柯丕余，黃俊，胡升，趙偉睿，呂常江，郁凱，雷引林，王進(jìn)波，梅樂(lè)和,

1 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 3100272 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 3100233 浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315100

?

應(yīng)用拉氏圖信息提高短乳桿菌谷氨酸脫羧酶催化性能

柯丕余1，黃俊2，胡升3，趙偉睿1，呂常江1，郁凱1，雷引林3，王進(jìn)波3，梅樂(lè)和1,3

1 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310027
2 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023
3 浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315100

柯丕余, 黃俊, 胡升, 等. 應(yīng)用拉氏圖信息提高短乳桿菌谷氨酸脫羧酶催化性能. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 31–40.

Ke PY, Huang J, Hu S, et al. Enhancing glutamate decarboxylase activity by site-directed mutagenesis: an insight from Ramachandran plot. Chin J Biotech, 2016, 32(1): 31–40.

摘 要:谷氨酸脫羧酶 (Glutamate decarboxylase，GAD) 是用于催化L-谷氨酸脫羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate，GABA) 的唯一酶，提高GAD的催化活力或熱穩(wěn)定性，有利于GABA的高效制備和生產(chǎn)。以熱穩(wěn)定性和活性為篩選目標(biāo)，通過(guò)研究短乳桿菌GAD1407三維模擬結(jié)構(gòu)的拉氏圖，確定不穩(wěn)定氨基酸殘基位點(diǎn)K413，采用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建該位點(diǎn)的突變體，并測(cè)定野生型酶和突變酶的熱穩(wěn)定性和活力。結(jié)果表明突變酶K413A和突變酶K413I分別在熱穩(wěn)定性和酶活力上獲得了提高，突變酶K413A在50 ℃的半衰期為105 min，是野生酶的2.1倍；突變酶K413I熱穩(wěn)定性沒有明顯的提高，但其酶活力卻得到了有效提高，約為野生型的1.6倍。因此，通過(guò)拉氏圖提供的結(jié)構(gòu)信息可為利用理性設(shè)計(jì)提高GAD活性和熱穩(wěn)定性提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞:谷氨酸脫羧酶，蛋白質(zhì)工程，γ-氨基丁酸，拉氏圖

Received: March 25, 2015; Accepted: April 27, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21176220, 31240054, 31470793), Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. Z13B060008), Natural Science Foundation of Ningbo (No. 2013A610087).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 21176220, 31240054, 31470793)，浙江省自然科學(xué)基金 (No. Z13B060008)，寧波市自然科學(xué)基金 (No. 2013A610087) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-05-25 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150525.1045.002.html

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA)是一種天然存在的非蛋白氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種十分重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、利尿、抗驚厥、預(yù)防癲癇、改善睡眠、抗抑郁、促進(jìn)激素分泌和保肝利腎等多種生理功能[1-2]。在工業(yè)應(yīng)用中，GABA可作為中間體來(lái)生產(chǎn)可降解生物塑料尼龍-4[3]以及N-吡咯烷酮[4]等化工產(chǎn)品。目前，GABA的制備方法主要有化學(xué)合成法、植物富集法和微生物轉(zhuǎn)化法，由于微生物轉(zhuǎn)化法具有生產(chǎn)周期短、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)量高以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因此利用GAD或具有該酶活力的細(xì)胞進(jìn)行GABA的生物制備具有重要的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值[5-6]。谷氨酸脫羧酶 (Glutamate decarboxylase，GAD；EC 4.1.1.15) 可以磷酸吡哆醛 (PLP) 為輔酶專一性地催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧生成γ-氨基丁酸[7]。但由于天然的谷氨酸脫羧酶存在酶活低和熱穩(wěn)定性差的缺陷，在實(shí)際應(yīng)用中受到了很大的限制。

