魏夢丹, 陸 英, 曹月譽(yù)， 徐增光

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院科研部，上海 200120)

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·基礎(chǔ)研究·

EIF4G1對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的抑制作用

魏夢丹, 陸 英, 曹月譽(yù)， 徐增光

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院科研部，上海 200120)

目的 研究真核翻譯起始因子4γ1(eukaryotic translation initiation factor 4γ1，EIF4G1)對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞凋亡的抑制作用。方法 使用RNAi技術(shù)下調(diào)A549細(xì)胞內(nèi)EIF4G1的表達(dá)后，通過MTS法檢測細(xì)胞生長增殖，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡，采用蛋白質(zhì)印記(Western blot)技術(shù)檢測下調(diào)EIF4G1后對A549細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)影響。 結(jié)果 下調(diào)A549細(xì)胞內(nèi)EIF4G1的表達(dá)后，細(xì)胞生長受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡率也明顯增加(P<0.05)，且凋亡相關(guān)蛋白和對照組相比，F(xiàn)AS,P21和TRAF2的表達(dá)量明顯增高(P<0.05)。 結(jié)論 EIF4G1在A549細(xì)胞中表達(dá)降低后，凋亡相關(guān)蛋白FAS,P21和TRAF2的表達(dá)量升高，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

真核翻譯起始因子4γ1； 非小細(xì)胞肺腫瘤； 細(xì)胞凋亡

肺癌一直是世界范圍內(nèi)高死亡率的惡性腫瘤, 在我國居惡性腫瘤死因之首。肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer， SCLC)兩大類，其中NSCLC占所有肺癌病例的85% 以上[1]。只有15%～25%的NSCLC有手術(shù)治療的機(jī)會，即使接受根治性手術(shù)治療，仍然有50%的NSCLC患者會復(fù)發(fā)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中受到多種調(diào)節(jié)因子的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，真核翻譯起始因子4G1(eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1，EIF4G1)在NSCLC中過量表達(dá)[2]。該分子最早發(fā)現(xiàn)是作為轉(zhuǎn)錄起始因子復(fù)合物EIF4F的組成蛋白之一，最近研究表明，EIF4G1除了促進(jìn)蛋白翻譯外，也與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)[3-5]。

本研究將通過RNAi技術(shù)下調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549 中EIF4G1的表達(dá)后，觀察其對肺癌細(xì)胞的生長以及凋亡的影響，為明確EIF4G1在NSCLC發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人NSCLC A549由同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院中心實驗室和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺俞作仁教授課題組惠贈；培養(yǎng)基及主要試劑1640、含EDTA胰酶、胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)液均為Gibco公司產(chǎn)品；CellTiter-96?Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay檢測試劑盒購自Promega公司；Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物科技發(fā)展有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?RNAiMAX購自Invitrogen公司；所有siRNA均購自美國Invitrogen公司，分別根據(jù)說明書，取部分siRNA稀釋至 10μmol，分裝待用；Western-blot使用抗人EIF4G1、P21抗體購自abcam公司，抗人β-actin、Fas、TRAF2抗體購自Santa-Cruz公司；其他相關(guān)試劑購自威奧公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml的RPMI1640培養(yǎng)液中， 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞均貼壁生長，0.25%胰蛋白酶消化傳代，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

1.2.2 細(xì)胞SiRNA轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種六孔板，60%～80%左右融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用PBS沖洗2～3次后，加入Opti-MEM 培養(yǎng)液 1.7ml，分別于150μl Opti-MEM中加入9μl Lipofectamine?RNAiMAX配成A液，150μl Opti-MEM中加入3μl siRNA配成B液，按照1∶1比例混合A液和B液，充分混勻，室溫靜置5min。每孔加入300μl混合液，搖勻，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。分為3組： 實驗組siRNA-EIF4G1，對照組siRNA-control，空白對照組Blank，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.3 Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 實驗前24h進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，設(shè)立空白組、處理組及陰性對照組，后用不含EDTA胰酶消化細(xì)胞，分別收集各組細(xì)胞以及培液上清，離心半徑15cm，1000r/min,離心 5min 棄上清液。1xPBS洗細(xì)胞兩遍，棄上清液每管加 400μl Binding Buffer，5μl Annexin-V-FITC和5μl PI，混勻，避光孵育15min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。采用Cellquest軟件分析，F(xiàn)SC/SSC設(shè)門，結(jié)果以散點(diǎn)圖表示。

