。照射3d后，表皮完全復(fù)上皮化。照射7d后，開始痂皮脫落。通過(guò)H-E常規(guī)染色、Masson三色膠原特殊染色可以發(fā)現(xiàn)，皮膚在未照射微等離子體時(shí)，真皮淺層膠原纖維稀疏，纖細(xì)，真皮深層膠原纖維分布紊亂，不規(guī)則。照射后1、3、5、7、14d后，真皮膠原未見明顯變化。照射28d后，淺層膠原纖維變粗，真皮深層膠原纖維排列整齊，粗大。膠原在真皮全層均有增強(qiáng)，表現(xiàn)為新生的膠原重排，膠原纖維的走行方向與表皮大體平行，真皮淺層的膠原沉積增多。免疫組織化學(xué)染色(棕黃色為染色陽(yáng)性)的結(jié)果與H-E常規(guī)染色結(jié)果大致符合。Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化染色結(jié)果顯示，照射5d后，Ⅲ型膠原就染色開始增強(qiáng)，尤其以真皮淺層增強(qiáng)明顯。Ⅰ型膠原免疫組化染色結(jié)果顯示，照射28d后，Ⅰ型膠原染色明顯增強(qiáng)，真皮淺層及深層染色均增強(qiáng)，并于90d到達(dá)峰值，與未照射組相比差異顯著(P<0.05)，見圖1。

2.2 微等離子體照射后VEGF的動(dòng)態(tài)變化

免疫組化顯示，對(duì)照組VEGF弱表達(dá)。在照射4h后即可觀察到皮膚表皮和真皮淺層VEGF表達(dá)增加。照射3、5、7、14、28d后，VEGF表達(dá)繼續(xù)增加。此后VEGF表達(dá)下降。照射90d后，VEGF表達(dá)下降到與對(duì)照組類似，此后VEGF表達(dá)基本無(wú)太大的變化，見表1。

2.3 微等離子體照射皮膚HSP70的動(dòng)態(tài)變化

免疫組化顯示，對(duì)照組HSP70呈弱陽(yáng)性。微等離子體照射皮膚3d后，HSP70的表達(dá)開始上調(diào)。此后HSP70進(jìn)一步增強(qiáng)。照射7d后達(dá)到高峰，此后HSP70表達(dá)下降，照射90d后才降到基礎(chǔ)值，見表1。

圖1 微等離子體照射后Masson三色膠原特殊染色及Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化染色Fig.1 Masson staining and typeⅠand Ⅲ collagen immunohistochemical staining after irradiation of microplasma radiofrequency

表1 微等離子體照射后Ⅰ、Ⅲ型膠原、VEGF、HSP70的動(dòng)態(tài)變化

指標(biāo)未照射區(qū)照射區(qū)即刻1d3d5d7d14d28d90d180dⅠ型膠原0.074±0.0110.068±0.0050.075±0.0110.063±0.0140.058±0.0130.067±0.0080.058±0.0050.093±0.0140.109±0.0070.141±0.016Ⅲ型膠原0.047±0.0090.048±0.0100.052±0.0090.059±0.0060.062±0.0100.064±0.0120.070±0.0100.072±0.0100.081±0.0120.083±0.013VEGF0.088±0.0100.199±0.0400.223±0.0520.196±0.0480.204±0.0600.194±0.0300.218±0.0360.158±0.0160.086±0.0170.095±0.010HSP700.069±0.0040.070±0.0050.073±0.0070.116±0.0100.127±0.0220.126±0.0240.105±0.0080.111±0.0070.085±0.0070.075±0.005

3 討 論

2005年，等離子體治療儀應(yīng)用于皮膚外科，其通過(guò)氮?dú)獾入x子體高溫?zé)贫枪饣蛏漕l能量傳遞進(jìn)行治療。微等離子體技術(shù)是新近才開發(fā)出來(lái)的一種微創(chuàng)燒灼性技術(shù)，它利用多點(diǎn)單極射頻，將設(shè)備的手具與皮膚之間的空氣中的氮?dú)夥肿咏怆x為氣態(tài)的電子和光子，即所謂等離子化，引起皮膚輕微的剝脫，在皮膚上形成表皮和真皮淺層可以控制的點(diǎn)陣形式的微小穿孔，形成“微剝脫區(qū)”[1]。目前，臨床上微等離子體治療細(xì)紋和痤瘡后凹陷性瘢痕的效果較確切[2-3]，但治療的組織學(xué)變化和內(nèi)在機(jī)制卻不完全清楚。

