李陽(yáng)，朱俊歌，王建軍，夏煥章，吳勝

1 沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)和生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 1100162 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

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組合蛋白質(zhì)工程和代謝工程設(shè)計(jì)全細(xì)胞催化劑合成靛藍(lán)和靛玉紅

李陽(yáng)1,2，朱俊歌2，王建軍2，夏煥章1，吳勝2

1 沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)和生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016
2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

李陽(yáng), 朱俊歌, 王建軍, 等. 組合蛋白質(zhì)工程和代謝工程設(shè)計(jì)全細(xì)胞催化劑合成靛藍(lán)和靛玉紅. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 41–50.

Li Y, Zhu JG, Wang JJ, et al. Biosynthesis of indigo and indirubin by whole-cell catalyst designed by combination of protein engineering and metabolic engineering. Chin J Biotech, 2016, 32(1): 41–50.

摘 要:從嗜高溫放線菌Thermobifida fusca中分離得到的苯基丙酮單加氧酶主要催化芳香族化合物的Baeyer-Villiger氧化反應(yīng)。對(duì)該酶的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)位于底物結(jié)合口袋的Met446位點(diǎn)突變可以賦予突變酶催化C-H鍵活化的新功能，氧化吲哚合成靛藍(lán)和靛玉紅，但產(chǎn)量?jī)H為1.89 mg/L。為了獲得合成靛藍(lán)和靛玉紅的全細(xì)胞催化劑，直接補(bǔ)加吲哚并不能提高細(xì)胞合成效率，補(bǔ)加吲哚的前體物質(zhì)L-色氨酸可以使細(xì)胞合成靛藍(lán)和靛玉紅的能力提高4.5倍，達(dá)到8.43 mg/L。為了進(jìn)一步提高細(xì)胞的生物合成效率，通過代謝工程改造大腸桿菌的糖代謝途徑，阻斷葡萄糖異構(gòu)酶基因pgi，使磷酸戊糖途徑代替糖酵解途徑成為葡萄糖的主要代謝通路，從而為細(xì)胞提供更多氧化吲哚所需的輔因子NADPH，導(dǎo)致細(xì)胞合成靛藍(lán)和靛玉紅的效率進(jìn)一步提高3倍，達(dá)到25 mg/L。通過組合蛋白質(zhì)工程和代謝工程設(shè)計(jì)全細(xì)胞催化劑不僅可以高效地合成靛藍(lán)和靛玉紅，而且設(shè)計(jì)理念為相關(guān)全細(xì)胞催化劑的開發(fā)提供了一種新的策略。

關(guān)鍵詞:靛藍(lán)，靛玉紅，苯基丙酮單加氧酶，蛋白質(zhì)工程，代謝工程

Received: March 30, 2015; Accepted: May 15, 2015

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Huanzhang Xia. Tel/Fax: +86-24-23986438; E-mail: xiahz612@sina.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31070718)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所基礎(chǔ)前沿研究項(xiàng)目 (No. KSCX2-EW-J-6) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-06-26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150626.1513.003.html

靛藍(lán) (Indigo)，是最早發(fā)現(xiàn)的天然染料之一，距今已有3 000多年的歷史?！盾髯印駥W(xué)》中有“青，取之于藍(lán)而青于藍(lán)”，此“青”即靛藍(lán)。靛藍(lán)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和日用化妝品的著色等。靛玉紅 (Indirubin)，靛藍(lán)的同分異構(gòu)體，是傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸龍薈丸的有效成分[1]，具有抗癌活性[2-4]。