1.2.4 Western-blot法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后棄去培養(yǎng)液，用1xPBS輕輕洗兩次，加入適量2x細(xì)胞裂解液，充分裂解后，用細(xì)胞刮至1.5ml EP管，加熱至100℃10min，然后4℃離心機(jī)離心半徑15cm，10000r/min，離心5min，取上清液，用微量紫外分光光度計進(jìn)行蛋白定量后保存于-80℃冰箱備用。根據(jù)所需目的蛋白分子量大小分別配置不同濃度的分離膠，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%奶粉配制的封閉液室溫封閉2h，再用稀釋好的一抗(β-actin、EIF4G1、P21抗體1∶1000，F(xiàn)as、TRAF2抗體1∶500)4℃孵育過夜。TBST洗三次每次10min。二抗室溫避光孵育1h，TBST洗三次，每次10min。最后于ODYSSEY紅外成像系統(tǒng)上掃描。Image J軟件采集條帶灰度值，取目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值為相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后置于倒置顯微鏡下觀察： SiRNA-control組細(xì)胞貼壁生長且輪廓清楚，細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)清晰，折光性強(qiáng)且胞質(zhì)清亮，SiRNA-EIF4G1組貼壁細(xì)胞可見明顯減少，鏡下還可見周圍碎片明顯增多，漂浮細(xì)胞明顯增多，見圖1。

圖1 未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染SiRNA-EIF4G1后肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞圖Fig.1 Microscopic diagraph of untransfected and transfected A549 cells轉(zhuǎn)染組細(xì)胞可見明顯減少，死細(xì)胞增多

2.2 MTS實驗檢測轉(zhuǎn)染SiRNA-EIF4G1后對A549細(xì)胞生長的抑制作用

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24h 后將 10μl CellTiter-96?Aqueous單溶液試劑直接加入到培養(yǎng)孔中，孵育2～4h，然后在96孔板讀板儀上記錄490nm的吸光度D。在490nm測量的吸光度值與培養(yǎng)孔中活細(xì)胞的數(shù)量成正比，根據(jù)D統(tǒng)計細(xì)胞增殖情況，每組設(shè)五個復(fù)孔,見圖2。

如圖2所示，SiRNA-EIF4G1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長狀況與Blank組和SiRNA-NC組相比細(xì)胞增殖明顯減慢，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而Blank組和SiRNA-NC組相比較，細(xì)胞增殖情況變化不明顯(P>0.05)。

圖2 MTS檢測不同處理組A549細(xì)胞生長曲線，Si-EIF4G1組與另外兩組相比生長明顯抑制(P<0.05)Fig.2 Proliferation of A549 cells in different groups detected by MTS： cell growth was inhibited significantly in Si-EIF4G1 group, as compared with other groups(P<0.05)

2.3 Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測A549細(xì)胞凋亡

在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限(FITC-/PI-)顯示活細(xì)胞，右下象限(FITC+/PI-)顯示早期凋亡細(xì)胞，而右上象限(FITC+/PI+)是壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞，檢測結(jié)果以百分比表示。Blank組, SiRNA-EIF4G1組，SiRNA-NC組早期凋亡率分別為(1.26±2.60)%，(4.65±6.12)%，(3.88±3.52)%，Si-EIF4G1組與對照組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05)(圖3)。

