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        水質(zhì)中葉綠素a檢測(cè)方法的改進(jìn)和探討

        2016-07-05 08:27:05胡新躍北京市豐臺(tái)區(qū)環(huán)境保護(hù)局北京0007北京市朝陽區(qū)環(huán)境保護(hù)局北京005
        科技傳播 2016年12期

        李 征,胡新躍.北京市豐臺(tái)區(qū)環(huán)境保護(hù)局,北京 0007 .北京市朝陽區(qū)環(huán)境保護(hù)局,北京 005

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        水質(zhì)中葉綠素a檢測(cè)方法的改進(jìn)和探討

        李征1,胡新躍2
        1.北京市豐臺(tái)區(qū)環(huán)境保護(hù)局,北京100071 2.北京市朝陽區(qū)環(huán)境保護(hù)局,北京100125

        摘要葉綠素a是地表水監(jiān)測(cè)的常規(guī)項(xiàng)目,是水體初級(jí)生產(chǎn)力的重要指標(biāo)。目前實(shí)驗(yàn)室主要采用國(guó)家環(huán)??偛俊董h(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》(第四冊(cè))中規(guī)定的分光光度法測(cè)定葉綠素a,在大量的實(shí)際研究工作中發(fā)現(xiàn),分光光度法測(cè)量葉綠素a存在一定的缺陷。缺陷主要表現(xiàn)在葉綠素的提取過程中,為此我們將對(duì)原有方法進(jìn)行改進(jìn)。本文通過對(duì)規(guī)范方法與改進(jìn)的浸提方法和超聲法等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比對(duì),找出穩(wěn)定性好,結(jié)果準(zhǔn)確,操作簡(jiǎn)單同時(shí)又能減少丙酮對(duì)操作者毒害作用的方法。

        關(guān)鍵詞葉綠素a的提??;監(jiān)測(cè)方法;方法比較與改進(jìn)

        目前,通過生物學(xué)指標(biāo)監(jiān)控河湖污染情況漸成趨勢(shì),其中浮游植物是一項(xiàng)重要的研究對(duì)象。由于葉綠體是浮游植物的重要功能器官,其功能的強(qiáng)弱及其時(shí)空的動(dòng)態(tài)變化,是通過葉綠素的光合作用實(shí)現(xiàn)的。因此,目前對(duì)葉綠素a的監(jiān)測(cè)是了解水質(zhì)污染狀況及其動(dòng)態(tài)特征的有效方法。

        按照北京市環(huán)境保護(hù)局的要求,自2007年起筆者就開始對(duì)朝陽區(qū)轄區(qū)內(nèi)的湖泊(主要包括朝陽公園的水碓湖、紅領(lǐng)巾公園湖和奧林匹克公園湖)進(jìn)行葉綠素a的測(cè)定,以評(píng)價(jià)這些湖泊的富營(yíng)養(yǎng)化程度。2012年帶領(lǐng)豐臺(tái)監(jiān)測(cè)站取得了葉綠素a檢測(cè)的資質(zhì),檢測(cè)過程中積累了一些經(jīng)驗(yàn),同時(shí)在監(jiān)測(cè)過程中也發(fā)現(xiàn)了許多問題。為了提高葉綠素a監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性,簡(jiǎn)化檢測(cè)操作程序,保證檢測(cè)人員身體健康,我們對(duì)現(xiàn)有的監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行了嘗試性地改進(jìn)。

        1 現(xiàn)階段葉綠素a檢測(cè)情況概述

        目前,測(cè)定葉綠素a沒有國(guó)標(biāo)方法?,F(xiàn)在環(huán)保系統(tǒng)采用的葉綠素a監(jiān)測(cè)方法主要依據(jù)是《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第四版)》中的水質(zhì)葉綠素a的測(cè)定的分光光度法。該方法測(cè)定葉綠素a的基本原理是:通過抽濾的方法將附著在濾膜上的藻類,溶解在90%的丙酮溶劑中,以反復(fù)研磨和離心的方法提取葉綠素a。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能充分將藻類植物的細(xì)胞壁破碎,對(duì)葉綠素的提取速度較快。

        在實(shí)際檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn),該方法的主要缺點(diǎn)在于研磨過程中葉綠素a容易發(fā)生光降解,同時(shí)因?yàn)榉磸?fù)轉(zhuǎn)移操作及易產(chǎn)生損失,使結(jié)果偏低、誤差較大,此外研磨過程中操作人員與丙酮接觸時(shí)間長(zhǎng),不利于操作人員的健康。

        為此我們主要從溶劑、提取方式、溫度和時(shí)間控制等方面對(duì)原有方法進(jìn)行改進(jìn)。本文通過對(duì)規(guī)范方法與改進(jìn)的浸提方法和超聲法等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比對(duì),找出穩(wěn)定性好,結(jié)果準(zhǔn)確,操作最為簡(jiǎn)單的方法。

        2 分光光度法測(cè)葉綠素a步驟及問題

        2.1實(shí)驗(yàn)材料

        地表水水樣(每次量取100ml)。

        儀器設(shè)備:722S分光光度計(jì)、真空泵、玻璃抽濾器、TDZ5-W5多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)、孔徑0.45μm乙酸纖維濾膜、電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)、無水碳酸鎂粉末、90%丙酮。

        2.2常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作方法

        1)水樣抽濾:在抽濾器上裝好0.45μm的乙酸纖維濾膜。倒入100ml的水樣進(jìn)行抽濾,水樣抽完后,繼續(xù)抽1min~2min,以減少濾膜上的水分。