對(duì)天然酶的理化性質(zhì)進(jìn)行改造以獲取催化效率更高、選擇性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更好的新酶，對(duì)于酶的工業(yè)應(yīng)用有著十分重要的意義。首先，良好的熱穩(wěn)定性意味著酶不易失活，保存期限更久。其次，耐熱性強(qiáng)和活性高的酶可更廣泛的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。目前已有很多種屬的GAD基因被克隆并重組表達(dá)，對(duì)GAD基因進(jìn)行研究與改造能從本質(zhì)上提高GAD的催化活力和穩(wěn)定性，是提高微生物轉(zhuǎn)化法制備GABA產(chǎn)量最直接和最有效的手段[8-10]。例如，Lin等[11]以短乳桿菌CGMCC No. 1306的GAD為研究對(duì)象，通過(guò)采用易錯(cuò)PCR結(jié)合定點(diǎn)飽和突變的方法，獲得了一個(gè)催化活力得到顯著提高的突變酶Q51H，在pH 4.8時(shí)其催化效率 (kcat/Km) 是野生酶的2.56倍。Shi等[12]通過(guò)對(duì)短乳桿菌Lactobacillus brevis Lb85進(jìn)行易錯(cuò)PCR和定點(diǎn)突變等手段，篩選出GadB1E312S和GadB1T17I/D294G/Q346H突變體，在pH 6.0時(shí)它們的催化效率 (kcat/Km) 分別是野生型的2.30倍和25.26倍，這些突變位點(diǎn)的替換能夠有效地拓寬酶的催化pH范圍和提高其 GABA的合成能力。Jun等[13]對(duì)大腸桿菌Escherichia coli中的GAD 進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)GAD同型六聚體N-末端14個(gè)殘基形成三重螺旋束有助于提高該酶的熱穩(wěn)定性，通過(guò)優(yōu)化N-末端結(jié)構(gòu)域間的疏水和靜電相互作用，突變酶GadB-TMQ5D/V6I/T7E顯示出良好的熱穩(wěn)定性，其半失活溫度 (T5015) 較野生型酶提高7.7 ℃。

在描述肽鍵的剛性和可變程度時(shí)，研究者常運(yùn)用二面角 (φ，ψ) 來(lái)確定α碳原子和肽平面間單鍵的旋轉(zhuǎn)。由于不同氨基酸殘基可允許的φ和ψ值范圍不同，以φ和ψ作為橫縱坐標(biāo)得到的二維圖形稱為拉氏圖 (Ramachandran plot)。由于拉氏圖中不同區(qū)域顯示不同的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，利用這些信息，可以找出蛋白質(zhì)骨架中的不穩(wěn)定殘基位點(diǎn)，并通過(guò)定點(diǎn)突變等方式改善酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變酶活力或者熱穩(wěn)定性[14]。例如，Mahdieh等[15]利用拉氏圖信息尋找Chondroitinase ABCⅠ三維結(jié)構(gòu)中不合理的殘基位點(diǎn)Q140，并對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到的突變酶Q140A在40 ℃下的半衰期為7 min，約為野生型的3.5倍。

作者所在的研究機(jī)構(gòu)在前期研究中已經(jīng)從GABA高產(chǎn)菌株短乳桿菌Lb. brevis CGMCC No. 1306中克隆了GAD1407基因，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的可溶表達(dá)[16]，但該酶尚存在酶活低和熱穩(wěn)定性差的缺陷，為了進(jìn)一步提高其催化性能及熱穩(wěn)定性，本文擬通過(guò)構(gòu)建GAD1407結(jié)構(gòu)拉氏圖，并分析酶分子中氨基酸殘基的構(gòu)象分布，根據(jù)拉氏圖提供的信息，確定了結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定點(diǎn)，結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造，以期提高正突變概率和實(shí)驗(yàn)效率。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1酶與試劑

Fast Digest DpnⅠ限制酶、Fast Pfu DNA聚合酶、1 kb DNA Ladder marker均為TaKaRa公司產(chǎn)品 (寶生物工程 (大連) 有限公司，中國(guó))；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司 (中國(guó))；DNA凝膠回收試劑盒、Ni-NTA層析介質(zhì)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司 (中國(guó))；種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，表達(dá)培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基，均含有50 μg/mL卡那霉素。

1.1.2菌株與質(zhì)粒

表達(dá)宿主菌E. coli BL21 (DE3)、pET28a(+)-GAD1407重組質(zhì)粒為浙江大學(xué)生物工程研究所保藏。

1.1.3培養(yǎng)基與溶液配制

LB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化鈉。

TB培養(yǎng)基：12 g/L胰蛋白胨，24 g/L酵母粉，4 mL/L甘油，17 mmol/L磷酸二氫鉀，72 mmol/L磷酸氫二鉀。

破胞緩沖液 (pH 7.4)：2 mmol/L磷酸二氫鉀，10 mmol/L磷酸氫二鈉，2.7 mmol/L氯化鉀，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，137 mmol/L氯化鈉。

