白亦光, 陳巧玲, 劉　康, 楊澤龍, 羅栩偉, 馮　剛

(1川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院骨科，南充　637000； 2川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院腫瘤科； 3川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所； *通訊作者，E-mail:cql166@163.com)

高滲培養(yǎng)基對(duì)椎間盤內(nèi)髓核細(xì)胞活力及代謝的影響

白亦光1, 陳巧玲2*, 劉康3, 楊澤龍1, 羅栩偉1, 馮剛3

(1川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院骨科，南充637000；2川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院腫瘤科；3川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所；*通訊作者，E-mail:cql166@163.com)

摘要：目的探討高滲培養(yǎng)基對(duì)椎間盤內(nèi)髓核組織及髓核細(xì)胞活力的影響。方法6-7周齡SD大鼠10只，無菌取每只大鼠胸腰段椎間盤9個(gè)，置于高滲(410 mOsm/kg)培養(yǎng)基中整體培養(yǎng)，培養(yǎng)前及培養(yǎng)第7，14，21，28天，利用Mitotracker Green熒光探針、免疫組織化學(xué)和生物化學(xué)方法檢測細(xì)胞的活力、椎間盤結(jié)構(gòu)的變化以及髓核組織細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化。結(jié)果椎間盤組織形態(tài)、細(xì)胞存活率及髓核細(xì)胞外基質(zhì)成分與新鮮離體椎間盤無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。髓核細(xì)胞存活率熒光強(qiáng)度檢測提示培養(yǎng)后第21天與培養(yǎng)前比較熒光強(qiáng)度明顯降低(7 782±367 vs 10 435±376，P<0.05)。髓核組織內(nèi)蛋白多糖含量(mg/100 mg)檢測提示培養(yǎng)第21天與培養(yǎng)前相比明顯降低(3.72±0.45 vs 6.35±0.76，P<0.05)。結(jié)論在高滲培養(yǎng)基中(410 mOsm/kg)，髓核細(xì)胞可以良好存活至少14 d，大鼠髓核組織內(nèi)蛋白多糖可以有效保持14 d。

關(guān)鍵詞：高滲培養(yǎng)基；椎間盤；髓核組織；髓核細(xì)胞

椎間盤退行性變(intervertebral disc degeneration，IDD)是目前人類下腰痛的主要病因，如腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥和退變性腰椎側(cè)凸等一系列疾病均與其有關(guān)[1]。關(guān)于IDD的病因和病理生理機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為主要是椎間盤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(蛋白聚糖、膠原等)的丟失以及終板的鈣化，改變了椎間盤生物力學(xué)機(jī)制[2]。目前主要臨床治療方法是外科手術(shù)治療，在解除病變節(jié)段的同時(shí)，又使鄰近節(jié)段發(fā)生退變，還降低了關(guān)聯(lián)運(yùn)動(dòng)階段的靈活性，增加了鄰近節(jié)段的負(fù)擔(dān)。目前對(duì)于椎間盤生物治療的研究主要體現(xiàn)在利用基因工程、細(xì)胞工程及組織工程手段來恢復(fù)退變椎間盤細(xì)胞的數(shù)量及生物活性，如使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞，GDF-5基因干預(yù)，體外完整組織工程椎間盤的構(gòu)建等[3]。但尚沒有一種完整椎間盤培養(yǎng)模型可供觀察。

本實(shí)驗(yàn)擬在體外建立一種椎間盤器官整體培養(yǎng)系統(tǒng)并觀察在此系統(tǒng)中髓核細(xì)胞的活力，為今后研究IDD此類疾病探索一種有效的離體器官模型。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器

6-7周齡SD大鼠10只，近交系，清潔動(dòng)物，體重約(300±25)g，雌雄不限，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。CO2培養(yǎng)箱箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(美國Airtech公司)，倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(美國Chondrex公司)，DAB顯色試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)。Mitotracker Green分子探針(美國Hyclone公司)。Mitotracker Green(Molecular Probes，Eugene，OR)(濃度5 μmol/L)

1.2椎間盤器官整體獲取及培養(yǎng)

