邵明豪，卓偉偉，賀曉麗，劉　軍，權(quán)富生，張　涌

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌　712100)

重組腺病毒介導(dǎo)的豬瘟 E0基因在山羊乳腺中的表達(dá)

邵明豪，卓偉偉，賀曉麗，劉軍，權(quán)富生，張涌

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100)

摘要為使豬溫病毒(CSFV)E0蛋白在奶山羊乳腺中得以合成和分泌，一段上游帶有信號(hào)肽和His標(biāo)簽序列的CSFV E0基因通過腺病毒穿梭載體被插入到腺病毒質(zhì)粒中，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞包裝得到重組腺病毒Ad-hisE0。為證明其有效性，用Ad-hisE0感染293A細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示 E0基因的表達(dá)顯著提高。用Ad-hisE0分別感染牛乳腺上皮細(xì)胞和泌乳期山羊乳腺，SDS-PAGE和Western blot 分析結(jié)果顯示出E0蛋白分別位于26 ku和48 ku處的2條特異性條帶。證實(shí)構(gòu)建的腺病毒Ad-hisE0可以介導(dǎo)重組融合蛋白CSFV E0在山羊乳腺中的表達(dá)和分泌。

關(guān)鍵詞CSFV；E0蛋白；腺病毒；乳腺

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的具有高度傳染性的傳染病，主要感染家豬、野豬和倭豬[1-3]。該病已引起世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。雖然豬瘟病毒在世界上一些地方豬瘟中已被徹底根除，但由于野豬群中仍保留有該病毒，因此，豬瘟被重新引入到家豬群中的威脅依然存在，甚至可能引起豬瘟的新一輪爆發(fā)和在世界范圍內(nèi)流行。CSFV的基因組是1條含有一個(gè)較大開放閱讀框(ORF)的單股正鏈RNA，長約12.3 kb，編碼1個(gè)多聚蛋白，最終可加工為12種成熟蛋白[4]。CSFV中可誘導(dǎo)被感染機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白為E0和E2，這2個(gè)蛋白為豬瘟的2個(gè)主要保護(hù)性抗原，同時(shí)也是病毒吸附敏感細(xì)胞而進(jìn)入細(xì)胞的必需蛋白[5]。E0位于CSFV病毒粒子以及被其感染的細(xì)胞中，以同源二聚體的形式存在。E0抗原可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)CSFV的中和抗體，用其免疫豬可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)致死量豬瘟病毒的保護(hù)性免疫[6]。此外，與編碼E2蛋白的核酸序列相比，編碼E0的核酸序列在屬內(nèi)保守度更高，因而E0也是防治豬瘟的一種理想靶蛋白。

目前，許多生物制藥學(xué)蛋白質(zhì)并不產(chǎn)生于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，為保證其生物學(xué)活性和穩(wěn)定性，仍需要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行翻譯后修飾。哺乳動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器雖然可以保證蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，無需翻譯后修飾，但其造價(jià)相對(duì)較為昂貴。因此，利用泌乳家畜的乳腺大量表達(dá)目的重組蛋白的方法被認(rèn)為是一種更為經(jīng)濟(jì)可觀的方式[7-9]。利用腺病毒感染反芻動(dòng)物乳腺，繼而在乳汁中獲得重組蛋白的方法相對(duì)快速、簡單，比生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物更為節(jié)省時(shí)間[10-12]。因此，本研究構(gòu)建CSFV E0蛋白的腺病毒表達(dá)載體，并用其分別體內(nèi)以及體外感染乳腺上皮細(xì)胞，獲得目的重組CSFV E0蛋白，為豬瘟基因工程疫苗以及動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV和含有腺病毒骨架載體pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183菌株由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存(以下稱本實(shí)驗(yàn)室)；pMD-18T載體由河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物分子免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；293A細(xì)胞系、牛乳腺上皮細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；EcoRⅠ、NotⅠ、PacⅠ和PmeⅠ限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、T4DNA 連接酶，DNA Marker、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperScriptTMRerverse Transcriptase)等均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；DNA連接試劑盒、實(shí)時(shí)定量SYBR○RPremix Ex TaqTM試劑盒購自TaKaRa公司；DMEM/F12、DMEM(HIGH GLUCOSE)、胎牛血清、脂質(zhì)體2000購自GIBCO公司；鼠抗HIS抗體[anti-HIS(M)]和HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材均購自 Corning 公司。

