張佑俊， 曲新凱

(上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200030)

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·基礎(chǔ)研究·

NAD+在心臟缺血及再灌注損傷中的作用

張佑俊， 曲新凱

(上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200030)

目的 通過(guò)建立大鼠心肌缺血再灌注(ischemia/ reperfusion， I/R)模型，探索藥物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。方法 采用手術(shù)結(jié)扎前降支建立大鼠心肌I/R模型，20只Sprague-Dawley ( SD)大鼠隨機(jī)分入I/R+NAD+組(n=10)和I/R+NS組(n=10)，通過(guò)血清肌鈣蛋白(cTn-I),TTC染色檢測(cè)心肌損傷程度, TUNEL染色用于檢測(cè)缺血區(qū)域凋亡信號(hào)。結(jié)果 成功建立大鼠I/R模型，I/R+NAD+組大鼠血清cTn-I水平顯著低于I/R+NS組[(10.01±3.26) ng/mlvs. (57.17±14.83) ng/ml,P<0.01]。TTC染色結(jié)果顯示： I/R+NAD+組大鼠心臟梗死體積顯著低于I/R+NS組[(68.06±16.04) mm3vs. (11.42±9.65) mm3,p=0.02]。TUNEL染色結(jié)果顯示： I/R+NAD+組大鼠心臟梗死區(qū)域凋亡信號(hào)顯著低于I/R+NS組。結(jié)論 NAD+在大鼠心肌缺血再灌注損傷具有顯著保護(hù)作用，而其具體保護(hù)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

缺血再灌注損傷； NAD+； 心肌梗死； 大鼠

冠心病是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的重大疾病之一，其發(fā)病率、死亡率逐年升高，其中急性心肌梗死是冠心病中致死及致殘率最高的一類(lèi)疾病[1]。盡管介入治療的廣泛開(kāi)展，治療缺血及再灌注(ischemia/ reperfusion， I/R)損傷的心肌仍是尚未解決的難題，大量患者在急診介入治療后一周內(nèi)出現(xiàn)急性心衰，惡性心律失常，甚至死亡[2]。此外，冠脈搭橋、心臟移植、心臟驟停心肺復(fù)蘇后、體外循環(huán)心臟手術(shù)后等均存在I/R問(wèn)題[3-4]。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是天然的細(xì)胞內(nèi)參與能量代謝的重要輔酶。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)NAD+更是作為代謝底物和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝及基因表達(dá)[5]。細(xì)胞內(nèi)NAD+耗竭導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙甚至細(xì)胞凋亡。 Alano和Liu等的心肌細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，I/R損傷伴隨顯著的細(xì)胞內(nèi)NAD+水平的下降，外源性補(bǔ)充N(xiāo)AD+具有顯著的保護(hù)作用[6-7]。然而，目前研究NAD+的心肌保護(hù)作用仍局限于細(xì)胞水平，本研究通過(guò)建立大鼠心肌I/R模型研究NAD+在心肌I/R損傷的作用，發(fā)現(xiàn)靜脈注射N(xiāo)AD+顯著保護(hù)大鼠心肌I/R損傷，有望進(jìn)一步為NAD+在大動(dòng)物疾病模型研究甚至臨床應(yīng)用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠20只，體質(zhì)量250～350g，購(gòu)買(mǎi)于上海斯萊克醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。分籠飼養(yǎng)于恒溫(20～22)℃、12h明/暗循環(huán)、無(wú)特殊病原體條件下，飲用水和標(biāo)準(zhǔn)飼料均經(jīng)滅菌后供動(dòng)物自由取用。實(shí)驗(yàn)所有的操作流程均符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物保護(hù)和使用守則。NAD+及2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)分別購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)sigma公司，轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷-生物素刻痕末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于默克密理博公司。