10%水合氯醛(5 ml/kg)麻醉大鼠，無菌操作完整切取包括上、下軟骨終板、纖維環(huán)及髓核組織的胸腰段椎間盤整體器官共90個(gè)，在操作過程中盡可能的將軟骨終板向鄰近的骨質(zhì)分離干凈，用含肝素的高滲PBS液充分沖洗后，置入含有滲透壓為410 mOsmol/kg高滲培養(yǎng)液的12孔培養(yǎng)板內(nèi)，每天換液1次。于培養(yǎng)第0，7，14，21，28天進(jìn)行以下檢測。

1.3細(xì)胞活力的測定

在培養(yǎng)0，7，14，21，28 d各取3個(gè)椎間盤，用HBSS液反復(fù)漂洗各標(biāo)本。放入已加入Mitotracker Green分子探針(5 μmol/L)的培養(yǎng)基中，在37 ℃孵箱中共孵育1 h。將椎間盤放入不含熒光染料的新鮮培養(yǎng)基中孵育1 h，以除去未結(jié)合的熒光染料。然后，無菌條件下切開椎間盤纖維環(huán)，刮出髓核組織，浸入載玻片上的HBSS液中，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，髓核組織中有活力的細(xì)胞因被分子探針染色而發(fā)出綠色熒光。

1.4組織學(xué)及免疫組化

通過病理組織學(xué)切片番紅O染色鏡下觀察整體椎間盤的結(jié)構(gòu)，采用免疫熒光染色了解髓核組織內(nèi)Aggrecan(蛋白聚糖)的表達(dá)量，具體方法如下：使用10%多聚甲醛固定，脫鈣液浸泡6 d，沿矢狀位中線切開整體椎間盤，包埋，切片(厚5 μm)，染色觀察，使用倒置顯微鏡觀察并采集圖像。

番紅O染色：切片二甲苯梯度酒精脫蠟至水；蘇木素染色10 min；0.2%亮綠染色10 min；0.1%番紅O染色10 min，1%醋酸酒精分化液分化3 s，樹脂封片后鏡下觀察。

Aggrecan(蛋白聚糖)免疫熒光染色：將上述切片二甲苯梯度酒精脫蠟至水；3%過氧化氫封閉10 min(避光)；微波加熱修復(fù)抗原；正常血清封閉處理30 min；添加一抗(小鼠抗兔)4 ℃過夜；添加二抗(羊抗小鼠)37 ℃ 1 h；抗熒光淬滅劑封片；熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5髓核組織蛋白多糖(sGAG)含量測定

將各時(shí)間點(diǎn)椎間盤中髓核組織取出經(jīng)木瓜蛋白酶1 ml 56 ℃消化24 h；配制1 000 μg/ml硫酸軟骨素溶液：取出數(shù)個(gè)干凈1.5 ml EP管，按標(biāo)準(zhǔn)做1-100 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)液，并做好標(biāo)記；取木瓜蛋白酶消化的組織混合液0.5 ml，加入100 mmol/L碘乙酸0.5 ml，繼續(xù)加入0.5 mol/L Tris 0.5 ml；加入50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)3 ml；測定標(biāo)準(zhǔn)曲線：取100 μl標(biāo)準(zhǔn)液，加入2.5 ml DMB顯色液，混勻，反應(yīng)15 s，于525 nm處比色，測吸光度，做標(biāo)準(zhǔn)曲線；DMB顯色：同法測定組織上清液吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品sGAG含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1髓核細(xì)胞成活率觀察

Mitotracker Green熒光探針測定顯示：體外培養(yǎng)至第7天，髓核組織內(nèi)髓核細(xì)胞數(shù)量較多、活力較好，顯微鏡下表現(xiàn)出較高的熒光強(qiáng)度(見圖1A)；第14天髓核細(xì)胞熒光強(qiáng)度出現(xiàn)降低(見圖1B)，第21天時(shí)熒光強(qiáng)度進(jìn)一步下降(見圖1C)；到第28天時(shí)顯微鏡下顯示熒光幾乎消失，表明髓核細(xì)胞的存活率明顯下降(見圖1D)。髓核細(xì)胞不同時(shí)期Mitotracker Green熒光定量測定結(jié)果見表1。其中第21天時(shí)熒光強(qiáng)度較培養(yǎng)第14天明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=5.34，P<0.05)。