        2)樣品提?。簩в懈∮沃参锏臑V膜取出放在冰箱內(nèi)低溫干燥6h~8h后放入組織研磨器中,加入少量無水碳酸鎂粉末及2m1~3m1的90%的丙酮,充分研磨,提取葉綠素a。用離心機(jī)在3 000r轉(zhuǎn)速下離心lOmin。將上清液倒入lOml容量瓶中。之后將剩余固形物倒入組織研磨器中,用2m1~3ml的90%的丙酮,繼續(xù)研磨提取,離心lOmin,并將上清液再轉(zhuǎn)入容量瓶中。重復(fù)1~2次,用90%的丙酮定容為lOml,搖勻。

        3)測(cè)定:用1cm光程的比色皿,分別讀取750nm,663nm,645nm,630nm波長(zhǎng)的吸光度,并以90%的丙酮作空白吸光度測(cè)定,對(duì)樣品吸光度進(jìn)行校正[1]。

        2.3葉綠素a監(jiān)測(cè)方法目前存在的問題

        1)操作誤差:由于操作過程中反復(fù)轉(zhuǎn)移樣品,樣品比較粘稠,容易產(chǎn)生較大的人為操作誤差。同時(shí)由于葉綠素a對(duì)光照及溫度敏感,在研磨過程中摩擦生熱也會(huì)造成一定的葉綠素?fù)p失。

        2)安全性。由于丙酮揮發(fā)性大,有神經(jīng)毒性,對(duì)操作人員身體健康有損害。組織研磨器是玻璃制品,在操作過程中易發(fā)生破碎,有安全隱患。

        3 葉綠素a不同改進(jìn)方法的比較

        3.1反復(fù)凍融-浸提法

        抽濾步驟和比色步驟與規(guī)范法相同,將研磨步驟改為將過濾水樣后的濾膜裝進(jìn)黑色塑料袋,于-20℃冰箱和室溫下反復(fù)凍融3~5次,再放進(jìn)盛有10ml丙酮(90%)的離心管中振搖1min后,于4℃冰箱浸提20h,浸提過程需振搖1~2次[2]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

        表1 研磨法與反復(fù)凍融-浸提法對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        從表1中可以看出,采用反復(fù)凍融-浸提法所得的葉綠素a平均值明顯高于研磨法,兩者之間存在明顯差異。且研磨法平行樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大,主要是受人為因素影響,浸提法減少了研磨和轉(zhuǎn)移過程中葉綠素a的損耗,人為誤差小,穩(wěn)定性好。

        3.2超聲波提取方法

        抽濾步驟和比色步驟與規(guī)范法相同,將研磨步驟改為直接將加了碳酸鎂粉末的濾膜碎片置于離心管中,加入90%丙酮,將離心管用黑色塑料袋包裹后超聲破碎10min,振蕩器振搖(300r/min)萃取1h,離心機(jī)(10 000r/min)離心10min,之后將上清液轉(zhuǎn)入10ml棕色容量瓶中,用90%丙酮定容至10ml,搖勻待測(cè)[3]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

        表2 超聲法與研磨法提取結(jié)果比較

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與傳統(tǒng)的研磨法相比較,超聲法測(cè)定葉綠素a的提取效率優(yōu)于研磨法。

        3.3乙醇替代提取液法

        由于丙酮具有神經(jīng)毒性,對(duì)操作人員的身體健康有毒害作用,因此,在操作過程中嘗試用安全的乙醇替代丙酮進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)方法是將抽濾后的干燥濾膜在乙醇溶液中浸泡過夜,在進(jìn)行研磨提取和離心提取部分,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

        表3 乙醇替代提取液丙酮法對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        從表3中可以看出,在浸泡提取一天之后,乙醇的提取能力接近丙酮的提取效果,可以考慮乙醇替代丙酮溶劑,增加浸泡提取時(shí)間。

        4 結(jié)論

        1)通過上面實(shí)驗(yàn)比較可以看出,規(guī)范操作法由于研磨過程中樣品容易損失導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏低,應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行改進(jìn)。

        2)超聲法測(cè)定葉綠素a的提取效率優(yōu)于丙酮—研磨法,且操作簡(jiǎn)便,節(jié)省時(shí)間,效率高,重復(fù)性好,有可比性,安全性優(yōu),保障健康,能減少系統(tǒng)操作誤差。

        3)反復(fù)凍融-浸提法在操作更為簡(jiǎn)單,提取效率主要通過反復(fù)凍融對(duì)胞壁的破壞和浸提時(shí)間的延長(zhǎng)來實(shí)現(xiàn),該方法大大減少了操作者與丙酮的接觸時(shí)間,降低了丙酮的毒害作用,同時(shí)具有較好的穩(wěn)定性。

        4)用乙醇替代丙酮溶液,雖然提取效果比丙酮溶劑略遜,但是可以通過增加浸提時(shí)間來減少差距,總體來講乙醇具備替代丙酮作為提取溶劑的條件,但要在方法上做更多改進(jìn)來提高乙醇的提取效率。

        參考文獻(xiàn)

        [l]國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法.北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社.

        [2]劉秀麗,宋平,孫成明.植物葉綠素測(cè)定方法的再探討[J].江蘇農(nóng)業(yè)研究,1999(3):46-47.

        [3]吳志旭,張雅燕.2002.浮游植物體內(nèi)葉綠素a測(cè)定方法的改進(jìn)[J].化學(xué)分析計(jì)量,2002,11(6):37-38.

        中圖分類號(hào)X3

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

        文章編號(hào)1674-6708(2016)165-0217-02

        作者簡(jiǎn)介:李征,北京市豐臺(tái)區(qū)環(huán)境保護(hù)局。胡新躍,北京市朝陽區(qū)環(huán)境保護(hù)局。

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