2.4 Western-blot檢測下調(diào)EIF4G1在A549中的表達(dá)后對凋亡相關(guān)蛋白的影響

用SiRNA下調(diào)肺癌細(xì)胞A549中真核翻譯起始因子4γ1(EIF4G1)的表達(dá)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后(圖4)，EIF4G1在細(xì)胞內(nèi)的相對表達(dá)經(jīng)灰度分析發(fā)現(xiàn)： 對照組1.21±0.47，SiRNA-EIF4G1組0.76±0.30，Si-對照組1.11±0.49。SiRNA-EIF4G1組細(xì)胞內(nèi)EIF4G1蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。下調(diào)EIF4G1的A549細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白FAS，P21和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF-2)的表達(dá)和對照組相比均明顯升高,見表2、圖5，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptosis rate of A549 cells in different groups detected by flow cytometry右下象限代表早期凋亡細(xì)胞群，右上象限為死亡細(xì)胞群或晚期凋亡細(xì)胞群，Si-EIF4G1組與對照組相比，凋亡率明顯增高(P<0.05)

圖4 Western-blot檢測A549細(xì)胞中EIF4G1的蛋白表達(dá)量Fig.4 Western-blotting detection of EIF4G1 protein expression in A549 cells

圖5 Western-blot檢測不同處理組A549細(xì)胞中FAS,P21和TRAF-2蛋白表達(dá)Fig.5 Western-blotting detection of FAS, P21 and TRAF-2 protein expression in A549 cells

項目空白對照組Si-EIF4G1Si-對照組真核翻譯起始因子4γ11.21±0.470.76±0.30*1.11±0.49

注： *與對照組比較，P<0.05

表2 Si-EIF4G1對A549細(xì)胞內(nèi)FAS,P21和TRAF2蛋白表達(dá)影響

注： 與對照組相比，*P<0.05

3 討 論

肺癌的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移是一個多階段、多因子參與的復(fù)雜而又連續(xù)的過程，其中涉及了一些關(guān)鍵的癌基因和抑癌基因。近幾年，針對這些關(guān)鍵分子的靶向性藥物開始應(yīng)用于臨床，如EGFR、KRAS、VEGF、BRAF、HER-2等[6-8]。對于EGFR敏感突變的特定人群，酪氨酸蛋白激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼能明顯延長晚期NSCLC患者的無復(fù)發(fā)生存期，但是最終會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，因此需要尋找更有效的分子標(biāo)記物。

研究發(fā)現(xiàn)EIF4G1在鼻咽癌、喉癌、肺癌、乳腺癌中表達(dá)都有明顯增高，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞蛋白翻譯、腫瘤血管生成、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等。EIF4G1作為一種支架蛋白，可能是NSCLC的潛在分子標(biāo)記物。但是至今為止，NSCLC中過量表達(dá)的EIF4G1與NSCLC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系、NSCLC細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的確切作用機(jī)制尚未明確。本研究通過RNAi技術(shù)下調(diào)EIF4G1在NSCLC細(xì)胞株A549中的表達(dá)水平后，癌細(xì)胞生長緩慢，并出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象，提示EIF4G1在肺癌中可以作為一個潛在的治療靶點(diǎn)，通過抑制肺癌細(xì)胞中EIF4G1的基因表達(dá)有可能抑制腫瘤的發(fā)展。