1.2 大鼠心肌I/R動(dòng)物模型建立

用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠(30mg/kg， ip)，氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī) (通氣頻率60次/min)。開(kāi)胸，以5-0絲線在距冠狀動(dòng)脈前降支根部1～2mm 系一個(gè)拌，其間穿過(guò)一塑料管，拉緊拌，觀察結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗的情況。60min松開(kāi)結(jié)扎袢，使冠狀動(dòng)脈血流再通，再灌時(shí)局部組織充血[8]。實(shí)驗(yàn)分為I/R+NAD+組和I/R+生理鹽水(NS)組，每組大鼠10只。分別在再灌注6h和24h先從下腔靜脈取血，再取出心臟進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。I/R+NAD+組在前降支結(jié)扎后即刻尾靜脈給NAD+20mg/kg，I/R+NS組則給等量(100μl)的NS。再灌注24h后，犧牲大鼠，取大鼠心臟用于 TTC染色，再灌注6h后犧牲大鼠，血清用于血清肌鈣蛋白(cTn-I)檢測(cè)，心臟冰凍切片后進(jìn)行TUNEL染色。

1.3 TTC染色

將大鼠心臟手術(shù)結(jié)扎缺血1h再灌注 24h 后死亡大鼠，取下心臟，在切片模具下沿垂直心臟長(zhǎng)軸方向?qū)⑵錂M切為8～9片，每片厚約為1mm。展平后置于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶解的1% TTC溶液中，37℃避光孵育20min，分別于染色后在數(shù)碼相機(jī)下拍照，采用Image pro plus 6.0圖像處理軟件計(jì)算每片梗死面積[9]。每片梗死體積=每片梗死面積×每片的厚度。

1.4 血清cTn-I檢測(cè)

心肌梗死血清標(biāo)志物cTn-I是臨床上診斷心肌損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)中采用血清cTn-I濃度評(píng)價(jià)大鼠心肌梗死程度。3%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，固定四肢，在下腔靜脈取血，用促凝管收集 4ml 靜脈血，待血液自然凝固后，離心半徑 12cm，以3000r/min，15min離心后取上層血清，在Access?Immunoassay System系統(tǒng)下檢測(cè)血清cTn-I濃度[10]。

1.5 TUNEL凋亡信號(hào)檢測(cè)

3%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，固定四肢，快速取出大鼠心臟，洗凈血液，保存于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80℃保存，冰凍切片，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TUNEL染色，后在400倍光鏡下觀察攝片。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 NAD+顯著減少大鼠I/R損傷后心肌梗死體積

兩組大鼠心臟TTC染色結(jié)果見(jiàn)圖1所示，I/R+NAD+組心肌梗死體積(11.42±9.65)mm3，明顯小于R+NS組(68.06±16.04)mm3(P=0.02)。

2.2 NAD+顯著降低cTn-I水平

兩組大鼠血清cTn-I結(jié)果如圖2所示，I/R+NAD+組cTn-I (10.01±3.26ng/ml)顯著小于I/R+NS組(57.17±14.83ng/ml)(P<0.01)。

2.3 NAD+顯著降低TUNEL凋亡信號(hào)

兩組大鼠TUNEL染色結(jié)果如圖3所示，I/R+NAD+組凋亡信號(hào)明顯少于I/R+NS組。

圖1 兩組大鼠心肌梗死體積比較Fig.1 the myocardial infarct volume of rats in two groups

圖2 兩組大鼠再灌注6h 血清cTn-I水平Fig.2 the cTn-I level of rats after 6h reperfusion in two groups

圖3 兩組大鼠缺血區(qū)域心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)比較Fig.3 the apoptosis rate in ischemical area of neats in two groups

3 討 論

大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)多種藥物被證明具有保護(hù)心肌I/R損傷的作用，但至今仍無(wú)FDA批準(zhǔn)的用于治療I/R損傷的臨床藥物[11]。臨床上仍缺乏針對(duì)I/R損傷的有效藥物。

本研究中，成功實(shí)現(xiàn)大鼠心肌I/R模型的建立，通過(guò)靜脈注射N(xiāo)AD+可顯著減少I(mǎi)/R導(dǎo)致的心肌梗死體積，相應(yīng)的再灌注6h后cTn-I水平在NAD+給藥組亦顯著降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，靜脈給藥NAD+可顯著減少I(mǎi)/R損傷后的心肌細(xì)胞凋亡。在現(xiàn)象上，NAD+可顯著保護(hù)I/R損傷的心肌。