1.2含CSFV E0基因的重組腺病毒質(zhì)粒(pAd-hisE0)的構(gòu)建

根據(jù)插入pMD-18T載體的CSFV E0全基因(hisE0， E0基因的5′端依次帶有信號(hào)肽序列和His標(biāo)簽序列)為模板，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物序列如下：F1，5′-ACAGAATTCATGA- AGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGGCC-3′；F2，5′-ATTAGCGGCCGCTCAGGCATAAGCGCC- AAACC AGGTTTTG-3′，其中下劃線為插入的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。通過PCR擴(kuò)增后得到5′端依次帶有信號(hào)肽序列和His標(biāo)簽序列的CSFV E0全基因(hisE0)，全長為765 bp。將其和腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV用EcoRⅠ/NotⅠ酶切回收，用T4DNA連接酶連接，獲得pAdTrack-CMV-hisE0載體，酶切鑒定并測序。

用PmeⅠ限制酶酶切穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hisE0，然后轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架載體 pAdEasy-1 的大腸桿菌 BJ5183 感受態(tài)，最終得到重組腺病毒質(zhì)粒pAd-hisE0。用同樣的方法制備重組腺病毒空載體質(zhì)粒pAd-CMV作為陰性對(duì)照。

1.3重組腺病毒(Ad-hisE0)的包裝及其有效性鑒定

培養(yǎng)293A細(xì)胞生長至底面積的80%～90%時(shí)，用Invitrogen Lipofectamine 2000將PacⅠ酶切線性化后的pAd-hisE0質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，步驟參考轉(zhuǎn)染試劑說明書。轉(zhuǎn)染后10 d左右，可觀察到細(xì)胞變圓脫落，因病變出現(xiàn)空斑。此時(shí)便可收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液，將此細(xì)胞懸液置于-0 ℃/38 ℃ 水浴中反復(fù)凍融3次，離心去除細(xì)胞碎片后收集上清，獲得病毒液初代原液。然后用獲得的病毒原液再次感染293A細(xì)胞，觀察293A細(xì)胞的綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，48 h后提取細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以牛的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因作為內(nèi)參，實(shí)時(shí)定量PCR檢測CSFV E0基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)定量 PCR引物信息見表1。

表1　實(shí)時(shí)定量PCR引物信息

1.4重組腺病毒的擴(kuò)增、純化及其滴度測定

將293A細(xì)胞培養(yǎng)到融合度為85%左右，用獲得的病毒液初代原液感染293A細(xì)胞，3～4 d當(dāng)細(xì)胞變圓脫落出現(xiàn)空斑時(shí)，收集細(xì)胞懸液于-80 ℃/38 ℃ 水浴中反復(fù)凍融3次，離心收集病毒上清液。重復(fù)上述步驟，大量擴(kuò)增病毒，提高病毒的滴度。通過CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒，并測定滴度[11]。最終將收集到的含有CSFV E0基因片段的重組腺病毒命名為Ad-hisE0。采用同樣的方法，制備重組腺病毒Ad-CMV，作為陰性對(duì)照。獲得的重組腺病毒置于-80 ℃保存。

1.5重組腺病毒體外感染牛乳腺上皮細(xì)胞

將生長狀態(tài)良好的牛乳腺上皮細(xì)胞(Bovine mammary epithelial cell,BME)接種于6孔板，細(xì)胞密度為1×105mL-1，加入含φ=10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。待細(xì)胞匯合率介于60%～70%時(shí)，按照不同的感染復(fù)數(shù)(MOI=5，25，50)加入含有CSFV E0基因的重組腺病毒Ad-hisE0，感染2 h后換液。培養(yǎng)48 h后觀察綠色熒光蛋白(GFP)陽性細(xì)胞的比率，選擇合適的MOI。72 h 后，收集腺病毒感染的牛乳腺上皮細(xì)胞及其上清，提取蛋白進(jìn)行CSFV E0蛋白成分的SDS-PAGE和Western blot分析。用重組腺病毒Ad-CMV感染的對(duì)照樣品采取相同的方法處理。

