楊 梅, 徐嘉偉, 王成輝, 張文駒(. 長江大學(xué) 教育部濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用工程研究中心, 湖北 荊州 4005; . 復(fù)旦大學(xué) 教育部生物多樣性與生態(tài)工程重點實驗室, 上海 004; . 上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與養(yǎng)殖生態(tài)重點開放實驗室,上海 00090)

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長江口泥螺群體遺傳多樣性的AFLP分析

楊 梅1, 徐嘉偉3, 王成輝3, 張文駒2
(1. 長江大學(xué) 教育部濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用工程研究中心, 湖北 荊州 430025; 2. 復(fù)旦大學(xué) 教育部生物多樣性與生態(tài)工程重點實驗室, 上海 200433; 3. 上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與養(yǎng)殖生態(tài)重點開放實驗室,上海 200090)

本研究應(yīng)用AFLP分子標記技術(shù), 對我國長江口泥螺的4個群體(江蘇啟東, 崇明東灘, 九段沙濕地國家自然保護區(qū)和上海南匯)進行了遺傳多樣性分析。4對AFLP引物擴增得到577個位點, 啟東、崇明、九段沙和南匯群體的多態(tài)率分別為78.2%、56.0%、58.4% 和57.9%。群體總基因多樣性為0.2218,顯示出較高的遺傳多樣性水平, 且96%以上的遺傳變異存在于群體內(nèi), 群體間的遺傳分化極微小(0.0000~0.0404)。群體間Nei’s遺傳距離為0.0000~0.0124, 主要存在于江蘇啟東群體和其他3個群體之間。利用STRUCTURE分析群體隱性遺傳結(jié)構(gòu), 結(jié)果表明長江口泥螺群體有3種遺傳來源, 同時群體之間有強大的基因流。泥螺較強的擴散能力和海洋開放的環(huán)境可能是造成泥螺群體遺傳同質(zhì)性較高的主要原因。

泥螺; AFLP; 遺傳多樣性

[Foundation: The project was financially supported by open fund of Engineering research of ecology and agricultural use of wetland, ministry of education (KF201411)]

泥螺 Bullacta exarata(Philippi, 1848)隸屬腹足綱、后腮亞綱的軟體動物, 俗稱“吐鐵”, 為西太平洋沿岸半咸水灘涂的習(xí)見種, 廣泛分布于我國南北沿海潮間帶灘涂, 國外分布于日本和朝鮮[1]。泥螺是一種經(jīng)濟價值很高的灘涂貝類, 肉質(zhì)細嫩鮮美, 營養(yǎng)豐富。泥螺也是一種對環(huán)境變化非常敏感的灘涂資源貝類, 可以作為灘涂環(huán)境污染長期潛在的指示生物[2-3]。近年來, 由于長江口灘涂長期被大規(guī)模圍墾, 使墾區(qū)潮間帶底棲動物的棲息豐度明顯下降[4];同時, 過度的捕撈也使得泥螺野生種群數(shù)量嚴重下降[5]。因此, 對其進行保護生物學(xué)研究已十分迫切。遺傳多樣性是物種最重要的特性之一, 一定程度上反映了物種對復(fù)雜生存環(huán)境的適應(yīng)能力和進化潛力,同時也是評價自然生物資源的重要依據(jù)[6]。目前, 我國學(xué)者對泥螺的種群生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和毒理學(xué)等進行了比較系統(tǒng)的研究[7-9], 但尚無遺傳多樣性方面的報道。對泥螺遺傳多樣性分布的了解, 能為合理制定保護策略提供依據(jù)。

擴增片段長度多態(tài)性(amplified Fragment LengthPolymorphism, AFLP)是一種基于PCR 和RFLP基礎(chǔ)上的DNA指紋技術(shù)[10], 具有快速、靈敏、重復(fù)性好, 多態(tài)性豐富及覆蓋全基因組等特點,且可以在不了解研究對象的基因組序列情況下進行研究, 現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到種質(zhì)鑒定、遺傳結(jié)構(gòu)分析等研究領(lǐng)域[11-12]。本研究首次利用AFLP分子標記技術(shù)對長江口的泥螺群體進行遺傳多樣性分析, 通過評價泥螺群體的遺傳多樣性水平及遺傳結(jié)構(gòu), 以期揭示該地區(qū)泥螺種質(zhì)及不同群體遺傳分化情況, 為泥螺的種質(zhì)資源保護和可持續(xù)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗所用的泥螺材料分別來自江蘇啟東(QD),上海崇明東灘(CM), 上海九段沙濕地國家自然保護區(qū)(JD)和上海南匯(NH)的4個群體, 取樣點地理位置如圖1。采集的泥螺樣本清水漂洗后置于無水乙醇中, 4℃保存。

