謝康，王鑫，陳慧芳，李懿，宋倩茹，趙萍

家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西南大學(xué)，重慶 400716

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家蠶前部絲腺特異表皮蛋白Bm11721的鑒定及表達(dá)

謝康，王鑫，陳慧芳，李懿，宋倩茹，趙萍

家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西南大學(xué)，重慶 400716

謝康, 王鑫, 陳慧芳, 等. 家蠶前部絲腺特異表皮蛋白Bm11721的鑒定及表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 64–73.

Xie K, Wang X, Chen HF, et al. Identification and expression patterns of anterior silk gland specific cuticle protein Bm11721 in the silkworm (Bombyx mori). Chin J Biotech, 2016, 32(1): 64–73.

摘 要:家蠶的絲腺是其絲蛋白合成和分泌的器官，根據(jù)其形態(tài)和功能的不同分為前部、中部和后部絲腺，前部絲腺不具有合成絲蛋白的能力，是絲蛋白構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變的場(chǎng)所。剪切力在絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變中起到重要的作用，其在家蠶前部絲腺主要由前部絲腺逐漸變細(xì)的管腔結(jié)構(gòu)和富含幾丁質(zhì)及表皮蛋白的堅(jiān)硬的內(nèi)壁提供。鑒定家蠶前部絲腺新的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，并調(diào)查其在家蠶幼蟲(chóng)不同組織的表達(dá)特征。通過(guò)幾丁質(zhì)親和層析的方法在前部絲腺篩選并鑒定到一個(gè)新的具有幾丁質(zhì)結(jié)合功能的表皮蛋白Bm11721，其編碼基因編號(hào)為BGIBMGA011721 (GenBank Accession No. NM-001173285.1)。利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了該蛋白，通過(guò)Ni-NTA親和層析的方法獲得了Bm11721的重組蛋白并制備了多克隆抗體。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)無(wú)論是轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白水平Bm11721均只在前部絲腺特異表達(dá)，且Bm11721蛋白在5齡期的前部絲腺中恒定表達(dá)。免疫熒光定位結(jié)果顯示Bm11721蛋白定位在前部絲腺的內(nèi)膜中，推測(cè)其可能與前部絲腺的機(jī)械硬度有關(guān)，為絲蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變提供剪切力。

關(guān)鍵詞:家蠶，前部絲腺，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，組織特異性表達(dá)，免疫熒光定位

Received: March 20, 2015; Accepted: June 5, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31472154), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA00306), PhD Start-up Foundation of Southwest University (No. swu113113).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31472154)，國(guó)家高科技研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2011AA00306)，西南大學(xué)博士啟動(dòng)基金 (No. swu113113)資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-07-08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150708.0946.001.html

家蠶Bombyx mori是鱗翅目昆蟲(chóng)的模式生物，也是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的昆蟲(chóng)。家蠶吐絲結(jié)繭時(shí)，其絲腺中的絲蛋白會(huì)經(jīng)歷一個(gè)從液態(tài)絲蛋白向固態(tài)絲纖維的轉(zhuǎn)變過(guò)程[1]。家蠶的前部絲腺是絲蛋白由液態(tài)向固態(tài)轉(zhuǎn)變的場(chǎng)所，在絲蛋白轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，前部絲腺腺腔提供的摩擦剪切力對(duì)絲蛋白的轉(zhuǎn)變起著至關(guān)重要的作用[2]。絲腺壁由底膜 (亦稱外膜)、腺細(xì)胞及內(nèi)膜三層構(gòu)成[3]。家蠶絲腺內(nèi)膜主要由表皮蛋白和幾丁質(zhì)組成，且前部絲腺內(nèi)膜較厚[4]。前部絲腺較厚的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)一方面可以為絲蛋白的轉(zhuǎn)變提供剪切力，另一方面也可以保護(hù)腺細(xì)胞免受剪切力的傷害[5]。