1.2突變文庫(kù)的構(gòu)建

根據(jù)Lb. brevis CGMCC No. 1306的谷氨酸脫羧酶基因設(shè)計(jì)19對(duì)定點(diǎn)突變引物，如表1所示。

以含有GAD1407基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行定點(diǎn)PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：10 μL 5×PCR緩沖液，4 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，1 μL上游引物 (10 mmol/L)，1 μL下游引物 (10 mmol/L)，1 μL質(zhì)粒模板 (50 ng/μL)，F(xiàn)ast Pfu DNA聚合酶5 U，高溫滅菌的超純水補(bǔ)至總體積50 μL。定點(diǎn)PCR擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸4 min。所得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后用DpnⅠ消化0.5 h，消化產(chǎn)物繼續(xù)采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，然后用熱激法將PCR產(chǎn)物以10%比例 (V/V)轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化液涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，即得定點(diǎn)突變文庫(kù)。

1.3野生型酶和突變酶表達(dá)和純化

從19種氨基酸的定點(diǎn)突變文庫(kù)中分別隨機(jī)挑取1–3個(gè)單菌落，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，測(cè)定核苷酸序列，以確定是否全部引入預(yù)期的突變。將經(jīng)測(cè)序鑒定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli BL21 (DE3)中，挑取單菌落接種至含有50 μg/mL卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜，再將此過(guò)夜培養(yǎng)物以2%比例(V/V) 的接種量接種至含50 μg/mL卡那霉素的100 mL的TB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.6–0.8時(shí)，加入適量體積的IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，然后在25 ℃、150 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h后收集菌體。

表1　定點(diǎn)突變引物及其序列Table 1 Primer used for site-directed mutagenesis

1.4粗酶液制備和純化

粗酶液制備：將收集的菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，后用10%發(fā)酵液體積的破胞緩沖液重懸，超聲波破碎細(xì)胞，超聲破胞工作條件為：功率300 W，工作3 s，間歇6 s，循環(huán)90次。經(jīng)破碎后的懸液于10 000 r/min、4 ℃條件下離心處理30 min，收集上清液，即粗酶液。

蛋白純化：采用Ni-NTA親和層析對(duì)所得的粗酶液進(jìn)行分離純化，經(jīng)上樣、清洗和洗脫，收集洗脫液，透析去除小分子得到純酶，采用SDS-PAGE檢測(cè)純化后的蛋白純度。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定純化后的蛋白濃度。

1.5突變文庫(kù)篩選

將上述成功引入目的突變的19種菌株，分別經(jīng)培養(yǎng)、表達(dá)、制備粗酶、純化得到純酶，然后在20 ℃、55 ℃兩個(gè)溫度下處理10 min，冰浴5 min，離心取上清液，測(cè)定野生型和突變酶殘余活力，將55 ℃處理后的比活力對(duì)比20 ℃處理后的比活力，獲得兩個(gè)溫度下的殘余活力比值，篩選出殘余活力比值高于野生型酶殘余活力比值的突變酶。

1.6野生型酶和突變酶酶學(xué)參數(shù)及熱穩(wěn)定性測(cè)定

動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定：用0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液 (pH 4.8) 配制不同濃度 (1–100 mmol/L)的底物L(fēng)-谷氨酸鈉 (L-MSG)，測(cè)定在不同底物濃度條件下的反應(yīng)初速度。將不同底物濃度[S]下對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率[V]代入米氏方程 (1-1)：

通過(guò)Origin 8.0軟件非線性擬合計(jì)算相應(yīng)的Km和Vmax值，然后根據(jù)kcat=Vmax/[E0] ([E0]為酶初始濃度，單位μmol/L) 計(jì)算求得kcat和催化效率kcat/Km。

熱失活的半衰期 (t1/2) 測(cè)定條件：將1 mg/mL的野生型酶或突變酶，分別于PBS緩沖液 (pH 7.4) 中50 ℃條件下保溫不同時(shí)間取樣，測(cè)定殘余酶活，用Origin 8.0軟件擬合熱失活曲線，計(jì)算半衰期t1/2。

比活力：定義為每分鐘每毫克蛋白生成的GABA量。取純化的酶液15 μL (1 mg/mL)，加入400 μL底物溶液中，于48 ℃反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速放入沸水浴中10 min以終止反應(yīng)，然后將樣品離心，收集上清液，采用高效液相色譜法測(cè)定產(chǎn)物中GABA含量，具體參照文獻(xiàn)17。