圖1 長江口泥螺采樣地點示意圖Fig. 1 Sample sites of B. exarata along the Yangtze estuary

實驗用的海洋動物總DNA提取試劑盒購自天根生化科技公司, EcoR I/ Mse I內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自Fermentas公司, PCR擴增體系使用的引物、Taq DNA聚合酶、Buffer、MgCl2、dNTP購自上海生工公司, PCR產(chǎn)物檢測使用的去離子甲酰胺(Hi-Di Formamide)及內(nèi)標(GeneScan Liz-500)購自Applied Biosystems公司。

1.2 DNA提取和AFLP圖譜構(gòu)建

基因組DNA的提取采用海洋動物組織提取試劑盒, 提取方法參照Sambrook等《分子克隆指南》[13]。獲得的DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度, 其中高質(zhì)量的總DNA用于后續(xù)的AFLP反應(yīng); 利用DU640紫外分光光度儀測定DNA溶液濃度, 以雙蒸水將總DNA稀釋至10 ng/μL, 置–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果, 篩選出4對適用于泥螺的AFLP選擇性擴增引物用于最后的選擇性擴增, 它們是: HEX-E-AGG/M-CAT, HEX-E-AGG/M-CAA, HEXE-AGG/M-CAG, FAM-E-AAC/M-CAT, 其中EcoR I選擇性引物帶有FAM或HEX熒光標記。參照Vos 等[10]和Li-Cor公司AFLP Expression Analysis kit[14]的方法進行改良并構(gòu)建AFLP圖譜。選擇性擴增產(chǎn)物在ABI3730測序儀上進行電泳, 所得光譜數(shù)據(jù)利用遺傳圖譜軟件(Genemapper 3.7 software)進行50~500bp范圍內(nèi)的片段分析并生成01原始數(shù)據(jù)距陣(0表示片段無, 1表示片段有)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

遺傳多樣性的計算方法是基于等位基因頻率或基因型頻率, 參數(shù)包括: 多態(tài)位點百分率(PLP), Nei’s基因多樣性(Hj)和Bayesian估計值(hS)。其中,前兩者參數(shù)通過AFLP surv 1.0軟件[15]計算, 假設(shè)前提是非一致先驗性分布(non-uniform prior distribution)和哈-溫基因型比例(Hardy-Weinberg genotypic proportions); 同時, 作者也計算了總基因多樣性(Ht)和群體內(nèi)基因多樣性(Hw)。此外, 基因多樣性的Bayesian估計值(hS)利用Hickory 1.0 軟件[16]計算,該統(tǒng)計方法不假設(shè)種群符合哈-溫基因型比例。

遺傳結(jié)構(gòu)是指遺傳變異在群體內(nèi)和群體之間的分布型式, 通常以遺傳分化水平來衡量。利用AFLP surv 1.0軟件計算群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)。利用STRUCTURE 2.2軟件[17], 將所有個體根據(jù)其遺傳組分進行分類, 通過直接衡量所有個體的遺傳信息從而得到隱性的遺傳結(jié)構(gòu)。預(yù)先設(shè)定的主要參數(shù)是: K(表示假定該群體有K種基因來源)=1~5; 等位基因頻率混合相關(guān)模型, Burn-in period=30000, MCMC= 100000, 每個K值重復(fù)計算5runs。Evanno等[18]提出基于STRUCTRUE運算的Ln P(D)值, 根據(jù)ad hoc統(tǒng)計量ΔK值來選擇最真實的遺傳類型數(shù)目, 其計算公式為: ΔK= m[L(K+1)–2L(K)+L(K–1)]/S[L(K)]。其中m表示重復(fù)runs中的Ln P(D)的平均值, S表示Ln P(D)的方差; 研究同時認為最高的ΔK值所對應(yīng)的K值即為真實的遺傳類型數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

從所選擇出4對AFLP選擇性引物共檢測出577個擴增片段(50~500bp), 平均每對引物組合擴增出約144條帶(所有個體帶數(shù)總合)。其中, 多態(tài)片段為573條, 多態(tài)位點比例為99.3%。電泳結(jié)果示例圖如圖2, 只有清晰、噪音小的電泳圖才用于下一步的片段分析, 并生成01距陣。

2.1 群體遺傳多樣性分析

采用群體遺傳變異分析程序AFLP surv 1.0 對泥螺群體的遺傳變異進行了分析, 從表1可以看出,來自江蘇啟東(QD)的群體多態(tài)位點比率最高(78.2%),其他3個群體(CM、JD、NH)的多態(tài)位點比率沒有明顯差異, 分別為56.0%、58.4%、57.9%; 4個泥螺群體的總基因多樣性指數(shù)為0.2218, 群體基因多樣性(Hj)也以啟東群體(QD)最高(0.2612), 其他3個群體(CM、JD、NH)略低(0.1935 ~ 0.2063)。