在昆蟲(chóng)體內(nèi)，表皮蛋白主要是幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，它們與幾丁質(zhì)一起參與形成昆蟲(chóng)的表皮的角質(zhì)層。1988年Robers和Riddiford首次提出表皮蛋白的R&R保守結(jié)構(gòu)域[6]。對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守結(jié)構(gòu)域研究發(fā)現(xiàn)，具有R&R保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能與幾丁質(zhì)結(jié)合。具有R&R保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族可以分為RR-1、RR-2和RR-3三個(gè)亞族[7-8]。RR-1亞族表皮蛋白的保守區(qū)C端有許多芳香基氨基酸[9]。Hamodrakas等研究表明芳香基氨基酸對(duì)幾丁質(zhì)結(jié)合起著重要作用[10]。RR-2亞族與堅(jiān)硬型角質(zhì)層有關(guān)，其保守區(qū)富含組氨酸，且賴氨酸的位置非常保守。Rebers和Willis的研究表明，RR-2亞族的R&R保守區(qū)的作用是作為幾丁質(zhì)的結(jié)合域[11]。RR-3亞族只在昆蟲(chóng)蛻皮后期的角質(zhì)層中有發(fā)現(xiàn)[8]。

隨著家蠶基因組框架圖及基因組精細(xì)圖譜的完成[12-13]，對(duì)家蠶表皮蛋白的鑒定及功能研究也隨之展開(kāi)。梁九波等運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)家蠶表皮進(jìn)行了廣泛分析，通過(guò)保守的基序檢索家蠶基因組，得到163條表皮蛋白序列[14]。Fu等采用LC-MS的方法對(duì)家蠶幼蟲(chóng)的表皮和氣管以及成蟲(chóng)的鱗毛進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，共鑒定到41個(gè)表皮蛋白，且在成蟲(chóng)鱗毛中首次鑒定到了7個(gè)表皮蛋白[15]。Tang等通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)家蠶表皮中幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選，共鑒定到9個(gè)表皮蛋白，并首次證明了體外重組的BmorCPR56和BmorCPT1 蛋白能夠與幾丁質(zhì)結(jié)合[16]。家蠶的前部絲腺是絲蛋白構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變的場(chǎng)所。Yi等對(duì)家蠶前部絲腺進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)前部絲腺存在大量的表皮蛋白[17]。另外也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)家蠶前部絲腺內(nèi)含有大量幾丁質(zhì)[18]，那么，家蠶的前部絲腺內(nèi)的表皮蛋白是否與幾丁質(zhì)結(jié)合？是否參與了絲蛋白在前部絲腺內(nèi)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變？這些問(wèn)題都需要回答。

本研究對(duì)家蠶前部絲腺特異的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選，并對(duì)鑒定得到的新表皮蛋白Bm11721進(jìn)行原核表達(dá)和制備抗體，同時(shí)對(duì)該蛋白進(jìn)行表達(dá)情況分析及組織定位，以期為進(jìn)一步研究前部絲腺表皮蛋白在絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變中的作用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用的二化性家蠶品種-大造 (p50) 由西南大學(xué)家蠶基因資源庫(kù)提供。幼蟲(chóng)在(25±1) ℃、相對(duì)濕度60%、自然光照條件下用桑葉進(jìn)行飼喂。待供試家蠶飼養(yǎng)至幼蟲(chóng)期5齡第3天時(shí)，于冰凍條件下取頭部、表皮、中腸、馬氏管、脂肪體、生殖腺、前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺，并迅速液氮冷凍置于–80 ℃保存。

宿主菌大腸桿菌Trans1 T1和BL21 (DE3)購(gòu)自北京全式金公司；pMD19-T-simple vector克隆載體購(gòu)自TaKaRa公司；pET28a表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、IPTG、Ampicilline、Kanamycin購(gòu)自Promega公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其他未標(biāo)明試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2Bm11721的篩選與鑒定