靛藍(lán)和靛玉紅的生產(chǎn)主要有3種方法：植物提取、化學(xué)合成及微生物轉(zhuǎn)化[5]。植物提取工藝繁瑣，產(chǎn)量低；化學(xué)合成法具有效率高、產(chǎn)品純度高、過程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是目前靛藍(lán)和靛玉紅制備的主要方法。但是，化學(xué)合成使用的催化劑、物料以及副產(chǎn)物具有一定的毒性對(duì)人和環(huán)境帶來危害。自1928年首次報(bào)道靛藍(lán)的微生物合成現(xiàn)象以來，綠色環(huán)保的微生物法合成靛藍(lán)引發(fā)越來越多的關(guān)注[6]。研究發(fā)現(xiàn)許多降解芳香族碳?xì)浠衔锏奈⑸锞哂挟a(chǎn)生靛藍(lán)的能力。具有產(chǎn)生此類異生物質(zhì)的細(xì)菌通常含有雙加氧酶或單加氧酶，例如萘雙加氧酶[7-10]、甲苯雙加氧酶[11]、苯乙烯單加氧酶[12-13]、黃素蛋白單加氧酶[14]和P450單加氧酶[15-16]等。一般認(rèn)為吲哚經(jīng)過酶促氧化生成羥基吲哚，后者自發(fā)縮合生成靛藍(lán)或靛玉紅等產(chǎn)物 (圖1)。通過蛋白質(zhì)工程改造野生酶獲得催化效率大幅提高的突變酶以及通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高生產(chǎn)菌株合成靛藍(lán)能力作為有效的策略應(yīng)用于靛藍(lán)生物合成的實(shí)踐中[17]。

Baeyer-Villiger單加氧酶 (Baeyer-Villiger monooxygenase，BVMO) 是一類含有黃素FAD、NADPH輔因子的重要生物酶催化劑，主要催化羰基類化合物氧化，在羰基和一個(gè)鄰近烴基之間引入一個(gè)氧原子，得到相應(yīng)的酯或內(nèi)酯[18]。BVMO具有催化的不專一性，已報(bào)道這類酶的典型代表環(huán)己酮單加氧酶 (Cyclohexanone monooxygenase，CHMO) 還具有氧化硫、氮等雜原子的能力以及催化碳碳雙鍵環(huán)氧化的能力等[19]。最新的研究發(fā)現(xiàn)苯丙酮單加氧單個(gè)氨基酸的改變導(dǎo)致突變酶擁有氧化酶活力[20]。NADPH是一種昂貴的輔因子，在以制備催化產(chǎn)物為目的的研究中，選擇輔酶再生系統(tǒng)或以全細(xì)胞而非純酶作為催化劑是一種經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的策略[20]。

本研究旨在探索利用蛋白質(zhì)工程改造PAMO，賦予突變酶氧化吲哚合成靛藍(lán)及其衍生物的能力，在此基礎(chǔ)上，通過代謝工程改造大腸桿菌的糖代謝途徑，增加細(xì)胞內(nèi)NADPH濃度，從而設(shè)計(jì)高效的全細(xì)胞催化劑用于合成靛藍(lán)和靛玉紅。

圖1　生物合成靛藍(lán)和靛玉紅Fig. 1 Biosynthesis of indigo and indirubin by indole oxidization pathway.

1　材料與方法

1.1試劑

葡萄糖、氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀購(gòu)自北京化工廠。靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品、吲哚標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京百靈威科技有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京) 有限公司。靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Aladdin。L(-)-Tryptophan購(gòu)自Acros Organics。胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid Company Ltd。KOD Taq DNA聚合酶購(gòu)自日本Toyobo公司。DNA marker，Protein marker，DpnⅠ限制酶購(gòu)自Fermentas。甲醇 (色譜純) 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific。二氯甲烷購(gòu)自Dikma Technologies Inc。二甲基亞砜 (DMSO) 購(gòu)自Merck公司。薄層層析 (TLC) 板購(gòu)自煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司。

TB培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)大腸桿菌。胰蛋白胨12 g，酵母提取物24 g，甘油4 mL溶解于900 mL去離子水中，高壓滅菌后冷卻到60 ℃，再加入100 mL滅菌的磷酸緩沖液 (0.17 mol/L KH2PO4和0.72 mol/L K2HPO4)。

1.2菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli TOP10、E. coli BW25113 (Δpgi)，以及質(zhì)粒pBAD均為本實(shí)驗(yàn)室保存；E. coli TOP10 (Δpgi) 菌株利用P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)E. coli BW25113 (Δpgi) 篩選獲得。E. coli TOP10、E. coli TOP10 (Δpgi) 用于基因克隆和PAMO的表達(dá)，pBAD用于pamo基因 (No. AAZ55526) 的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。