圖2 ABI3730測序儀電泳的得到的一個個體的擴增產(chǎn)物的峰圖示例Fig. 2 Plot of electropherograms of one AFLP sample run on the ABI 3730

表1 泥螺4個群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab. 1 Genetic diversity among populations of B. exarata

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

4個群體總的基因多樣性(Ht)為0.2218, 其中群體內(nèi)基因多樣性(Hw)為0.2163, 暗示遺傳變異主要存在于群體內(nèi)。此結(jié)果可由遺傳分化系數(shù)Fst得到進一步驗證(表2), 群體之間最大Fst為0.0404, 表明96%以上的遺傳變異存在于群體內(nèi)。從表2可以看出,長江口南岸的3個群體崇明東灘(CM), 九段沙(JD)和南匯(NH)之間的遺傳距離極小甚至沒有, 分別為0.0030, 0.0042和0.0000, 而遺傳距離主要存在于江蘇啟東(QD)群體和南岸3個群體之間(CM、JD、NH),分別為0.0102, 0.0124和0.016。

利用Evanno 等[18]的ΔK計算方法, 結(jié)果表明在K = 3時具有最大值, 表明長江口泥螺個體有3種遺傳來源(圖3, 不同顏色代表不同遺傳類型)。其中, 來自啟東QD的個體以一種遺傳類型為主, 而崇明、九段沙和南匯群體以另一種遺傳類型為主, 顯示出長江口北岸的啟東群體與南岸3個群體之間親緣關(guān)系相對較遠, 南岸崇明、九段沙和南匯3個群體之間分化極小; 同時, 部分個體的遺傳組分是明顯混合的,表明這些個體是群體之間基因交流的后代; 此外STRUCTURE分析還顯示來自不同群體的部分個體遺傳組成相似, 甚至存在遺傳組成完全相同的個體(如圖3箭頭所示), 表明群體之間有較強的基因流。

3 討論

3.1 長江口泥螺的遺傳多樣性水平

表2 成對遺傳分化值(對角線上方)和Nei’s遺傳距離(對角線下方)Tab. 2 Pairwise Fstbetween populations (above diagonal) and Nei’s genetic distance (below diagonal)

近年來, 國內(nèi)學(xué)者采用隨機擴增多態(tài)性(RAPD)、簡單重復(fù)序列(SSR)、AFLP等分子標記對我國多種海洋貝類的野生群體進行了遺傳多樣性分析, 總體呈現(xiàn)出較豐富的遺傳變異[19-22]。例如, 閆喜武等[21]的SSR分析揭示青島、大連等菲律賓蛤仔群體具有較高的遺傳多樣性(觀察雜合度為0.2383~ 0.4387); 張秀英等[22]利用SSR標記發(fā)現(xiàn)我國青島和大連櫛孔扇貝遺傳多樣性較高(觀察雜合度分別為0.5100和0.4204), 群體間遺傳分化較弱。本研究中,共利用4對AFLP引物對我國長江口泥螺群體進行了遺傳結(jié)構(gòu)分析, 結(jié)果顯示, 與河口其他海洋動物AFLP分析相比, 長江口泥螺群體呈現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性(多態(tài)位點百分率為56.0%~78.2%, 基因多樣性為0.1935~0.2612)。黃雷等[23]對長江中華絨螯蟹進行了AFLP分析, 其Nei’s基因多樣性為0.1346,遺傳變異主要存在于群體內(nèi); 葛家春等[24]通過對長江刀鱭的AFLP分析, 發(fā)現(xiàn)長江刀鱭具有豐富的遺傳多樣性(Nei’s基因多樣性為0.2183); 潘英等[25]利用AFLP分子標記則發(fā)現(xiàn)管角螺的遺傳多樣性高達0.4766。盡管本研究表明長江口泥螺目前尚保持較高的遺傳多樣性, 但崔朝霞等[19]的研究同時指出, 長期人工繁殖、環(huán)境污染和不合理的捕撈方式已造成多種經(jīng)濟貝類的遺傳多樣性降低。

圖3 STRUCTURE分析得到的隱性遺傳結(jié)構(gòu)圖(K=3)Fig. 3 Cryptic genetic structures of four populations based on structure analysis (K=3)

3.2 長江口泥螺的遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳分化系數(shù)既是衡量遺傳變異分布型式, 也是衡量群體再分效應(yīng)的重要指標, 它表示因遺傳漂變引起一個亞群的雜合度的降低程度。Fst的取值為0~1, 其中0表示完全隨機交配, 無群體再分; 1表示極端再分, 即群體隔離。0.00~0.05: 群體分化程度較小; 0.05~0.15: 群體分化程度中等; 0.15~0.25: 群體分化程度較大; 0.25~1.00: 群體分化程度很大[26]。本實驗結(jié)果表明, 長江口北岸啟東群體(QD)與南岸3個群體(CM、JD和NH)有較小程度的分化(0.0365~ 0.0404), 但崇明東灘、九段沙和南匯3個群體更小(0.0000~0.0167), 接近隨機交配群體, 且九段沙群體和南匯群體為完全隨機交配群體。該結(jié)論得到STRUCTURE隱性遺傳結(jié)構(gòu)分析支持, 啟東群體與南岸3個群體親緣關(guān)系相對較遠, 而南岸3個群體相似度極高, 分化很小。