采用Tang等[16]報(bào)道的表皮蛋白抽提方法提取家蠶前部絲腺總蛋白，將液氮研磨的前部絲腺組織材料先用含有15 mmol/L NaCl的20 mmol/L PBS溶液 (pH 7.4) 連續(xù)抽提3次，抽提蛋白液分別標(biāo)記為P1、P2、P3；再用含2% (W/V) SDS 的20 mmol/L PBS溶液 (pH 7.4) 連續(xù)抽提3次，抽提蛋白液分別標(biāo)記為S1、S2、S3，每次抽提完后于室溫下12 000 r/min離心收集上清，用SDS-PAGE檢測(cè)[19]。將SDS抽提后的蛋白溶液合并，選用截留量為10 kDa的超濾管超濾去除SDS，待溶液中SDS含量小于0.1% (W/V) 即可用于幾丁質(zhì)親和層析柱結(jié)合實(shí)驗(yàn)。將去除SDS的蛋白溶液于室溫下與幾丁質(zhì)珠孵育30 min后收集流出液，接著用2倍柱體積洗滌緩沖液(pH 7.4，20 mmol/L HEPES，1 mol/L NaCl) 漂洗，重復(fù)漂洗5遍，最后用8 mol/L尿素進(jìn)行洗脫，并收集各流出組分。將8 mol/L尿素洗脫管組分濃縮10倍后用12%的SDS-PAGE檢測(cè)，并從膠上切取目的蛋白進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定。

1.3Bm11721的組織表達(dá)特征分析

利用總RNA提取試劑盒 (Omega公司產(chǎn)品)，提取家蠶5齡第3天幼蟲(chóng)各組織器官及從5齡第1天到熟蠶期整蠶的總RNA，并利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 (Promega公司產(chǎn)品)，合成cDNA第一鏈?；诩倚Q基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)Bm11721 (GenBank Accession No. NM-001173285.1) 的引物，引物序列見(jiàn)表1 (①-②)。以家蠶5齡第3天幼蟲(chóng)各組織器官的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，46 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。選擇家蠶持家基因BmActin3為內(nèi)參基因，BmActin3的引物序列見(jiàn)表1 (③-④)。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 40 s，53 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，共25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察。

基于Bm11721的ORF序列，設(shè)計(jì)其熒光定量PCR引物，引物見(jiàn)表1 (⑦-⑧)；內(nèi)參基因?yàn)閟w22934，引物見(jiàn)表1 (⑨-⑩)。以家蠶幼蟲(chóng)5齡期整蠶cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR (Real-time PCR)，反應(yīng)總體系為20 μL (SYBR預(yù)混液10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，ROX染料0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌水6 μL)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，之后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，其中每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，收集目的基因Ct值和內(nèi)參基因Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1　本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4Bm11721的克隆及Bm11721蛋白的原核表達(dá)純化與抗體制備

基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)Bm11721的克隆引物，引物序列見(jiàn)表1 (⑤-⑥)。以家蠶大造5齡第3天前部絲腺cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同1.3。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離、割膠回收純化后，克隆到pMD19-T-simple載體中 (命名為Bm11721-pMD19-T-simple)，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans T1菌株，挑選單克隆，并進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)、雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。將pET28a質(zhì)粒載體與Bm11721-pMD19-T-simple 重組質(zhì)粒的EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物，進(jìn)行割膠回收純化，構(gòu)建Bm11721-pET28a重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCR、雙酶切驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) 菌株，同時(shí)轉(zhuǎn)化pET28a質(zhì)粒。用終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG于37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，收集誘導(dǎo)后的菌體，用結(jié)合緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0) 重懸，超聲破碎，離心，分別收集菌體沉淀和上清，用 12% SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)。利用鎳柱親和層析的方法對(duì)體外表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，通過(guò)咪唑梯度濃度洗脫得到較純的重組蛋白，并送至南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司制備多克隆抗體。