1.3方法

1.3.1同源重組制備E. coli TOP10 (Δpgi)菌株

1) 制備P1噬菌體溶菌產(chǎn)物[21-22]：取E. coli BW25113 (Δpgi) 作為供體菌，在供體菌葡萄糖異構(gòu)酶基因pgi中插入了卡那霉素抗性基因，從而導(dǎo)致pgi失活。接種E. coli BW25113 (Δpgi)于含25 μg/mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。取50 μL過夜培養(yǎng)物加入到5 mL補(bǔ)加有20%葡萄糖，25 μL濃度為1 mol/L的CaCl2的LB液體培養(yǎng)基中，然后加入100 μL 109?1010PFU/mL P1噬菌體，繼續(xù)培養(yǎng)直到細(xì)胞溶解，加入氯仿繼續(xù)振蕩幾分鐘，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清備用。

2) P1轉(zhuǎn)導(dǎo)[21-22]：取E. coli TOP10作為受體菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。取1.5 mL于室溫下離心，棄上清。加入750 μL上述制備的P1溶菌產(chǎn)物重懸細(xì)胞，室溫下噬菌體吸附30 min。加入終濃度為0.2 mol/L的檸檬酸鈉1 mL。37 ℃培養(yǎng)1 h。取1.5 mL菌液離心，棄上清。用100 μL Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)重懸細(xì)胞，涂布到含有25 μg/mL卡那霉素抗性平板上，培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落劃線培養(yǎng)，連續(xù)5次傳代后隨機(jī)挑取克隆，備份并提取其基因組為模板，用pgi引物擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后證明其中含有完整的卡那抗性基因，從而獲得E. coli TOP10 (Δpgi) 菌株。

1.3.2M446位點(diǎn)飽和突變體的構(gòu)建

引物設(shè)計(jì)如表1所示，用于構(gòu)建Met446位點(diǎn)的飽和突變體，模板為pPAMO，PCR體系和程序見參考文獻(xiàn)[18]。

表1　引物名稱及序列Table 1 Primer name and primer sequence

所得PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ消化2.5 h，去除模板DNA。然后采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化后的PCR產(chǎn)物用化學(xué)轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化入E. coli TOP10和E. coli TOP10 (Δpgi) 中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上 (轉(zhuǎn)入TOP10表達(dá)體系時(shí)涂布于100 μg/mL氨芐青霉素抗性平板上；轉(zhuǎn)入TOP10 (Δpgi) 表達(dá)體系時(shí)涂布于100 μg/mL氨芐青霉素和25 μg/mL卡那霉素抗性平板上)，37 ℃過夜培養(yǎng)得到突變文庫(kù)，隨機(jī)挑取克隆，測(cè)序獲得446位點(diǎn)的其他19種突變體，甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)

10 μL甘油保存的菌體接到5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，1%轉(zhuǎn)至200 mL TB培養(yǎng)基 (根據(jù)宿主菌不同加入相應(yīng)抗生素)，同時(shí)加入0.01%的L-阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.4細(xì)胞及產(chǎn)物處理

由于靛藍(lán)為細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)物，水溶性差，發(fā)酵上清液中含量甚微，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物的積累會(huì)在搖甁底部析出。因此培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)物經(jīng)5 000 r/min、10 ℃離心7 min，棄上清，用15 mL Tris-HCl緩沖液 (50 mmol/L，pH 8.0) 重懸，然后在冰浴中用超聲波破碎細(xì)胞60 min，工作條件：功率300 W，工作2 s，間歇2 s。經(jīng)破碎后的懸液用二氯甲烷萃取3遍，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，用二甲基亞砜 (DMSO) 溶解制備樣品備用。

1.3.5薄層層析分析方法

將上述處理好的樣品稀釋后用毛細(xì)管點(diǎn)樣于硅膠薄層板上，展開劑為苯∶氯仿∶丙酮=5∶4∶1[23]，溶劑前沿到達(dá)距薄層板頂端2 cm左右時(shí)取出，置通風(fēng)櫥里吹干，254 nm紫外燈下檢測(cè)。