基因流是影響群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的最重要的因素之一。本研究中, 長江口泥螺群體遺傳多樣性的維持與其繁育系統(tǒng)及不同地理位置的頻繁的基因交流有關(guān)。泥螺繁殖期長, 自3月底到11月底的8個月中都能產(chǎn)卵, 且生長速度較快, 其雌雄同體、異體交配的繁殖特性也有助于其多樣性水平的維持。此外, 泥螺生存的特殊環(huán)境有助于群體間的個體遷移。雖然泥螺成螺是營匍匐生活的, 自然情況下不易四處擴散, 但泥螺以膠狀卵群的形式產(chǎn)出并形成受精卵, 卵群為圓球形、似水泡, 這種球形的卵群對海水產(chǎn)生的浮力, 在海水中半浮半沉, 隨波逐流,四處擴散, 胚胎在移動過程中仍能夠得到良好的發(fā)育, 這可能也是泥螺在我國南北沿海連續(xù)分布的原因之一[5]。本研究中, 啟東的泥螺群體具有相對更高的遺傳多樣性且與其他3個群體相對分化較大, 這可能與其分布的地理位置有關(guān)。從地理上看, 該群體與東北方向的黃海和渤海的泥螺群體很可能會有基因交流。

此外, 長江口泥螺的散布范圍、方向可能受長江口及其鄰近海域的洋流方向的調(diào)節(jié)。5、6月和9、10月是泥螺產(chǎn)卵的兩個高峰季節(jié)[4], 因此, 這個時期的潮流場很可能對不同地理分布的泥螺的遷移影響最大, 進而影響了泥螺的空間遺傳結(jié)構(gòu)。由于長江口及其鄰近海域的潮波系統(tǒng)和物質(zhì)交換是多種動力因子綜合作用的結(jié)果, 十分復(fù)雜[27-28], 因此, 未來需要獲取包括洋流、溫度、鹽度等數(shù)據(jù)來來輔助進行更深入的群體遺傳結(jié)構(gòu)研究。盡管如此, 本研究結(jié)果可以作為長江口泥螺遺傳多樣性和群體分化的基礎(chǔ)信息, 并為水域開放系統(tǒng)中生物的遺傳結(jié)構(gòu)和擴散研究提供參考。

致謝: 本實驗的樣品在采集過程中得到唐仕敏先生的幫助,在此表示衷心的感謝。

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(本文編輯: 梁德海)

Amplified fragment length polymorphism analysis of the genetic diversity of Bullacta exarata in the Yangtze estuary

YANG Mei1, XU Jia-wei3, WANG Cheng-hui3, ZHANG Wen-ju2
(1. Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland, Ministry of Education, Yangtze University, Jingzhou 430025, China; 2. Key laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering, Ministry of Education, Fudan University, Shanghai 200433, China; 3. Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Aquacultural Ecosystem, Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 200090, China)

Jul., 25, 2015

Bullacta exarata; amplified fragment length polymorphism; genetic diversity

In this study, the genetic diversity of Bullacta exarata from four populations (Qidong, Chongming Dongtan, Jiuduansha, and Nanhui) in the Yangtze estuary were investigated based on amplified fragment length polymorphism (AFLP) profiles. The four AFLP primer combinations produced 577 AFLP loci and the percent loci polymorphic values for QD, CM, JD, and NH were 78.2%, 56.0%, 58.4%, and 57.9%, respectively. The total gene diversity index was 0.2218, indicating a high level of genetic diversity and over 96% of the genetic variation was because of individuals within populations. Genetic differentiations among populations were very low (0.0000–0.0404) and the Nei’s genetic distance among four populations varied from 0.0000 to 0.0124. In addition, structure analysis indicated that B. exarata populations originated from three genetic groups and strong gene flow existed among populations. The ability of B. exarata to disperse in the open sea could be the cause of the slight genetic variation in the studied areas.

S963

A

1000-3096(2016)02-0020-06

10.11759/hykx20141018001

2014-10-18;

2015-10-12

長江大學(xué)濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放基金(KF201411)

楊梅(1981-), 女, 湖北省荊州人, 講師, 博士, 主要研究方向為分子生態(tài)學(xué), 電話: 0716-8066541, E-mail: myang@yangtzeu. edu.cn; 張文駒, 通信作者, 男, 教授, 研究方向: 分子生態(tài)學(xué)