1.6重組腺病毒體內(nèi)感染泌乳期山羊乳腺

選取處于自然泌乳期第1個(gè)月的山羊，平均每天的泌乳量約為1 L左右。每次對(duì)山羊乳房進(jìn)行灌注或者收集樣品時(shí)，用酒精和碘酒擦拭乳頭。首先將山羊乳房內(nèi)的乳汁全部擠凈，然后通過乳頭導(dǎo)管往乳池內(nèi)注入生理鹽水，輕輕按摩乳房，隨后將生理鹽水完全擠出。重復(fù)1次此過程，確保乳房內(nèi)的殘留乳汁被充分洗凈。然后每只乳房灌注500 mL含36 mmol·L-1EGTA的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液，按摩15 min后擠凈。然后往右側(cè)乳房內(nèi)灌注滴度為1×1010GTU mL-1的重組腺病毒Ad-hisE0，左側(cè)作為對(duì)照，灌注相同量的無菌PBS。乳房灌注的病毒量在400～600 mL，依乳房的容量而定，確保病毒液能充滿整個(gè)乳池。灌注完后再次按摩乳房，使病毒液均勻的分布于乳池內(nèi)并充分接觸到腺泡內(nèi)的分泌上皮細(xì)胞。灌注24 h后，將乳房內(nèi)的乳汁全部擠凈，并用生理鹽水再?zèng)_洗1次。灌注48 h后，收集被感染山羊的乳汁凍存于-80 ℃。

1.7重組腺病毒灌注后山羊乳汁的收集和處理

將收集到的乳汁樣品用分離緩沖液(10 mmol·L-1Tirs-HCl pH 8,10 mmol·L-1CaCl2)稀釋5倍，在室溫下用φ=10%的鹽酸將其pH調(diào)至4.5。隨后4 ℃，17 000×g離心30 min。收集乳清分裝凍存于-80 ℃，用于后續(xù)的CSFV E0蛋白的SDS-PAGE和Western blot檢測。

1.8重組蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析

將體外以及體內(nèi)收集的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含w=10%脫脂奶粉的TBST緩濁液(Tris鹽緩沖液+吐溫Tweon)4 ℃過夜封閉。然后用小鼠抗His的一抗稀釋液(1∶1 000)，37 ℃孵育3 h；TBST洗3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG的二抗稀釋液(1∶1 000)，室溫孵育1 h；TBST洗3次，用增強(qiáng)型發(fā)光底物作用后轉(zhuǎn)印至X光片。

2結(jié)果與分析

2.1重組腺病毒質(zhì)粒pAd-hisE0的構(gòu)建

用CSFV E0基因的擴(kuò)增引物F1/F2，擴(kuò)增前段帶有信號(hào)肽序列和His標(biāo)簽序列的 CSFV E0基因片段，大小約為760 bp，結(jié)果與預(yù)期相符(圖1)。將其連接入腺病毒穿梭載體后，用EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切鑒定穿梭載體pAdTrack-CMV-hisE0，結(jié)果與預(yù)期一致(圖2)。測序結(jié)果表明，插入片段為765 bp，CSFV E0基因成功已插入重組腺病毒質(zhì)粒。

M.Trans2K@ Plus DNA marker；1～4.CSFV E0 基因擴(kuò)增產(chǎn)物Amplified products of CSFV E0 gene

圖1CSFV E0基因的擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.1PCR amplification of CSFV E0 gene

M.Trans15K@ Plus DNA marker；1.經(jīng)EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切鑒定的穿梭載體pAdTrack-CMV-hisE0 pAdTrack-CMV-hisE0 plasmid double digestionedbyEcoRⅠ/NotⅠ；2.空載體對(duì)照Empty vector control