1.3.6最大紫外吸收法定量

將靛藍(lán)和靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品置于分光光度儀(Spectrophotometer Beckman Counter DU800)下進(jìn)行200–800 nm全波長(zhǎng)掃描，測(cè)得靛玉紅的最大吸收在549 nm，靛藍(lán)的最大吸收在618 nm。取靛藍(lán)和靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度梯度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得靛玉紅和靛藍(lán)在各自最大吸收波長(zhǎng)下的消光系數(shù)分別為27.2和8.96 L/(mmol·cm)。根據(jù)朗伯比爾定律(A=εcl) 對(duì)其產(chǎn)量進(jìn)行定量。

1.3.7高效液相法定性定量分析

采用Waters超高效液相色譜儀Acouity UPLC進(jìn)行分析，反相色譜柱C18 (Symmetry，5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相為甲醇/水，線性梯度60/40–70/30，流速為0.8 mL/min。取靛藍(lán)和靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度梯度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測(cè)得的樣品數(shù)值代入回歸方程，確定其濃度。

2　結(jié)果與討論

2.1靛藍(lán)和靛玉紅的鑒定

2.1.1薄層層析初步鑒定化合物

在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)非保守的Hinge結(jié)構(gòu)對(duì)PAMO的催化活性和立體選擇性有非常大的影響[24]。在進(jìn)一步研究PAMO 底物結(jié)合口袋周圍氨基酸殘基對(duì)酶催化行為影響時(shí)，通過構(gòu)建丙氨酸掃描突變體 (L153A、Q152A、S196A、W501A、M446A、D66A、M515A等)，測(cè)試突變對(duì)酶催化活力、對(duì)映選擇性等的影響時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)M446A突變體在大腸桿菌TOP10細(xì)胞表達(dá)體系培養(yǎng)過程中發(fā)酵液變成了淺藍(lán)色，萃取后通過薄層層析的方法初步鑒定該化合物。發(fā)現(xiàn)在藍(lán)色斑點(diǎn)的下方出現(xiàn)了玫紅色的斑點(diǎn)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[25-26]，以靛藍(lán)、靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，薄層板上Rf值基本一致，初步確定這種物質(zhì)是靛藍(lán)和靛玉紅的混合物 (圖2)。

圖2　薄層層析分析靛藍(lán)和靛玉紅Fig. 2 Analysis of indigo and indirubin by thin-layer chromatography. Lane 1 is the sample, M1 and M2 are indigo standard and indirubin standard, respectively.

2.1.2高效液相色譜法和質(zhì)譜分析產(chǎn)物

結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC和MS分析發(fā)現(xiàn)淺藍(lán)色的培養(yǎng)物中含有吲哚、靛藍(lán)、靛玉紅和靛紅 (表2)。靛紅是靛藍(lán)和靛玉紅的降解產(chǎn)物。體外穩(wěn)定性分析表明靛藍(lán)在室溫下放置非常不穩(wěn)定，很容易分解，靛玉紅相對(duì)比較穩(wěn)定。

2.1.3靛藍(lán)和靛玉紅的產(chǎn)量隨時(shí)間變化趨勢(shì)

靛藍(lán)和靛玉紅互為同分異構(gòu)體，靛藍(lán)是由兩分子3-羥基吲哚聚合而成，靛玉紅是由一分子2-羥基吲哚和一分子3-羥基吲哚聚合而成。HPLC分析未檢測(cè)到2-羥基吲哚和3-羥基吲哚，可能是含量非常低的原因。為了研究E. coli TOP10 (pPAMO) 突變體細(xì)胞M446A生長(zhǎng)過程與靛藍(lán)和靛玉紅生物合成之間的相互關(guān)系，取同批次發(fā)酵6、12、18、24、36、42 h發(fā)酵液，萃取處理后，測(cè)定靛藍(lán)和靛玉紅的生成量。據(jù)圖3曲線所示，靛藍(lán)在發(fā)酵6 h左右開始出現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，靛藍(lán)的產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵24 h左右產(chǎn)量達(dá)到最大 (1.3 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)靛藍(lán)的產(chǎn)量反而下降。靛玉紅的出現(xiàn)比靛藍(lán)晚大約6 h，在發(fā)酵12 h后開始出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，靛玉紅的產(chǎn)量增加，但當(dāng)發(fā)酵36 h時(shí)，產(chǎn)量最高 (0.3 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)量也出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，相對(duì)靛藍(lán)，靛玉紅的分解趨勢(shì)明顯偏低，表明其相對(duì)靛藍(lán)較為穩(wěn)定，這與前面體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表2　M446A培養(yǎng)物中的產(chǎn)物分析Table 2 Major compounds in the culture of M446A mutant

圖3　靛藍(lán)和靛玉紅的生成量隨時(shí)間變化的曲線Fig. 3 The production profile of indigo and indirubin during the growth process of E. coli TOP10 (pPAMO) muant M446A.