2　結(jié)果與分析

2.1GAD1407的拉試圖構(gòu)建及分析

根據(jù)郁凱[18]構(gòu)建的GAD1407三維結(jié)構(gòu)模型，如圖1所示是Swiss Model方法建立的結(jié)構(gòu)模型圖。該模型的結(jié)構(gòu)特征主要有以下部分：Lb. brevis CGMCC No. 1306 GAD的整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)α/β折疊類型，共有12個(gè)α-螺旋和4組β-折疊，相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)之間由Loop相連接。此外，利用PROCHECK程序進(jìn)行二面角合理性的評(píng)價(jià)，生成的拉氏圖如圖2所示。

拉氏圖中的每一個(gè)區(qū)域的顏色從深到淺排列的次序依次為最佳合理區(qū) (Most favored regions)、額外合理區(qū) (Additional allowed regions)、一般合理區(qū) (Generously allowed regions) 以及不合理區(qū) (Disallowed regions)。如圖2可知，413位點(diǎn)Lys在MODELLER和Swiss Model兩種建模方法得到的結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)均處于構(gòu)象不穩(wěn)定區(qū)，說(shuō)明413位點(diǎn)的構(gòu)象中非共價(jià)鍵合原子間的距離小于極限距離，斥力很大，構(gòu)象能量高，所以很不穩(wěn)定。此外，由GAD1407的三維結(jié)構(gòu)模擬圖 (圖1) 可知，第413個(gè)位點(diǎn)(Lys) 位于C端的一個(gè)β-轉(zhuǎn)角上，遠(yuǎn)離酶的催化中心 (PLP-Lys279)。

2.2定點(diǎn)突變基因測(cè)序和篩選

從每個(gè)氨基酸相應(yīng)定點(diǎn)突變文庫(kù)中挑取單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序。

將成功引入氨基酸突變的菌株進(jìn)行培養(yǎng)、表達(dá)、純化后，按照1.5突變文庫(kù)初篩，獲得55 ℃處理10 min后野生型酶與突變酶殘余活力對(duì)比圖 (圖3) 以及20 ℃處理10 min后野生型酶與突變酶相對(duì)活力對(duì)比圖 (圖4)。

圖1　GAD1407的三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig. 1 Three-dimensional structures of GAD 1407 by homology modelling. PLP is shown as purple sticks, which forms a Schiff base with Lys 279 (gray sticks), Site 413 (Lys) is shown as blue sticks.

圖2　MODELLER (上) 和Swiss Model (下) 建模結(jié)果的拉氏圖Fig. 2 Ramachandran plot of GAD 1407 model generated by MODELLER (up) and Swiss Model (down).

圖3　55 ℃處理10 min后野生型酶與突變酶活力對(duì)比Fig. 3 The relative activity of wide type and mutant GAD at 55 ℃. Enzymes were heated at 55 ℃ for 10 min, after which residual activities were determined taking L-MSG as substrate. The error bars show standard deviation calculated for three replicate experiments.

圖4　20 ℃處理10 min后野生型酶與突變酶活力對(duì)比Fig. 4 The relative activity of wide type and mutant GAD at 20 ℃. Enzymes were heated at 20 ℃ for 10 min, after which residual activities were determined taking L-MSG as substrate. The error bars show standard deviation calculated for three replicate experiments.

由圖3可知，55 ℃處理10 min后，當(dāng)413位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?(Ala) 時(shí)，突變酶K413A殘余活力約為野生型酶的1.23倍，這說(shuō)明其能有效提高酶在55 ℃條件下的熱穩(wěn)定性。同時(shí)在常溫下，突變酶K413A的活力也是野生型酶的1.35倍。此外，由圖4可知，突變酶K413I在活力上也有很好的提升，其他突變酶在活力上的變化并不明顯。故根據(jù)上面的結(jié)果，篩選出2個(gè)突變體，即突變酶K413I和突變酶K413A，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.3野生型酶和突變酶表達(dá)及純化

根據(jù)2.2中的初篩結(jié)果，突變酶K413A和突變酶K413I分別在耐熱性和酶活力上有一定提高，它們和野生型酶的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，純酶的蛋白質(zhì)分子量大小為56 kDa。

2.4野生型酶和突變酶的熱穩(wěn)定性

考察野生型酶、突變酶K413A和突變酶K413I的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，將純化后的野生型酶、突變酶K413A和突變酶K413I于50 ℃下處理不同的時(shí)間 (0–120 min)，然后置于冰浴中5 min，測(cè)定殘余酶活。用Origin 8.0軟件擬合熱失活曲線，可以看出野生型、突變酶K413A和突變酶K413I的熱穩(wěn)定半衰期分別約為50、105、46 min，說(shuō)明突變酶K413A較野生型熱穩(wěn)定性有了較大提高，而突變酶K413I較野生型熱穩(wěn)定性略微降低 (突變酶K413A>野生型>突變酶K413I)，說(shuō)明在413位點(diǎn)引入丙氨酸可以明顯地提高熱穩(wěn)定性，而將賴氨酸替換成異亮氨酸則有熱穩(wěn)定性降低的趨勢(shì)。