2.2椎間盤組織學(xué)變化

番紅O染色觀察提示培養(yǎng)第7天、第14天，椎間盤結(jié)構(gòu)完整，與髓核組織界限清晰，髓核組織內(nèi)可看到完整髓核細(xì)胞簇狀分布，染色呈紅色，胞外基質(zhì)豐富飽滿，纖維環(huán)排列有序(見圖2A、B)。培養(yǎng)第21天后髓核組織中細(xì)胞含量明顯減少且分布不均勻，形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則，纖維環(huán)軟骨組織增生，紋理排列紊亂(見圖2C)。培養(yǎng)第28天時(shí)髓核組織中主要為纖維軟骨組織，髓核細(xì)胞幾乎完全消失，形態(tài)進(jìn)一步呈現(xiàn)不規(guī)則狀態(tài)(見圖2D)。

圖1　培養(yǎng)第7天、第14天、第21天和第28天Mitotracker Green熒光探針觀察髓核細(xì)胞活性 (×40)Figure 1　Cell viability of nucleus pulposus by Mitotracker green fluorescent probe at 7 d, 14 d, 21 d and 28 d after the culture (×40)

時(shí)間熒光強(qiáng)度值培養(yǎng)前10435±376培養(yǎng)第7天9976±348培養(yǎng)第14天9899±281培養(yǎng)第21天7782±367*培養(yǎng)第28天7568±298*

與培養(yǎng)前、培養(yǎng)第7，14天比較,*P<0.05

2.3椎間盤組織中蛋白聚糖含量變化

Aggrecan免疫熒光顯示椎間盤組織中蛋白聚糖熒光隨時(shí)間延長明顯降低，培養(yǎng)第7,14天髓核組織蛋白聚糖免疫熒光檢測呈現(xiàn)綠色熒光(見圖3A、B)。培養(yǎng)第21天可見熒光含量減少，分布不均勻(見圖3C)。第28天熒光強(qiáng)度減弱更加明顯，髓核組織熒光顯著減少，熒光區(qū)域之間被纖維條索狀結(jié)構(gòu)分割(見圖3D)。

圖2　培養(yǎng)第7天、第14天、第21天和第28天整體椎間盤番紅O染色結(jié)果 (×40)Figure 2　Safranin O dye results of the whole intervertebral disc after culture for 7 d, 14 d, 21 d and28 d (×40)

圖3　培養(yǎng)第7天、第14天、第21天和第28天免疫熒光觀察椎間盤組織中蛋白聚糖的表達(dá) (×40)Figure 3　Immunofluorescence results of aggrecan content in intervertebral disc tissue after culture for 7 d, 14 d, 21 d and 28 d (×40)

2.4髓核組織蛋白聚糖含量測定

木瓜蛋白酶消化法測得髓核組織中蛋白聚糖含量結(jié)果顯示：培養(yǎng)第7天，第14天蛋白多糖含量下降無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第21天時(shí)與培養(yǎng)前、培養(yǎng)第7，14天相比蛋白聚糖含量下降有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)，培養(yǎng)第21天，第28天蛋白多糖含量進(jìn)行性下降。

時(shí)間蛋白多糖含量培養(yǎng)前6.35±0.76培養(yǎng)第7天5.07±0.54培養(yǎng)第14天5.12±0.87培養(yǎng)第21天3.72±0.45*培養(yǎng)第28天2.45±0.32*

與培養(yǎng)前、培養(yǎng)第7，14天比較，*P<0.05

3討論

椎間盤器官培養(yǎng)模型是利用椎間盤自身的三維結(jié)構(gòu)和可調(diào)控的培養(yǎng)條件，將完整的椎間盤(包括髓核及其周圍的纖維環(huán)和終板)在體外進(jìn)行整體培養(yǎng),從而保留了重要的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用。近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)椎間盤器官整體培養(yǎng)逐漸重視。椎間盤器官由上、下軟骨終板，中間的纖維環(huán)和髓核組織組成，纖維環(huán)主要由纖維環(huán)細(xì)胞及Ⅰ型膠原組成，髓核組織主要由髓核細(xì)胞、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖組成[4]。椎間盤髓核及纖維環(huán)的營養(yǎng)代謝主要通過軟骨終板的滲透作用得以實(shí)現(xiàn)，所以在體外設(shè)計(jì)這樣的整體器官培養(yǎng)模型對(duì)研究下腰痛病因、病理及治療學(xué)等方面具有積極的意義。