2.2構(gòu)建飽和突變體

以前的文獻(xiàn)報(bào)道中提到Met446Gly突變酶具有合成靛藍(lán)的能力[19]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明446位點(diǎn)Met突變?yōu)锳la不僅賦予了PAMO氧化吲哚合成靛藍(lán)的能力，同時(shí)也具有合成靛玉紅的能力。為了探索該位點(diǎn)其他氨基酸的存在如何影響酶催化氧化吲哚的效力以及形成最終縮合產(chǎn)物的差異，通過飽和突變的方法構(gòu)建了該位點(diǎn)的其他19種氨基酸突變體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，培養(yǎng)24 h后，測(cè)定生成的靛藍(lán)和靛玉紅產(chǎn)量。靛藍(lán)和靛玉紅的最大吸收波長(zhǎng)分別為618 nm和549 nm，在最大吸收波長(zhǎng)下，二者沒有干擾。紫外-可見光分光光度法較HPLC用于定量分析更為簡(jiǎn)便快捷。利用標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試結(jié)果表明，兩種方法所檢測(cè)的結(jié)果是一致的。所以在實(shí)際的定量檢測(cè)中，選擇紫外-可見光分光光度法測(cè)定靛藍(lán)和靛玉紅的含量。定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示M446A、M446G活性較高。M446C和M446S也有微弱的活性，其他突變體活性很低或者基本沒有活性，各突變體產(chǎn)生靛藍(lán)和靛玉紅的活性對(duì)比匯總見圖4。Met446是底物結(jié)合口袋的組成單元，但并不直接與底物發(fā)生相互作用。甲硫氨酸變成分子較小的丙氨酸或甘氨酸等后，使得底物結(jié)合口袋構(gòu)象發(fā)生變化，能夠使吲哚以一種新的方式進(jìn)入到底物口袋，其吡咯環(huán)中C2–C3之間的雙鍵更容易受到FAD C4α部位形成的過氧中間體攻擊，從而發(fā)生反應(yīng)，最終形成2-位和3-位發(fā)生氧化的產(chǎn)物。2-羥基吲哚和3-羥基吲哚通過分子間縮合反應(yīng)聚合形成靛玉紅，兩分子3-羥基吲哚聚合形成靛藍(lán)，目前普遍認(rèn)為此縮合反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的。

圖4　PAMO野生型與M446位點(diǎn)突變體生成靛藍(lán)和靛玉紅活性對(duì)比Fig. 4 Comparison of the productivity of indigo and indirubin producing by PAMO-WT and M446 mutants.

