李苗苗， 王海嘯， 陶國全

(1南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院消化內(nèi)科，淮安　223300； 2南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院普通外科； *通訊作者，E-mail:13770875120@163.com)

CDKN3基因在肝癌中的表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞生長、細(xì)胞周期的影響

李苗苗1*， 王海嘯2， 陶國全2

(1南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院消化內(nèi)科，淮安223300；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院普通外科；*通訊作者，E-mail:13770875120@163.com)

摘要：目的研究細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(cyclin dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)基因在肝癌組織中的表達(dá)，以及被沉默后對肝癌細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的影響。方法采用普通及定量RT-PCR、蛋白免疫印跡法檢測36例手術(shù)切除的肝癌組織和匹配的癌旁組織以及人肝癌細(xì)胞株中CDKN3的表達(dá)；觀察沉默CDKN3表達(dá)后肝癌細(xì)胞生長曲線、克隆形成能力和細(xì)胞周期的變化。結(jié)果與癌旁樣本相比，CDKN3基因在63.9%(23/36)肝癌組織中的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)；RNA干擾技術(shù)沉默CDKN3表達(dá)后，MHCC-LM3和Huh-7細(xì)胞生長和克隆形成能力被明顯抑制(P<0.05)；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)沉默CDKN3的表達(dá)能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯(P<0.05)。結(jié)論CDKN3基因在肝癌中表達(dá)上調(diào)，其通過影響細(xì)胞周期分布從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：原發(fā)性肝癌；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3；RNA干擾；基因沉默；細(xì)胞周期

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的惡性腫瘤之一。2008年全球新發(fā)肝癌748 300例，死亡695 900例，其中約50%病例發(fā)生在中國[1]。近年來，我國肝癌發(fā)病率有上升趨勢，居我國惡性腫瘤死亡率第二位，是全球肝癌發(fā)病率、死亡率最高的國家[2]。

肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因多通路變異累積逐漸演變的復(fù)雜過程，其中癌基因的激活或抑癌基因的失活在肝癌的發(fā)生及發(fā)展過程中扮演著重要的作用[3,4]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因3(CDKN3)屬于激酶抑制蛋白CIP/KIP基因家族，其位于人類染色體14q22，所編碼的蛋白含212個氨基酸，CDKN3被認(rèn)為在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，CDKN3的過表達(dá)與卵巢癌、腎癌等多種實體瘤的增殖密切相關(guān)[6,7]，目前國內(nèi)外有關(guān)CDKN3在肝癌發(fā)生發(fā)展中功能的研究鮮見報道。本研究通過DNA聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白免疫檢測了CDKN3在肝癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律；應(yīng)用細(xì)胞生長曲線、克隆形成及流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測了CDKN3對肝癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期的影響。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入探討肝癌發(fā)病機(jī)制及肝癌的診斷、治療提供了可靠的實驗證據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；Trizol、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和引物(美國Invitrogen公司)；Taq DNA聚合酶、dNTP和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa公司)；siRNAs(中國上海吉瑪制藥有限公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；PI/RNase staining buffer試劑盒(美國BD公司)；β-actin抗體和CDKN3(C-18)抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2樣本來源

36例肝癌標(biāo)本均取自南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安市第一人民醫(yī)院2008-03～2010-10期間接受肝膽外科手術(shù)治療的肝癌患者，包括癌組織和癌旁組織，所有標(biāo)本都經(jīng)過臨床及病理確診是肝細(xì)胞性肝癌。將患者標(biāo)本用于科學(xué)研究取得了淮安市第一醫(yī)院倫理委員會的同意。手術(shù)樣本的留取均獲得患者知情同意，并簽署知情同意書。肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10%小牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄

癌組織、癌旁組織和細(xì)胞株均采用Trizol試劑，并按照其操作說明提取標(biāo)本總RNA。RNA的逆轉(zhuǎn)錄采用M-MLV Reverse Transcriptase(美國Promega公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，操作步驟按照其說明書嚴(yán)格操作。