圖2pAdTrack-CMV-hisE0的雙酶切鑒定

Fig.2 Double enzyme identification of pAdTrack-CMV-hisE0

2.2重組腺病毒Ad-hisE0有效性的鑒定

用包裝獲得的重組腺病毒Ad-hisE0和Ad-CMV分別感染293A細(xì)胞，24 h后觀察綠色熒光。綠色熒光蛋白在細(xì)胞中已表達(dá)，說明腺病毒已包裝成功并且成功感染293A細(xì)胞(圖3)。48 h后提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR檢測CSFV E0基因的表達(dá)量(圖4)。結(jié)果顯示感染Ad-hisE0病毒的細(xì)胞CSFV E0基因的表達(dá)量極顯著高于感染Ad-CMV病毒的對(duì)照組。說明腺病毒包裝成功，并且能有效轉(zhuǎn)錄CSFV E0基因。

A.腺病毒Ad-hisE0感染的293A細(xì)胞(暗場) 293A cells infected by Ad-hisE0(fluorescence)；B.腺病毒Ad-hisE0感染的293A細(xì)胞(明場) 293A cells infected by Ad-hisE0(under bright field)

圖3腺病毒感染293A細(xì)胞24 h綠色熒光表達(dá)(×40)

Fig.3Green fluorescence of 293A cells infected by recombinant adenovirus for 24 h (×40)

圖4　CSFV E0基因相對(duì)表達(dá)量

2.3體外感染牛乳腺上皮細(xì)胞

用獲得的重組腺病毒Ad-hisE0感染牛乳腺上皮細(xì)胞，48 h后觀察綠色熒光，綠色熒光蛋白表達(dá)(圖5)，說明腺病毒對(duì)牛的乳腺上皮細(xì)胞感染成功。從中選出最合適的MOI為25。經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blot分析證實(shí)，被重組腺病毒Ad-hisE0侵染的牛乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)的蛋白可與抗His抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，在26 ku和48 ku左右分別出現(xiàn)2條明顯的條帶，分別對(duì)應(yīng)未糖基化的E0蛋白和糖基化完全的E0蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符。證實(shí)CSFV E0蛋白在牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)。而感染Ad-CMV的細(xì)胞培養(yǎng)物則沒有出現(xiàn)相應(yīng)蛋白條帶(圖6)。證明構(gòu)建的腺病毒具有侵染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力，并能介導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)和分泌E0蛋白。

A、B.MOI為5的轉(zhuǎn)染組(明場與暗場) Infected group with a MOI of 5 (under bright field and fluorescence)；C、D.MOI為25的轉(zhuǎn)染組(明場與暗場) Infected group with a MOI of 25 (under bright field and fluorescence)；E、F.MOI為50的轉(zhuǎn)染組(明場與暗場) Infected group with a MOI of 50 (under bright field and fluorescence)；G、H.未轉(zhuǎn)染組(明場與暗場) None-infected group(under bright field and fluorescence)

圖5不同MOI下腺病毒感染牛乳腺上皮細(xì)胞3 d 綠色熒光蛋白表達(dá)(×40)

Fig.5Green fluorescence of borine marrmary epithelial cells infected by recombinant for 3 d at different MOI (×40)

1.Ad-CMV感染的牛乳腺上皮細(xì)胞Ad-CMV infected bovine mammary epithelial cell；2.Ad-hisE0感染的牛乳腺上皮細(xì)胞Ad-hisE0 infected bovine mammary epithelial cell

圖6腺病毒感染牛乳腺上皮細(xì)胞后

重組蛋白的Western blot分析

Fig.6Western blot analysis of recombinant protein CSFV E0 from the bovine mammary epithelial cells infected by recombinant adenovirus

2.4體內(nèi)感染泌乳期山羊乳腺

將純化處理后的乳汁樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot分析。結(jié)果顯示，灌注Ad-hisE0重組腺病毒的乳汁樣品，在26 ku和48 ku處有明顯條帶，分別為未發(fā)生糖基化的E0蛋白和糖基化完全的E0蛋白，與預(yù)期大小一致(圖7)。而作為對(duì)照的灌注重組腺病毒Ad-CMV的乳汁樣品則未發(fā)生特異性反應(yīng)。說明構(gòu)建的重組腺病毒成功介導(dǎo)了CSFV E0基因在山羊乳腺中的分泌。