國外許多學(xué)者在取材工程中，盡可能地分離軟骨終板周圍骨質(zhì)，以縮短營養(yǎng)物質(zhì)的彌散距離，Ariga等[5]對(duì)小鼠的椎間盤進(jìn)行了器官培養(yǎng)，取材時(shí)僅保留了靠近終板1-2 mm厚的椎體骨質(zhì)；Gantenbein等[6]則在切取羊椎間盤前對(duì)椎間盤組織進(jìn)行了抗凝預(yù)處理，防止血凝塊阻塞毛細(xì)血管網(wǎng)，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的彌散。我們則切取包括上、下軟骨終板及難以分離的少量松質(zhì)骨、纖維環(huán)及髓核組織，這一方面有利于體外高滲培養(yǎng)時(shí)的營養(yǎng)滲透，而另一方面則保持間盤的結(jié)構(gòu)的完整性。椎間盤的整體結(jié)構(gòu)與功能較大程度地依賴髓核細(xì)胞的生存能力及細(xì)胞外基質(zhì)的豐富程度，在椎間盤的生物研究領(lǐng)域已不斷證實(shí)，椎間盤的退變最開始發(fā)生于髓核細(xì)胞的凋亡和髓核組織含水量的下降，在影像學(xué)表現(xiàn)為椎間盤高度的下降和MRI上T2相髓核信號(hào)的降低。

本研究表明，在高滲的培養(yǎng)液中，髓核細(xì)胞及髓核組織能夠存活2周左右，2周后髓核細(xì)胞的生存能力出現(xiàn)明顯的下降。髓核組織內(nèi)細(xì)胞及胞外基質(zhì)的變化與椎間盤整體的功能密切相關(guān)，從椎間盤髓核結(jié)構(gòu)方面和Mitotracker Green熒光探針測定髓核細(xì)胞成活率方面觀察，兩種結(jié)果呈現(xiàn)出同步退變的過程，即髓核細(xì)胞活性下降的同時(shí)，椎間盤髓核結(jié)構(gòu)也發(fā)生一定程度的紊亂。在特定的滲透壓下，體外整體培養(yǎng)的椎間盤可以有效地存活2周，為椎間盤的生物治療提供了簡便易行的模型，在410 mOsm/kg高滲狀態(tài)下，培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)成分通過軟骨終板或者纖維環(huán)滲透入髓核組織內(nèi)部，供給髓核細(xì)胞營養(yǎng)，維持2周內(nèi)髓核細(xì)胞的生存。離體培養(yǎng)的整體椎間盤組織相比于體內(nèi)缺乏力學(xué)刺激而產(chǎn)生向外膨脹的應(yīng)力，人為的高滲培養(yǎng)基可以產(chǎn)生有效的回縮應(yīng)力對(duì)抗膨脹，還可通過改變細(xì)胞外基質(zhì)的滲透性來維持細(xì)胞基質(zhì)代謝平衡或者直接通過提高培養(yǎng)基的滲透壓來模擬椎間盤在體內(nèi)所處的力學(xué)環(huán)境，從而維持髓核細(xì)胞基質(zhì)的代謝平衡[7]。

番紅O染色則可對(duì)髓核組織內(nèi)的蛋白聚糖的變化行大體觀察，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到，2周內(nèi)椎間盤結(jié)構(gòu)完整，與髓核組織界限清晰，有效地維持了髓核組織的形態(tài)，表明整體椎間盤在體外可以良好存活。Aggrecan免疫熒光顯示椎間盤組織中蛋白聚糖熒光含量，培養(yǎng)第21天可見熒光含量減少。第28天熒光強(qiáng)度減弱更加明顯，與木瓜蛋白酶消化法測得髓核組織中蛋白多糖含量結(jié)果保持了較大的一致，Mitotracker Green熒光探針測定顯示髓核細(xì)胞成活率，獲得了熒光定量測定結(jié)果，其結(jié)果為組織學(xué)和免疫組化檢測提供了佐證。所以我們得出了這樣的結(jié)果，在410 mOsm/kg高滲狀態(tài)下，大鼠椎間盤整體培養(yǎng)中髓核細(xì)胞的存活和髓核組織的生物特性可以至少良好地保持2周。