本研究顯示，微等離子體照射后即刻，表皮和真皮淺層出現(xiàn)非連續(xù)性氣化區(qū)和熱凝固區(qū)。Ⅲ型膠原在照射5d后開始明顯增加，Ⅰ 型膠原在照射30d后開始明顯增加，與臨床療效較為符合。推測(cè)膠原增加的原因可能為微等離子體對(duì)皮膚表皮的真皮淺層形成熱損傷，引起機(jī)體的創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制，刺激膠原纖維增生。

此外，Ⅲ型膠原的增加是持續(xù)的，在觀察終點(diǎn)，即術(shù)后180d發(fā)現(xiàn)Ⅲ型膠原仍然比未照射區(qū)的含量明顯增加，與創(chuàng)傷愈合早期Ⅲ型膠原含量增多，隨著時(shí)間推移其含量逐漸恢復(fù)正常的傳統(tǒng)觀點(diǎn)不符。本研究推測(cè)其可能的原因是微等離子體造成的創(chuàng)傷與一般的創(chuàng)傷不同，模式是微小而持續(xù)的，這樣可以持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生新的膠原。

本研究首次觀察了微等離子體作用于人體皮膚后膠原增生的時(shí)間變化規(guī)律，為微等離子體技術(shù)的臨床治療提供了重要的幫助。本研究顯示，照射180d后，真皮的膠原纖維含量達(dá)到最大值，即在治療后半年，微等離子體技術(shù)的膠原重排和增生作用才達(dá)到最優(yōu)結(jié)果。目前，臨床上該技術(shù)治療痤瘡后凹陷性瘢痕的治療間隔一般為1～3個(gè)月，只是臨床上的經(jīng)驗(yàn)值，沒有明確的組織病理學(xué)支持。本研究提示，微等離子體技術(shù)的臨床治療間隔時(shí)間半年更為合理。

微等離子體技術(shù)可能通過(guò)熱損傷激活皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程來(lái)達(dá)到刺激真皮膠原增生的作用。熱誘導(dǎo)的創(chuàng)傷修復(fù)可能涉及多種因子。越來(lái)越多的研究[4-5]表明，VEGF在增生期可能有助于傷口的愈合與組織修復(fù)。VEGF促進(jìn)傷口愈合通過(guò)多種機(jī)制，包括膠原蛋白的沉積，血管生成等。本研究觀察了VEGF在傷口愈合的不同階段的動(dòng)態(tài)變化。在微等離子體作用于皮膚1h后即可觀察到VEGF水平明顯高于對(duì)照組。此后VEGF的表達(dá)逐漸升高，照射28d后到達(dá)峰值。從理論上講，VEGF誘導(dǎo)的血管舒張和血管通透性增加發(fā)生允許氧氣和葡萄糖運(yùn)送和沉積在傷口附近，可以認(rèn)為VEGF可作為一種有效的血管擴(kuò)張劑。本研究證實(shí)微等離子體技術(shù)引起的傷口愈合的早期階段中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的作用。從成纖維細(xì)胞釋放VEGF是缺氧依賴性的。在熱損傷導(dǎo)致傷口愈合的重塑階段，VEGF對(duì)膠原蛋白的直接影響仍有待確定。在本研究中，膠原蛋白均有顯著增加，Ⅰ型膠原蛋白從照射28d后表達(dá)上調(diào)，Ⅲ型膠原蛋白從照射5d后表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在創(chuàng)傷修復(fù)早期表達(dá)上調(diào)，與Ⅲ型膠原蛋白早期即可上調(diào)相吻合。因此，本研究推斷Ⅲ型膠原蛋白的上調(diào)可能與VEGF有關(guān)。VEGF對(duì)傷口愈合中后期階段的細(xì)胞外基質(zhì)和瘢痕形成的影響，仍有進(jìn)一步研究的需要。

熱休克蛋白是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)最豐富的蛋白質(zhì)之一，但是它們是在正常生理?xiàng)l件下低水平表達(dá)。只有在應(yīng)對(duì)各種壓力的情況下熱休克蛋白才明顯上調(diào)。熱休克蛋白的功能主要是作為分子伴侶促進(jìn)其他細(xì)胞蛋白質(zhì)的折疊，防止蛋白聚集，或誘發(fā)不當(dāng)折疊的蛋白質(zhì)降解。創(chuàng)傷誘導(dǎo)的熱休克蛋白主要在表皮中上調(diào)。傷口中含有豐富的HSP蛋白通過(guò)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡和細(xì)胞的存活，來(lái)促進(jìn)傷口愈合[6]。其中HSP70是HSP家族較重要的一族。HSP70的過(guò)表達(dá)增加成纖維細(xì)胞的生存及減少氧化損傷并抑制炎癥反應(yīng)。