1.Ad-hisE0感染的山羊乳腺 Ad-hisE0 infected goat mammary gland；2.Ad-CMV感染的牛乳腺上皮細(xì)胞 Ad-CMV infected goat mammary gland

圖7 腺病毒感染山羊乳腺后重組蛋白的Western blot分析

Fig.7Western blot analysis of recombinant protein CSFV E0 secreted from the goat mammary gland infected by adenovirus

3討論與結(jié)論

豬瘟在全世界很多地方流行，而免疫接種是保護(hù)動(dòng)物免于豬瘟感染的唯一途徑。目前針對(duì)豬瘟研制的幾類疫苗有減毒活疫苗、亞單位疫苗以及基因工程疫苗，但減毒活疫苗仍處主流地位[13]。然而由于免疫程序不合理，免疫劑量未達(dá)到最佳標(biāo)準(zhǔn)或者操作不規(guī)范，減毒活疫苗有時(shí)并不能提供有效的保護(hù)。利用基因工程技術(shù)表達(dá)的重組蛋白具有更高的安全性和抗原性，與傳統(tǒng)的疫苗相比是一種更為有效的免疫方法[14]。CSFV可編碼C、E0、E1和E2四種結(jié)構(gòu)蛋白，其中最具免疫防治研究價(jià)值的是E0和E2。E0既是一種結(jié)構(gòu)蛋白，也是一種功能性蛋白，表現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞毒性和抗凝集活性，與CSFV對(duì)宿主細(xì)胞的嗜性以及致病力有密切聯(lián)系，具有RNase活性[15-16]，能引起動(dòng)物的淋巴和上皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致免疫抑制[17]。E0是唯一一種能分泌到被CSFV感染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中的糖蛋白[17]，且較E2保守程度更高，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，獲得對(duì)豬瘟的免疫力[18]。因此利用基因工程技術(shù)表達(dá)CSFV的E0蛋白，進(jìn)而將其作為一種亞單位疫苗是防治豬瘟的一個(gè)非常有前景的探索方向。

為將想要的目的蛋白用于研究和生產(chǎn)，大量表達(dá)外源蛋白的方法一直被人們廣泛關(guān)注。通常表達(dá)外源蛋白的方法包括以大腸桿菌為主的原核表達(dá)，和以酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)為主的真核表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳腺中表達(dá)重組蛋白，可保證獲得的重組蛋白得到接近于自然狀態(tài)下的翻譯后修飾[19]。然而，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的高昂費(fèi)用以及其較長的周期阻礙其在生產(chǎn)低成本疫苗方面的應(yīng)用[20-21]。因此，另一種較為可行的方法是將想要表達(dá)的目的蛋白的基因直接導(dǎo)入成年動(dòng)物的乳腺中。

將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有很多種，主要包括脂質(zhì)體介導(dǎo)的化學(xué)方法、利用電轉(zhuǎn)等手段的物理方法以及攜帶外源基因的病毒或農(nóng)桿菌等介導(dǎo)的生物學(xué)方法。然而，考慮到對(duì)細(xì)胞的損傷以及應(yīng)用于活體試驗(yàn)的可操作性，利用病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法是一種更為理想的將目的基因?qū)氩溉閯?dòng)物乳腺的方法。腺病毒與其他病毒載體系統(tǒng)相比，具有可感染體內(nèi)組織、容易快速獲得高滴度病毒和可以攜帶大片段外源基因等優(yōu)點(diǎn)[22-24]。