NAD+最初被發(fā)現(xiàn)作為一個(gè)重要輔酶在細(xì)胞糖代謝以及線粒體電子傳遞鏈起著重要作用。但是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，NAD+對(duì)于氧化性細(xì)胞損傷和缺血性腦損傷有著顯著的保護(hù)作用[6, 12]。進(jìn)一步的，關(guān)于NAD+依賴性酶的研究發(fā)現(xiàn)，NAD+及NAD+依賴性酶在細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、細(xì)胞代謝、能量平衡中起著重要作用[13-15]。

Ying等的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激條件下，細(xì)胞內(nèi)NAD+的顯著下降是引起細(xì)胞凋亡的主要原因，外源性補(bǔ)充N(xiāo)AD+可維持應(yīng)激條件下細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。在進(jìn)一步的大鼠腦I/R模型中，NAD+顯著保護(hù)腦I/R損傷[12]。另外，研究表明，在一定范圍內(nèi)，NAD+與NAD+依賴的細(xì)胞內(nèi)組蛋白去乙?；?Sirtuins)乙?；饔贸拭黠@的量效關(guān)系[13]。目前Sirtuins的去乙?；饔贸蔀榻暄芯康臒狳c(diǎn)并取得積極效果[16]。Hsu等在小鼠心肌I/R模型中發(fā)現(xiàn)Sirtuins 1通過(guò)去乙?；械鞍罪@著增強(qiáng)了心肌抗氧化抗凋亡的能力[17]。Pais及peek等研究則提示Sirtuins 2,3分別在炎癥和能量代謝中發(fā)揮重要作用[13, 18]。

I/R損傷是一個(gè)多因素參與的病理過(guò)程。在細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，NAD+減少缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，首次通過(guò)大鼠I/R模型研究發(fā)現(xiàn)，NAD+顯著減少I(mǎi)/R損傷導(dǎo)致的心肌梗死體積及心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證明了NAD+具有顯著保護(hù)心肌I/R損傷的作用，為NAD+在大動(dòng)物疾病模型甚至臨床應(yīng)用中提供依據(jù)。另一方面，NAD+在I/R損傷過(guò)程中可能從多個(gè)通路保護(hù)心肌，NAD+的保護(hù)心肌的確切機(jī)制有待于研究。

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Protective effect of NAD+in heart ischemia/reperfusion injury

ZHANGYou-jun,QUXin-kai

(Dept. of Cardiology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200030, China)

Objective To investigate the effect of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) in protection of myocardium from ischemia/reperfusion injury. Methods The ischemic/reperfusion model was induced with surgical ligation of left anterior descending (LAD) in 20 SD rats. NAD+20mg/kg or same volume of NS were given i.v. immediately after LAD ligation to rats in I/R+ NAD+group (n=10) or I/R +NS group (n=10). Serum cTn-I was measured; TTC staining and TUNEL assay were performed. Results Serum cTn-I level was significantly higher in I/R+NS group than that in I/R+NAD+group [(57.17±14.83) ng/mlvs. (10.01±3.26) ng/ml,P<0.01]. TTC staining showed that the infarct volume in I/R+NS group was higher than that in I/R+NAD+group [(68.06±16.04) mm3vs. (11.42±9.65) mm3,P=0.02]. TUNEL assay showed that high apoptosis signal induced by I/R injury was significantly reduced by NAD+administration. Conclusion NAD+can significantly protect the heart from I/R injury.

ischemia/reperfusion injury； NAD+； myocardial infarction； ret

10.16118/j.1008-0392.2016.03.006

2016-01-31

上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉研究基金(YG2014MS74)；上海市胸科醫(yī)院科技發(fā)展基金(2014YZDH20300)

張佑俊(1989—)，男，住院醫(yī)師，碩士.E-mail： zyjheart@126.com

曲新凱.E-mail: qxkchest@126.com

R 54

A

1008-0392(2016)03-0032-04