1.5Bm11721的組織表達(dá)特征分析及免疫熒光定位

利用蛋白提取裂解液 (尿素8 mol/L，3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽0.033 mol/L，DTT 0.026 mol/L) 抽提家蠶5齡第3天、第5天和上蔟期各組織及5齡第1天到熟蠶期的前部絲腺總蛋白。將總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，SDS-PAGE上樣量為10 μg，之后用制備的Bm11721多克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。Western blotting條件如下：5%的脫脂奶粉封閉1 h；1%的脫脂奶粉稀釋的一抗孵育1.5 h，一抗稀釋比例分別為1∶20 000；1%的脫脂奶粉稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔的二抗孵育1.5 h，二抗稀釋比例為1∶40 000。選取新鮮的5齡第3天前部絲腺組織，于4% (W/V) 多聚甲醛室溫固定2 h后，包埋于O.C.T冷凍切片包埋劑 (Sakura，USA) 中，–30 ℃冷凍1 h后于冷凍切片機(jī) (Leica CM1950，Germany) 切取7 μm厚切片。切片于室溫晾片15 min后用含有0.3% (V/V) Triton X-100的10 mmol/L PBS (pH 7.4) 洗滌緩沖液漂洗10 min，然后用封閉液 (10 mmol/L PBS，10% (V/V) 羊胎血清，10% (W/V) BSA) 于室溫封閉2 h，一抗和Cy3標(biāo)記的山羊抗兔 (碧云天，中國(guó)) 均按1∶1 000的稀釋比例用抗體稀釋液(10 mmol/L PBS，10% (W/V) BSA) 稀釋，依次室溫孵育1.5 h并洗滌后，用DAPI (碧云天，中國(guó))染細(xì)胞核10 min漂洗后封片。熒光顯微鏡 (尼康，日本) 下觀察并拍照。

2　結(jié)果與分析

2.1前部絲腺中幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的篩選與鑒定

家蠶前部絲腺含有大量的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，我們分別通過(guò)PBS和2% SDS連續(xù)抽提前部絲腺蛋白 (圖1A)，之后對(duì)變性蛋白通過(guò)去除SDS復(fù)性后，過(guò)幾丁質(zhì)親和層析柱，利用8 mol/L尿素對(duì)幾丁質(zhì)親和層析柱進(jìn)行洗脫，將8 mol/L尿素洗脫組分濃縮10倍后得到大量幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白 (圖1B)。對(duì)圖1B箭頭所示的條帶蛋白切膠并進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果表明該蛋白在SilkDB數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋基因編號(hào)BGIBMGA011721，含有149個(gè)氨基酸殘基。該蛋白的編碼基因蛋白質(zhì)編碼區(qū) (CDS) 全長(zhǎng)450個(gè)堿基。對(duì)該蛋白信號(hào)肽進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白含有一個(gè)17個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽；功能域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白是一個(gè)尚沒(méi)有功能域注釋的假定表皮蛋白。

2.2Bm11721基因的克隆、原核表達(dá)、重組蛋白的純化及多克隆抗體制備

為了對(duì)該蛋白進(jìn)行深入的研究，我們首先對(duì)其編碼基因進(jìn)行了克隆，通過(guò)TA克隆并送公司測(cè)序驗(yàn)證，我們成功地克隆了這個(gè)基因的CDS片段。然后，我們構(gòu)建了包含該基因片段的原核表達(dá)載體，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)。由于pET28a表達(dá)載體上帶有一段His標(biāo)簽的序列，該段序列包含36個(gè)氨基酸殘基，大小約為4 kDa。SDS-PAGE結(jié)果表明，Bm11721重組蛋白以包涵體形式高量表達(dá)，表觀分子量約為20 kDa (圖2)，這與預(yù)測(cè)并加上標(biāo)簽的大小基本一致。為了得到純化的重組蛋白以制備抗體，利用鎳柱親和層析的方法對(duì)體外表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，通過(guò)咪唑梯度濃度洗脫，最終在100 mmol/L咪唑濃度下洗脫得到了純度為95%的重組蛋白 (圖3)，共得到18 mg重組蛋白。將得到的重組蛋白送往南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司制備多克隆抗體，最終獲得了效價(jià)大于500 000的多克隆抗體。

圖1　家蠶前部絲腺蛋白的SDS-PAGE分析和Bm11721的篩選Fig. 1 SDS-PAGE analysis of proteins extracted from silkworm ASG and Bm11721 screening. (A) Protein extraction. M: marker; P1–P3: the ASG proteins extracted by 20 mmol/L PBS; S1–S3: the proteins extracted by 2% SDS. (B) Bm11721 screening. 10E: chitin binding proteins were obtained from concentrated eluted fractions by 8 mol/L urea.