CSFV E0蛋白是一個(gè)大小為48 ku左右高度糖基化糖蛋白，其分子量中約50 %左右都為碳水化合物組成。本試驗(yàn)中，無論是在牛乳腺上皮細(xì)胞中還是在山羊乳腺中，Western blot都顯示出2條條帶，一條為26 ku左右，另外一條為48 ku左右。表明乳腺上皮細(xì)胞對(duì)E0蛋白的糖基化修飾程度不同，有的修飾較為完全，有的則可能并未經(jīng)過糖基化修飾。在以往的報(bào)道中，利用不同細(xì)胞系表達(dá)的E0蛋白大小也不盡相同，如Chen等[25]利用桿狀病毒在Sf9細(xì)胞表達(dá)的E0蛋白大小為38～40 ku，而在High Five細(xì)胞中表達(dá)的E0蛋白大小則在52 ku左右。這主要是由于在不同的細(xì)胞糖基化水平不同，最終導(dǎo)致表達(dá)的重組蛋白E0的大小略有差別。此外，還有研究表明乳腺對(duì)外源重組蛋白的翻譯后修飾存在一個(gè)“速率限制”，當(dāng)?shù)鞍椎谋磉_(dá)量大于某個(gè)濃度時(shí)，乳腺對(duì)重組蛋白的糖基化修飾會(huì)不完全。如對(duì)抗凝血酶Atryn[26]和人的人體C1酯酶抑制劑[27]，當(dāng)其在乳汁中的表達(dá)量大于1 mg/mL時(shí)，蛋白的完全和正確糖基化修飾就會(huì)受到阻礙。因此，本試驗(yàn)中乳腺上皮細(xì)胞對(duì)于E0蛋白的糖基化修飾極有可能也存在上述現(xiàn)象，其具體原因仍需要進(jìn)一步探究。

本研究中首先克隆5′端帶有信號(hào)肽序列和His標(biāo)簽序列的CSFV E0基因，構(gòu)建腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-hisE0以及腺病毒重組質(zhì)粒pAd-hisE0，并將其成功包裝成為高質(zhì)量的重組腺病毒。經(jīng)擴(kuò)增純化后進(jìn)行體內(nèi)和體外試驗(yàn)，分別用該重組腺病毒感染293A細(xì)胞、牛的乳腺上皮細(xì)胞和泌乳期山羊乳腺。實(shí)時(shí)定量檢測，SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組腺病毒具有侵染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力，并能介導(dǎo)山羊乳腺表達(dá)和分泌E0蛋白。

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Received 2015-04-29Returned2015-06-09

First authorSHAO Minghao,female,master student.Research area:animal embryo engineering.E-mail:shaominghao90@163.com

(責(zé)任編輯：史亞歌Responsible editor:SHI Yage)

Recombiant Adenoviral-mediated Transfer of CSFV E0 Gene into Goat Mammary Gland

SHAO Minghao，ZHUO Weiwei，HE Xiaoli，LIU Jun，QUAN Fusheng and ZHANG Yong

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractIn order to synthesize the goat mammary gland and CSFV E0 gene,a CSFV E0 gene with a signal peptide and a His tag sequence in its upstream was inserted into the recombinant adenovirus plasmid by an adenovirus shuttle vector.And then the recombinant plasmid was transfected into 293A cell line to package the recombinant adenovirus Ad-hisE0.To verify the availability of the virus,293A cells were infected by the resulting recombinant adenovirus (Ad-hisE0).The result of quantitative real-time PCR showed that the expression of CSFV E0 increased dramatically after infected with the adenovirus.And then the confirmed Ad-hisE0 was used to infect bovine mammary epithelial cells in vitro and goat mammary cells in vivo.The expression products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot.The result revealed that there are two different molecular mass of the recombinant fusion protein 26 ku and 48 ku.These results demonstrated that the recombinant adenovirus Ad-hisE0 can introduce the CSFV E0 gene into the goat mammary gland,and enable the secretion of the recombinant protein.

Key wordsCSFV；E0 protein；Adenovirus；Mammary gland

收稿日期：2015-04-29修回日期：2015-06-09

基金項(xiàng)目：抗病轉(zhuǎn)基因牛新品種培育(2008ZX08007-004)。

通信作者：張涌，男，教授，主要從事動(dòng)物克隆與轉(zhuǎn)基因技術(shù)、動(dòng)物胚胎工程研究。E-mail：Zhy1956@263.net

中圖分類號(hào)S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)06-0816-07

Foundation itemBreeding of Disease Resistant Transgenic Cattle(No.2008ZX08007-004). ZHANG Yong,male,professor.Research area:animal cloning and transgenic technology,animal embryo engineering.E-mail: Zhy1956@263.net

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0914.008.html

第一作者：邵明豪，女，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物胚胎工程。E-mail：shaominghao90@163.com