圖5　野生型酶和突變酶的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖Fig. 5 SDS-PAGE analysis of wide type and mutant GAD. M: protein marker; 1: purified wide type; 2: supernatant of wide type; 3: purified K413A; 4: supernatant of K413A; 5: supernatant of K413I; 6: purified K413I.

圖6　野生型酶和突變酶在50 ℃下的熱穩(wěn)定性Fig. 6 Thermostability of wide type and mutant GAD proteins at 50 ℃. Enzymes were heated at 50 ℃ for increasing time, after which residual activities were determined taking L-MSG as substrate. The error bars show standard deviation calculated for three replicate experiments.

2.5野生型酶和突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以L-MSG為底物，在pH 4.8、48 ℃的條件下，分別測(cè)定野生型酶、突變酶K413A和突變酶K413I的米氏動(dòng)力學(xué)常數(shù)。按照1.6所述，在酶含量為1 mg/mL，底物濃度為1?100 mmol/L的條件下測(cè)定催化速率，根據(jù)米氏方程，采用非線性擬合對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算獲得酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。

從表2中可知，突變酶K413A和突變酶K413I的米氏常數(shù)Km值與野生型酶的Km值基本相同，而kcat值均有一定提高，突變酶K413A和突變酶K413I的kcat值分別是野生型酶的133%和167%，此外，酶的催化效率kcat/Km也有不同程度的提升，突變酶K413A和突變酶K413I的kcat/Km分別是野生型酶的139%和156%，其中突變酶K413I的kcat值比野生型酶的kcat值提高了67%，這說(shuō)明突變酶K413I是通過(guò)催化效率的提高而獲得較大的比活力。

表2　野生型酶和突變酶酶學(xué)參數(shù)比較Table 2 Kinetic analysis of wide type and mutant GAD proteins

3　討論

本研究通過(guò)構(gòu)建并分析了GAD1407的結(jié)構(gòu)拉氏圖，發(fā)現(xiàn)413位點(diǎn)Lys在MODELLER和Swiss Model兩種建模方法得到的結(jié)構(gòu)中均處于構(gòu)象不穩(wěn)定區(qū)，說(shuō)明Lys在該位點(diǎn)的構(gòu)象中非共價(jià)鍵合原子間的距離小于極限距離，斥力很大，構(gòu)象能量高，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，所以對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，成功地篩選到了突變酶K413A和突變酶K413I。

圖7　K413A (A) 和K413I (B) 的三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig. 7 Three-dimensional structures of K413A and K413I by homology modelling. (A) In the mutant K413A, substituted Ala was shown to involve in hydrophobic interaction with the neighbouring hydrophobic amino acids M185 and P184. (B) In the mutant K413I, a view of the hydrophobic interaction among the substituted Ile, V182, P184, A163 and Y165 was shown.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在50 ℃處理?xiàng)l件下，突變酶K413A的半衰期為105 min，是野生型酶 (50 min) 的2.1倍，這個(gè)單一氨基酸位點(diǎn)突變成功地提高了GAD的熱穩(wěn)定性。圖1和圖7A分別是野生型酶和突變酶K413A的局部三維結(jié)構(gòu)模擬圖，當(dāng)親水氨基酸K (Lys) 替換成疏水氨基酸A (Ala)之后，將野生型酶和突變酶K413A的PDB文件提交至在線服務(wù)器 (http://pic.mbu.iisc.ernet.in/)，選取疏水相互作用選項(xiàng) (距離設(shè)為5 ?) 進(jìn)行計(jì)算[19]，可以發(fā)現(xiàn)突變酶K413A主要增加了蛋白質(zhì)分子內(nèi)的疏水作用，例如野生型酶413位點(diǎn)是賴氨酸，并不能與其他相鄰的氨基酸殘基形成疏水相互作用，但當(dāng)賴氨酸替換成丙氨酸后，蛋白質(zhì)分子內(nèi)增加了A413與A163、P184、M185、P412和M415之間的疏水相互作用，其中A413與P184、M185之間的空間距離小于4 ?，并且上述3個(gè)氨基酸的空間上出現(xiàn)了重疊區(qū)域。Kellis等[20]和Pace等[21]等通過(guò)系統(tǒng)地分析22個(gè)蛋白質(zhì)中和疏水相互作用有關(guān)的148個(gè)突變體發(fā)現(xiàn)，疏水相互作用對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)約為60%±4%，而氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)約為40%±4%，這明確表明疏水相互作用是蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中最重要的驅(qū)動(dòng)力，所以預(yù)測(cè)很可能是增加的蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水相互作用使得突變酶K413A的熱穩(wěn)定性得到了提高。