圖2　Bm11721重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant Bm11721 protein. M: protein marker (standard); 1: supernatant of control cells (pET28a); 2: supernatant of recombinant cells (Bm11721-pET28a); 3: precipitation of control cells (pET28a); 4: precipitation of recombinant cells (Bm11721-pET28a).

2.3Bm11721的組織表達(dá)特征分析及免疫熒光定位

利用RT-PCR的方法，檢查了家蠶Bm11721基因在家蠶5齡第3天各個(gè)組織的表達(dá)情況。凝膠電泳結(jié)果顯示，在前部絲腺泳道出現(xiàn)了單一的條帶，此條帶的分子量與Bm11721基因的理論分子量一致，說(shuō)明Bm11721基因只在前部絲腺特異表達(dá)，在其他組織中均不表達(dá) (圖4)。

圖3　Bm11721重組蛋白鎳柱純化SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of recombinant Bm11721 protein purified by Nickel column. M: protein marker (standard); CL: precipitate of recombinant E. coli after ultrasonic treatment; FT: flow-through; BB: binding buffer.

圖4　Bm11721基因在不同組織中的表達(dá)譜Fig. 4 Expression profile of Bm11721 in different tissues. M: trans2K plus DNA marker; Go: gonad; He: head; Cu: cuticle; Mg: midgut; Mt: malpighian tube; Fb: fat body; Hc: hemocyte; Asg: anterior silk gland; Msg: middle silk gland; Psg: posterior silk gland.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Bm11721蛋白的表達(dá)情況，我們抽提了家蠶5齡第3天、第5天和上蔟期各組織器官的總蛋白，用制備的Bm11721多克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。結(jié)果顯示，Bm11721也只在前部絲腺高量特異表達(dá)，這與mRNA結(jié)果一致 (圖5)。利用熒光定量PCR的方法檢查了Bm11721基因在家蠶5齡期幼蟲(chóng)中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Bm11721基因的表達(dá)量在5齡期幼蟲(chóng)中呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì) (圖6A)。同時(shí)我們也檢測(cè)了該蛋白5齡期在前部絲腺表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Bm11721在5齡期前部絲腺的表達(dá)量基本趨于穩(wěn)定 (圖6B)。

圖5　Bm11721蛋白的組織表達(dá)譜Fig. 5 Tissue expression profile of Bm11721 protein. (A) 3rd day of 5th instar. (B) 5th day of 5th instar. (C) wandering stage. 1: head; 2: cuticle; 3: midgut; 4: malpighian tube; 5: fat body; 6: gonad; 7: anterior silk gland; 8: middle silk gland; 9: posterior silk gland.

圖6　Bm11721的時(shí)期表達(dá)譜Fig. 6 Expression profile of Bm11721 during 5 instar. (A) Expression profile of Bm11721 gene during 5 instar. (B) Expression profile of Bm11721 protein during 5 instar. 1–7: 1st –7th day of 5th instar larvae; 8: 0 day after wandering.

為了確定該蛋白在前部絲腺發(fā)揮功能的具體位置，我們選取了家蠶幼蟲(chóng)5齡第3天的前部絲腺對(duì)該蛋白進(jìn)行了免疫熒光定位。家蠶前部絲腺由外膜、腺細(xì)胞、細(xì)胞膜、內(nèi)膜、腺腔、絲膠和絲素幾部分構(gòu)成[4](圖7A仿自蠶體解剖生理學(xué)，1–7)，免疫熒光定位結(jié)果顯示，Bm11721蛋白定位在前部絲腺的內(nèi)膜 (圖7B)。

圖7　Bm11721蛋白在前部絲腺的免疫熒光定位分析Fig. 7 Immunofluorescence analysis of Bm11721 protein in ASG. (A) The transverse schematic diagram of anterior silk gland, picture was cited from anatomy and physiology of silkworm. 1: epicardial; 2: glandular cells; 3: membrane; 4: endometrial; 5: luminal; 6: sericin; 7: fibroin. (B) Immunofluorescence localization of Bm11721. Eg: experimental group; Cg: control group. The nuclei are labeled blue with DAPI and Bm11721 are lable in red.