2.3補(bǔ)加前體物質(zhì)提高靛藍(lán)和靛玉紅的產(chǎn)量

盡管PAMO的突變體可以合成靛藍(lán)和靛玉紅，但產(chǎn)量并不高，每升培養(yǎng)液可以生成總量約2.0 mg的靛藍(lán)和靛玉紅，效率很低。因?yàn)檫胚崾呛铣傻逅{(lán)和靛玉紅的前體物質(zhì)，為了提高生成效率，嘗試在培養(yǎng)基中直接添加不同濃度的吲哚，發(fā)現(xiàn)沒有明顯地促進(jìn)靛藍(lán)和靛玉紅產(chǎn)量增加的作用，實(shí)際上過量的吲哚加入導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。這可能與吲哚的低溶解度和對(duì)細(xì)胞的毒性有關(guān)[26]。靛藍(lán)和靛玉紅合成的前體物質(zhì)是吲哚，細(xì)胞中吲哚主要來自于色氨酸的分解代謝。色氨酸酶在色氨酸分解代謝中扮演著主要的角色，大腸桿菌的色氨酸酶的轉(zhuǎn)錄非常活躍，這與TB培養(yǎng)基中色氨酸的含量比較豐富有關(guān)。既然直接添加吲哚無(wú)益于靛藍(lán)和靛玉紅的生物合成，因此嘗試加入吲哚的前體物質(zhì)色氨酸作為補(bǔ)料物質(zhì)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中直接添加色氨酸，并設(shè)置不同的濃度梯度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明色氨酸的最佳添加量4 mmol/L。由表3可見，在一定范圍內(nèi)隨著色氨酸濃度的提高，細(xì)胞產(chǎn)生靛藍(lán)和靛玉紅的能力也加強(qiáng)，當(dāng)色氨酸的終濃度達(dá)到4 mmol/L，產(chǎn)量最高。進(jìn)一步增加色氨酸終濃度時(shí)，可能是由于吲哚的積累，抑制了細(xì)胞的活性[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明補(bǔ)加4 mmol/L色氨酸，可以使細(xì)胞合成靛藍(lán)和靛玉紅的能力提高4.5倍，達(dá)到8.43 mg/L。

表3　色氨酸對(duì)生物合成靛藍(lán)和靛玉紅產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of tryptophan on the production of indigo and indirubin

2.4利用代謝工程改造宿主菌提高靛藍(lán)和靛玉紅的產(chǎn)量

PAMO是一種依賴NADPH的單加氧酶，經(jīng)NADPH還原后的FAD能夠與氧氣分子發(fā)生反應(yīng)，生成過氧化的FAD中間體，該中間體具有非常高的氧化活性[27]。NADPH即是一種輔因子，也是BVMO氧化反應(yīng)的一種底物，因此推測(cè)如果能夠提高細(xì)胞內(nèi)NADPH的水平則有可能提高細(xì)胞氧化吲哚的能力，從而提高生物合成靛藍(lán)和靛玉紅的產(chǎn)量。細(xì)胞內(nèi)NADPH的主要來源是葡萄糖代謝，它不僅能提供能源，參與某些酶促反應(yīng)，還能提供物質(zhì)合成所必需的還原能力。因此我們想到了通過改變代謝途徑來積累細(xì)胞內(nèi)NADPH含量的方法。

糖酵解途徑是絕大多數(shù)生物所共有的一條主流代謝途徑。一分子葡萄糖為底物，經(jīng)耗能和產(chǎn)能兩階段產(chǎn)生兩分子丙酮酸、兩分子NADH和兩分子ATP的生化反應(yīng)過程。磷酸戊糖途徑是葡萄糖氧化分解的另一種方式。由于此途徑是由6-磷酸葡萄糖開始，最終生成的3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖重新進(jìn)入糖酵解途徑，故也稱為己糖磷酸旁路，該途徑是細(xì)胞內(nèi)NADPH的主要來源 (圖5)。

圖5　大腸桿菌代謝葡萄糖途徑簡(jiǎn)圖Fig. 5 Glucose metabolism pathway in E. coli. E. coli utilizes glucose to produce cofactor NADH through glycolysis pathway, and produce NADPH by pentose phosphate pathway (PP) pathway. Metabolizing one molecule of glucose by PP pathway yields two molecule of NADPH.

通過同源重組的方法阻斷糖酵解途徑的葡萄糖異構(gòu)酶基因pgi，阻斷糖酵解途徑使細(xì)胞內(nèi)糖的代謝以磷酸戊糖途徑為主流代謝途徑，后者是細(xì)胞合成NADPH的主要來源。結(jié)果表明經(jīng)過代謝工程改造后大腸桿菌TOP10 (Δpgi) 作為宿主菌，同時(shí)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度為4 mmol/L的色氨酸，合成靛藍(lán)和靛玉紅的能力得到進(jìn)一步的提升，達(dá)到25 mg/L。對(duì)宿主菌的代謝工程改造，使得全細(xì)胞合成靛藍(lán)和靛玉紅的能力進(jìn)一步提高3倍。