突變酶K413I熱穩(wěn)定性雖然沒有明顯的提高，但是在最適pH 4.8條件下的催化活力約為野生型的1.6倍。根據(jù)GAD1407的三維結(jié)構(gòu)模型，如圖1和圖7B所示，K413位點(diǎn)位于C端的一個(gè)β-轉(zhuǎn)角上，并且遠(yuǎn)離活性中心，并不直接參與催化反應(yīng)，提高酶活力的原因可能是：當(dāng)413位點(diǎn)的賴氨酸替換成異亮氨酸之后，堿性氨基酸被替換成疏水氨基酸，突變后的I413 與V182 (4.5 ?)、P184 (3.8 ?) 之間存在疏水相互作用，P184與A163 (3.9 ?)，V182與Y165 (3.5 ?)、A163 (3.4 ?) 均有相互疏水作用，這使得該區(qū)域的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微的變化，進(jìn)而影響到了與Y165相連的Q166，Q166直接參與GAD的催化反應(yīng)[16]，故猜測(cè)K413替換成I413能改善酶的活力是由于疏水相互作用。

以上位點(diǎn)突變對(duì)于GAD1407催化性能的改善作用均為推測(cè)性分析，需要后續(xù)的研究，尤其是獲得GAD1407的晶體結(jié)構(gòu)，來(lái)確定分析的準(zhǔn)確性。

為了能夠有效提高突變概率，常通過(guò)理性設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)重要的氨基酸突變位點(diǎn)，用于節(jié)約時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率及可行性。本文建立了一種基于拉氏圖獲取結(jié)構(gòu)信息，從而預(yù)測(cè)有效突變位點(diǎn)的方法，并且結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)，篩選得到了催化活力或熱穩(wěn)定性優(yōu)于野生型酶的突變酶。由于沒有確切的GAD1407蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，所以我們還未能說(shuō)明某一位點(diǎn)突變引起酶學(xué)性質(zhì)改變的確切機(jī)制，只能通過(guò)模擬的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行猜測(cè)，但是本研究基于蛋白質(zhì)拉氏圖的理性設(shè)計(jì)的策略為谷氨酸脫羧酶酶學(xué)性質(zhì)的提高提供了新的思路。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Enhancing glutamate decarboxylase activity by site-directed mutagenesis: an insight from Ramachandran plot

Piyu Ke1, Jun Huang2, Sheng Hu3, Weirui Zhao1, Changjiang Lü1, Kai Yu1, Yinlin Lei3, Jinbo Wang3, and Lehe Mei1,3
1 College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang, China
2 School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023, Zhejiang, China
3 School of Biotechnology and Chemical Engineering, Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo 315100, Zhejiang, China

Abstract:Glutamate decarboxylase (GAD) can catalyze the decarboxylation of glutamate into γ-aminobutyrate (GABA) and is the only enzyme of GABA biosynthesis. Improving GAD activity and thermostability will be helpful for the highly efficient biosynthesis of GABA. According to the Ramachandran plot information of GAD1407 three-dimensional structure from Lactobacillus brevis CGMCC No. 1306, we identified the unstable site K413 as the mutation target, constructed the mutant GAD by site-directed mutagenesis and measured the thermostability and activity of the wide type and mutant GAD. Mutant K413A led to a remarkably slower inactivation rate, and its half-life at 50 ℃ reached 105 min which was 2.1-fold higher than the wild type GAD1407. Moreover, mutant K413I exhibited 1.6-fold higher activity in comparison with the wide type GAD1407, although it had little improvement in thermostability of GAD. Ramachandran plot can be considered as a potential approach to increase GAD thermostability and activity.

Keywords:glutamate decarboxylase, protein engineering, γ- aminobutyric acid, Ramachandran plot

DOI:10.13345/j.cjb.150127

Corresponding author:Lehe Mei. Tel: +86-571-8795316; Fax: +86-571-87951982; E-mail: meilh@zju.edu.cn.