3　討論

家蠶作為重要的經(jīng)濟(jì)性昆蟲(chóng)，最大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于其能夠生產(chǎn)出具有優(yōu)良性能的繭絲。絲腺是絲蛋白合成和分泌的場(chǎng)所，根據(jù)其形態(tài)和功能的不同可分為前部、中部和后部絲腺。家蠶的前部絲腺是絲蛋白由液態(tài)向固態(tài)轉(zhuǎn)變的場(chǎng)所，在絲蛋白轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，前部絲腺腺腔提供的摩擦剪切力對(duì)絲蛋白的轉(zhuǎn)變起著至關(guān)重要的作用[2]。本研究通過(guò)幾丁質(zhì)親和層析的方法對(duì)家蠶前部絲腺幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選，并用MALDI-TOF/TOF的方法鑒定到一個(gè)新的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，將其命名為Bm11721。通過(guò)RT-PCR和Western blotting分別對(duì)其在5 齡第3天各組織mRNA和蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了分析，并同時(shí)對(duì)5齡第5天和熟蠶期Bm11721蛋白的各組織表達(dá)情況進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。結(jié)果表明，Bm11721無(wú)論是在mRNA轉(zhuǎn)錄水平還是在蛋白質(zhì)水平均只在前部絲腺特異表達(dá)。5齡期是絲蛋白高速合成，并在5齡后期構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變的時(shí)期，本研究結(jié)果顯示Bm11721基因在5齡期的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而B(niǎo)m11721蛋白在5齡期的前部絲腺中表達(dá)量降低并不明顯，且基本趨于穩(wěn)定。推測(cè)可能是由于該蛋白是前部絲腺重要的結(jié)構(gòu)蛋白，雖然mRNA的表達(dá)量有所下降，但蛋白水平卻有一個(gè)不斷累積更新的過(guò)程，故表達(dá)量基本趨于穩(wěn)定，這也暗示該蛋白在絲蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)變過(guò)程中可能起到一定的作用。