目前關(guān)于NSCLC中凋亡相關(guān)蛋白Fas/FasL的表達(dá)及其介導(dǎo)的凋亡、免疫逃逸在肺癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的作用機(jī)制研究一直在不斷進(jìn)展中，在子宮內(nèi)膜癌、肝癌等癌癥細(xì)胞檢測中都發(fā)現(xiàn)有Fas/FasL系統(tǒng)的表達(dá)失衡[9]。一些藥物研究也發(fā)現(xiàn)用藥后的癌細(xì)胞凋亡也伴隨著上調(diào)Fas/FasL通路的蛋白表達(dá)，檢測FAS可以為檢測肺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移提供依據(jù)[10]。有研究表明P21可能參與了TGFβ(transforming growth factorβ)信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡的功能，其基因產(chǎn)物是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡[11]。上調(diào)和下調(diào)P21的表達(dá)已證實在肺癌的細(xì)胞凋亡及浸潤和轉(zhuǎn)移中有抑制和促進(jìn)作用[12]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAFs，Tumor necrosis factor receptor associated factors)是一類重要的胞漿銜接蛋白，參與調(diào)節(jié)NF-κB、JNK等多種信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活與凋亡[13]，其中TRAF2是TRAF家族的核心成員，在腫瘤中起了很重要的作用[14]。有研究已證實在肺癌細(xì)胞中TRAF2的表達(dá)下降，而增加TRAF2在癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)后可以促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[15-16]。在本研究中，在下調(diào)A549中 EIF4G1的表達(dá)后，F(xiàn)AS，P21和TRAF2表達(dá)明顯升高，說明EIF4G1抑制細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制與這些分子所在的信號通路有關(guān)： 當(dāng)下調(diào)EIF4G1的表達(dá)后，促凋亡蛋白FAS和TRAF2表達(dá)增高，腫瘤細(xì)胞凋亡增多；P21表達(dá)增高，發(fā)揮細(xì)胞周期抑制作用，癌細(xì)胞增殖減慢。然而其具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

本研究結(jié)果顯示，下調(diào)NSCLC細(xì)胞中EIF4G1的表達(dá)后，癌細(xì)胞生長明顯緩慢，凋亡細(xì)胞明顯增多，通過western-blot實驗證實在EIF4G1表達(dá)明顯低于對照組的情況下，siENA-EIF4G1組中促凋亡蛋白FAS，P21和TRAF2表達(dá)明顯升高，說明下調(diào)EIF4G1在肺癌中的表達(dá)可起到促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，EIF4G1在A549細(xì)胞的生長過程中起了重要的作用，今后將進(jìn)一步深入研究EIF4G1與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及分子作用機(jī)制，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的思路。

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Effect of EIF4G1 on apoptosis of non-small cell lung cancer cells

WEIMeng-dan，LUYing,CaoYue-yu,XUZeng-guang

(Dept. of Research, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China)

Objective To investigate the effects of eukaryotic translation initiation factor 4γ1 (EIF4G1) on apoptosis of human non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Methods EIF4G1 expression in NSCLC cells was knocked down by RNAi technology. Human NSCLC A549 cells were divided into three groups： blank control group, Si-EIF4G1 group and Si-NC group. The proliferation of the A549 cell was analyzed by MTS and the apoptosis rates were detected by flow cytometry. EIF4G1 protein and apoptosis-related proteins in A549 cells were detected by Western blot. Results The proliferation of A549 cells in Si-EIF4G1 group were decreased compared with Si-NC group. Flow cytometry showed that cell apoptosis in Si-EIF4G1 group was increased(4.65%±6.12%)compared to NC(1.26%±2.60%)and Si-NC groups(3.88%±3.52%). Western-blot showed that the expressions of apoptosis-related proteins FAS, P21 and TRAF2 were increased (P<0.05).Conclusion EIF4G1 can inhibit apoptosis of A549 by regulating the expression levels of FAS, P21 and TRAF2.

EIF4G1; non-small cell lung cancer; apoptosis

10.16118/j.1008-0392.2016.03.010

2016-01-20

上海市浦東新區(qū)科委創(chuàng)新基金(PKJ2015-Y16)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)領(lǐng)先人才培養(yǎng)計劃(PWRL2014-01)

魏夢丹(1987—)，女，碩士研究生.E-mail: wmd052050@sina.com

徐增光.E-mail: xuzg1998@163.com

R 734.2

A

1008-0392(2016)03-0050-06