綜上所述，蛋白質(zhì)工程改造賦予PAMO全新的催化活力，氧化吲哚合成靛藍(lán)和靛玉紅。在此基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)過程中補(bǔ)加前體物質(zhì)色氨酸以及通過代謝工程改造宿主菌都大幅度地提高了全細(xì)胞生物合成靛藍(lán)和靛玉紅的能力。圖6展示了PAMO突變體M446A發(fā)酵瓶 (6A) 與補(bǔ)加4 mmol/L色氨酸發(fā)酵瓶 (6B) 以及補(bǔ)加4 mmol/L色氨酸同時(shí)使用代謝工程改造后宿主菌發(fā)酵瓶(6C) 效果對(duì)比圖，發(fā)酵液顏色逐漸變深，直觀地表明靛藍(lán)和靛玉紅的產(chǎn)量變化趨勢(shì)。

圖6　M446A在不同條件下，發(fā)酵培養(yǎng)基顏色對(duì)比Fig. 6 Color comparison of the mutant M446A fermentation medium under different conditions. (A) General M446A fermentation bottle. (B) Fermentation bottle adding 4 mmol/L L-tryptophan. (C) Fermentation bottle adding 4 mmol/L L-tryptophan as well as using genetically modified E. coli host.

3　結(jié)論

蛋白質(zhì)工程是一種用于研究蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系非常有效的策略，如改變酶已有的各種催化行為，賦予酶新的催化活力等。本研究所用的苯基丙酮單加氧酶PAMO主要功能是催化羰基化合物氧化，活化C-C鍵，在此我們展示了通過工程化改造其底物結(jié)合口袋，發(fā)現(xiàn)Met446位點(diǎn)氨基酸殘基的改變賦予酶C-H鍵氧化活力，催化吲哚生成靛藍(lán)和靛玉紅。為了進(jìn)一步提高全細(xì)胞合成靛藍(lán)和靛玉紅的生成效率，在蛋白質(zhì)工程改造獲得新酶活的基礎(chǔ)上，組合使用了前體補(bǔ)加以及對(duì)宿主菌進(jìn)行代謝工程改造的研究策略，設(shè)計(jì)出一種全細(xì)胞催化劑可以高效地合成靛藍(lán)和靛玉紅，每升發(fā)酵液可以生成25 mg產(chǎn)物。這種多策略組合使用設(shè)計(jì)高效全細(xì)胞催化劑的理念為全細(xì)胞催化劑的開發(fā)研究提供了一種新的思路。有關(guān)苯基丙酮單加氧酶催化氧化C—H鍵活化的分子機(jī)制研究正在進(jìn)行中。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Biosynthesis of indigo and indirubin by whole-cell catalyst designed by combination of protein engineering and metabolic engineering

Yang Li1,2, Junge Zhu2, Jianjun Wang2, Huanzhang Xia1, and Sheng Wu2
1 School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, Liaoning, China
2 State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Abstract:The phenylacetone monooxygenase, isolated from Thermobifida fusca, mainly catalyzes Baeyer-Villiger oxidation reaction towards aromatic compounds. Met446 plays a vital role in catalytic promiscuity, based on the structure and function of phenylacetone monooxygenase. Mutation in Met446 locus can offer enzyme new catalytic feature to activate C—H bond, oxidizing indole to finally generate indigo and indirubin, but the yield was only 1.89 mg/L. In order to further improve the biosynthesis efficiency of the whole-cell catalyst, metabolic engineering was applied to change glucose metabolism pathway of Escherichia coli. Blocking glucose isomerase gene pgi led to pentose phosphate pathway instead of the glycolytic pathway to become the major metabolic pathways of glucose, which provided more cofactor NADPH needed in enzymatic oxidation of indole. Engineering the host E. coli led to synthesis of indigo and indirubin efficiency further increased to 25 mg/L. Combination of protein and metabolic engineering to design efficient whole-cell catalysts not only improves the synthesis of indigo and indirubin, but also provides a novel strategy for whole-cell catalyst development.

Keywords:indigo, indirubin, phenylacetone monooxygenase, protein engineering, metabolic engineering

DOI:10.13345/j.cjb.150137

Corresponding authors: Sheng Wu. Tel: +86-10-62628482; Fax: +86-10-64807429; E-mail: shengwu@im.ac.cn