研究表明，一些昆蟲(chóng)表皮蛋白能通過(guò)它們的親水區(qū)與幾丁質(zhì)結(jié)合，形成幾丁質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合體，保證體壁的機(jī)械作用[20]。家蠶絲腺壁由底膜 (亦稱外膜)、腺細(xì)胞及內(nèi)膜三層構(gòu)成，內(nèi)膜主要由表皮蛋白和幾丁質(zhì)組成，且前部絲腺的內(nèi)膜較厚。本研究結(jié)果表明Bm11721蛋白定位在前部絲腺的內(nèi)膜，提示其可能與幾丁質(zhì)一起參與了前部絲腺內(nèi)膜的形成，可能與前部絲腺的機(jī)械硬度有關(guān)。和蜘蛛的紡絲管道一樣，家蠶前部絲腺是一對(duì)含有大量幾丁質(zhì)并逐漸變細(xì)的管道[18]。正是這個(gè)逐漸變細(xì)并含有大量幾丁質(zhì)的管腔結(jié)構(gòu)為絲蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)變提供了原始的剪切力。絲蛋白從中部絲腺進(jìn)入到前部絲腺后，隨著前部絲腺管腔的逐漸變細(xì)，紡絲管道所提供的剪切力逐漸變大，當(dāng)?shù)竭_(dá)一個(gè)臨界點(diǎn)后絲蛋白開(kāi)始脫水并發(fā)生凝聚，絲蛋白的構(gòu)象也隨之發(fā)生改變[2]。而在前部絲腺中剪切力的提供主要是由于紡絲管道的逐漸變細(xì)的特殊的結(jié)構(gòu)，幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白所形成的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)保證了前部絲腺為剪切力的提供所需要的機(jī)械硬度[17]，這也有力地保證了前部絲腺細(xì)胞能為絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變提供剪切力。研究表明蜘蛛絲纖維產(chǎn)生過(guò)程中剪切力能夠誘導(dǎo)絲蛋白從液態(tài)的蛋白質(zhì)凝膠轉(zhuǎn)變成最終的固態(tài)絲纖維[21-22]。有研究者對(duì)重組的蜘蛛大壺狀腺絲蛋白體外施加剪切力，能夠誘導(dǎo)重組蛋白的凝膠化[23-24]。Holland等通過(guò)對(duì)家蠶5齡第7天絲腺溶出蛋白施加剪切力，發(fā)現(xiàn)凝膠蛋白發(fā)生有序的排列并呈絲原纖維狀，表明天然的絲蛋白受到剪切力的誘導(dǎo)時(shí)，能夠發(fā)生自組裝成絲原纖維[25]。前部絲腺內(nèi)膜是與絲蛋白直接接觸的結(jié)構(gòu)，為絲蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變提供了剪切力的同時(shí)也保護(hù)了前部絲腺細(xì)胞免受剪切力的破壞[5]。對(duì)前部絲腺內(nèi)膜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的研究，也為在體內(nèi)條件下研究剪切力對(duì)絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響提供了新的參考。

本研究在家蠶前部絲腺篩選并鑒定到一個(gè)新的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，對(duì)該蛋白基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)并制備了多克隆抗體，通過(guò)組織和時(shí)期表達(dá)分析及免疫熒光定位分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白只在前部絲腺特異表達(dá)，在5齡期家蠶前部絲腺中表達(dá)量趨于穩(wěn)定，并且定位在前部絲腺的內(nèi)膜。推測(cè)這個(gè)蛋白可能通過(guò)與幾丁質(zhì)結(jié)合，為絲蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變提供了剪切力。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

食品生物技術(shù)

Identification and expression patterns of anterior silk gland specific cuticle protein Bm11721 in the silkworm (Bombyx mori)

Kang Xie, Xin Wang, Huifang Chen, Yi Li, Qianru Song, and Ping Zhao
Southwest University, State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400716, China

Abstract:The silk gland of silkworm is the organ of silk protein synthesis and secretion. According to the morphological and functional differences, silk gland can be divided into anterior silk gland (ASG), middle silk gland (MSG) and posterior silk gland (PSG). ASG is the place for silk proteins conformation changes although it cannot synthetize silk proteins. ASG has narrow luminal structures and rigid wall which consists of chitin and cuticle proteins so that it can provide the shearing force which plays an important role in the silk protein conformation changes. The objective of this study is to identify the new chitin binding proteins in ASG of silkworm (Bombyx mori), and to analyze their expression patterns in different tissues. We identified a cuticle protein with chitin binding domain Bm11721 (GenBank Accession No. NM-001173285.1) by chitin affinity chromatography column. We also expressed the recombinant protein as inclusion body using the prokaryotic expression system, and then successfully purified the recombinant protein by nickel affinity chromatography column to generate the polyclonal antibodies. The expression patterns analysis in various tissues showed that both in transcriptional and protein levels Bm11721 was specifically expressed in ASG. Furthermore, the expression level of Bm11721 protein was unchanged during the 5th instar. Immunofluorescence analysis revealed that Bm11721 was located in the ASG inner membrane. It is proposed that Bm11721 is a component of inner membrane and probably provides the shearing force for conformational changes.

Keywords:Bombyx mori, anterior silk gland, chitin binding protein, tissue expression profile, immunofluorescence localization

DOI:10.13345/j.cjb.150121

Corresponding author:Ping Zhao. Tel: +86-23-68250885; E-mail: zhaop@swu.edu.cn