椎間盤器官整體培養(yǎng)可以最大限度地保留髓核細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間及基質(zhì)內(nèi)部的結(jié)構(gòu)完整性，也保證了功能方面的完整性，這也是椎間盤器官整體培養(yǎng)相對(duì)于孤立的進(jìn)行髓核、纖維環(huán)或者終板的研究有較明顯的優(yōu)勢(shì)所在。在椎間盤器官整體培養(yǎng)基本可行的基礎(chǔ)上，一些研究者不斷完善培養(yǎng)條件試圖獲得更為理想的椎間盤：Risbud等[8]比較了不同亞型TGF-β對(duì)基質(zhì)表達(dá)的影響得出TGF-β3對(duì)基質(zhì)表達(dá)的促進(jìn)作用更強(qiáng)，而且提高了細(xì)胞的成活力及代謝活性，同時(shí)降低了細(xì)胞的凋亡率。近期，Koerner等[9]在椎間盤整體培養(yǎng)模型中利用P多肽激活了椎間盤中炎癥通路，并導(dǎo)致了IL-6在椎間盤內(nèi)的高表達(dá)。Li等[10]在大鼠椎間盤整體培養(yǎng)模型中利用芝麻素抑制盤內(nèi)炎性物質(zhì)的分泌和細(xì)胞外基質(zhì)分解?？梢娮甸g盤器官的整體培養(yǎng)模型可為椎間盤退行性變的研究提供更加完整的實(shí)驗(yàn)空間，在整體椎間盤中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究能夠更加貼近真實(shí)的人類椎間盤退變過程。從而為由椎間盤引起的下腰痛提供更為廣闊的研究舞臺(tái)。

本實(shí)驗(yàn)室會(huì)在本次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過進(jìn)一步在高滲培養(yǎng)基中添加各種生長因子，了解通過培養(yǎng)基成分的改變對(duì)髓核組織體外生存的影響，進(jìn)而了解整體椎間盤器官體外存活的機(jī)制，為了解椎間盤退行性變疾病發(fā)病機(jī)制及治療策略提供更加有益的科學(xué)的研究。

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Effect of hypertonic medium on cell viability and metabolism of nucleus pulposus of intervertebral discs

BAI Yiguang1, CHEN Qiaoling2*,LIU Kang3, YANG Zelong1, LUO Xuwei1, FENG Gang3

(1DepartmentofOrthopedics,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China;2DepartmentofOncology,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;3TissueEngineeringandStemCellResearchInstitute，NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:cql166@163.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of hypertonic medium on cell viability and metabolism of nucleus pulposus in the intervertebral discs.MethodsNine thoracolumbar intervertebral discs were harvested from every 6-7-week-old SD rat(n=10) and cultured with hypertonic medium(410 mOsm/kg). Cell viability, structural integrity and proteoglycan content were assessed using Mitotracker Green fluorescent probe, histochemical and biochemical methods at days 0, 7, 14, 21 and 28 after the culture. ResultsThe morphology of the whole intervertebral discs, cell viability and extracellular matrix component of nucleus pulposus at day 14 showed no statistical changes compared with those in fresh intervertebral discs in vitro. However, cell survival fluorescence intensity decreased significantly at day 21 in comparison of that before culture(7 782±367 vs 10 435±376，P<0.05). The proteoglycan content of nucleus pulposus(mg/100 mg) at day 21 markedly reduced in comparison with that before culture (3.72±0.45 vs 6.35±0.76，P<0.05).ConclusionNucleus pulposus cells in the rat intervertebral discs cultured with the hypertonic medium(410 mOsm/kg) could survive at least 14 d. Proteoglycan in nucleus pulposus tissue of rats can effectively keep the richness in 14 d.

Key words:hypertonic medium;intervertebral discs;nucleus pulposus tissue;nucleus pulposus cells

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171472，81071270，30872614)；四川省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(15ZA0216，15ZB0201)；南充市科技局科技支撐項(xiàng)目(14A0017，14A0022)；川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(CBY14-A-ZD02，CBY15-A-ZD02)

作者簡介：白亦光，男，1986-07生，碩士，住院醫(yī)師，E-mail:baiyiguang@163.com

收稿日期：2016-01-19

中圖分類號(hào)：R681.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)06-0531-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.010