在本研究中，熱休克蛋白在微等離子體照射皮膚3d后表達(dá)增加，主要表達(dá)于表皮和真皮淺層，此后HSP70信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)，照射7d后達(dá)到峰值，此后陽(yáng)性反應(yīng)逐漸降低，但是仍然高于未照射時(shí)，并持續(xù)約90d。本研究結(jié)果表明： HSP70在微等離子體技術(shù)照射皮膚后的全程均有作用。HSP70可以促進(jìn)新生成的膠原蛋白的正確折疊，抑制真皮成纖維細(xì)胞的凋亡等。因此，微等離子體技術(shù)作用于人體皮膚后，HSP70可能是其中較重要的一個(gè)分子機(jī)制。本研究對(duì)微等離子體技術(shù)作用于人體皮膚后的HSP70的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了觀察，為微等離子體技術(shù)的治療提供了重要的理論依據(jù)。但是其治療還有許多其他分子參與，有待于進(jìn)一步研究。

[1] Halachmi S， Orenstein A， Meneghel T， et al. A novel fractional micro-plasma radio-frequency technology for the treatment of facial scars and rhytids： a pilot study[J]. J Cosmet Laser Ther， 2010，12(5)： 208-212.

[2] 陸雯麗，張振，費(fèi)燁,等.微等離子體與超脈沖CO2點(diǎn)陣激光治療痤瘡凹陷性瘢痕的對(duì)比研究[J].中華皮膚科雜志，2012，45(3)： 165-168.

[3] 劉鶴，楊時(shí)昕.微等離子體射頻技術(shù)聯(lián)合長(zhǎng)脈沖 1064nm Nd： YAG激光治療增生性瘢痕的臨床研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，10： 15-17.

[4] Asadi MR， Torkaman G, Hedayati M. Effect of sensory and motor electrical stimulation in vascular endothelial growth factor expression of muscle and skin in full-thickness wound[J]. J Rehabil Res Dev， 2011，48(3)： 195-201.

[5] Spanholtz， TA， Theodorou P， Holzbach T， et al. Vascular endothelial growth factor(VEGF 165) plus basic fibroblast growth factor(bFGF) producing cells induce a mature and stable vascular network—a future therapy for ischemically challenged tissue[J]. J Surg Res， 2011，171(1)： 329-338.

[6] Wagstaff MJ， Shah M， McGrouther DA， et al. The heat shock proteins and plastic surgery[J]. J Plast， Reconstr Aesthet Surg， 2007，60(9)： 974-982.

Effects of microplasma radiofrequency technique on human skin tissue

ZHANGYi-ling，ZHANGZhen，CHENXiang-dong

(Dept. of Dermatology， Ninth People’s Hospital， Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200011， China)

Objective To investigate the effects of microplasma radiofrequency on human skin tissue. Methods Microplasma radiofrequency irradiation was performed on the left dorsal region of 3 healthy volunteers. Skin biopsies were taken from irradiated and non-irradiated regions immediately and 1， 3， 5， 7， 14， 28， 90， 180d after the treatment. H-E staining， Masson staining， and type Ⅰ/Ⅲ collagen， vascular endothelial growth factor(VEGF)， heat shock proteins 70(HSP70)immunohistochemical stainings were performed. Results The radiofrequency ablative zone was wide and shallow with thermal coagulation. Collagen fibers started to increase 5d after treatment and maintained until d180. The expression of VEGF was elevated right after the treatment and maintained about 30d. The expression of HSP70 was increased 3d after treatment， mainly in epidermis and papillary dermis； it reached to the peak on d7 and maintained about 90d， then decreased. Conclusion Microplasma radiofrequency can stimulate the long-term proliferation of collagen fibers and elastic fibers in human dermis. The study may provide a theoretical basis for microplasma radiofrequency technique in treatment of depressed scars.

microplasma； collagen； vascular endothelial growth factor； heat shock proteins 70

10.16118/j.1008-0392.2016.05.008

2016-01-15

張藝齡(1987—)，男，住院醫(yī)師，碩士.E-mail： xzyzzyl@163.com

陳向東.E-mail： xdchen@medmail.com.cn

R 751

A

1008-0392(2016)05-0040-04