1.4普通及實時熒光定量PCR

選擇管家基因β-actin作為內(nèi)參基因，以肝癌及其對應(yīng)的癌旁組織的cDNA為模板。普通及定量PCR均采用相同的引物，CDKN3基因引物序列如下：CDKN3F：5′-CCAGAGGGGAACTGTCAAAA-3′；R：5′GCAGCTAATTTGTCCCGAAA-3′，擴(kuò)增片段長度為355 bp。β-actinF：5′-AGAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′；R：5′-CTGGGCCTCGTCGCCCACATA-3′，擴(kuò)增片段長度為230 bp。普通反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33循環(huán)(β-actin為29循環(huán))；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂凝膠中電泳，紫外分析儀中觀察并照相。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，之后94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)后進(jìn)行溶解曲線的檢測。每次實驗組設(shè)3個復(fù)孔，數(shù)據(jù)分析方法：ΔCtCDKN3=CtCDKN3平均值-對應(yīng)模板Ctβ-actin平均值；ΔΔCtCDKN3=ΔCtCDKN3癌-ΔCtCDKN3癌旁。肝癌組織和癌旁組織的CDKN3基因表達(dá)差異的倍數(shù)關(guān)系用2-ΔΔCtCDKN3表示。

1.5RNA干擾

根據(jù)Invitrogen公司網(wǎng)站上的設(shè)計siRNA的原則和操作步驟，針對CDKN3基因的開放讀碼框序列設(shè)計了兩條相應(yīng)的雙鏈siRNAs:siRNA-1和siRNA-2,選擇與人類基因序列無同源性的不作用于人類任何基因的siRNA-NC作為陰性對照。序列分別為siRNA-1F：5′-CAGACUCCAAUUCAUAUAUdTdT-3′；R：5′-AUAUAUGAAU UGGAGUCUGdTdT-3′，siRNA-2F：5′-CCAUCAAGCAAUACAAUUAdTdT-3′；R：5′-UAAUUGUAUUGCUUGAUGGdTdT-3′；siRNA-NCF：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′；R：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′。1.6siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞siRNA的轉(zhuǎn)染均采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照其說明書操作。

1.7細(xì)胞生長曲線的測定

采用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖能力。取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞，接種于96孔板中(每孔3×103個細(xì)胞)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，應(yīng)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染相應(yīng)siRNAs，轉(zhuǎn)染6 h時更換成100 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培育24 h，每孔加入10 μl CCK-8，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值。每隔24 h測1次，收集、處理數(shù)據(jù)。

1.8細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實驗

轉(zhuǎn)染siRNAs至MHCC-LM3和Huh-7細(xì)胞中，觀察CDKN3基因表達(dá)被沉默后的軟瓊脂克隆形成能力。將siRNAs轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞后37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，然后消化全部細(xì)胞，計數(shù)并取適量細(xì)胞用液態(tài)軟瓊脂懸浮、種植至已預(yù)先鋪好軟瓊脂的6孔板培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，直至生長出在顯微鏡下可觀察到較大克隆(一般培養(yǎng)4周)，考馬斯亮藍(lán)染色過夜，拍照。

1.9流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，均勻接種適量細(xì)胞于6孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過夜；第2天分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNA-1和siRNA-2，孵育6 h更換完全培養(yǎng)液終止轉(zhuǎn)染，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)72 h；收集細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞2次，離心收集細(xì)胞1×105-5×105個；然后用0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，加入PI/RNase staining buffer 0.5 ml，混勻，置暗處、室溫、反應(yīng)10 min，然后于流式細(xì)胞儀(FACSCalibur,美國Becton Dickinson公司)分析細(xì)胞周期，計數(shù)20 000個細(xì)胞，應(yīng)用Modfit分析軟件計算細(xì)胞周期分布。

1.10蛋白免疫印跡法測定肝癌組織及肝癌細(xì)胞中CDKN3的表達(dá)

肝癌組織、細(xì)胞株或經(jīng)處理后的細(xì)胞按常規(guī)方法收集、裂解細(xì)胞，BCA試劑盒測定蛋白濃度，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，膜用含5%脫脂奶的PBST緩沖液封閉30 min，加入1∶1 000稀釋的抗人CDKN3抗體或1∶4 000稀釋的抗人β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜，PBST漂洗3次，然后加入封閉液稀釋的二抗(1∶1 000)，室溫?fù)u床上反應(yīng)30 min，Odyssey Infared Imaging System紅外成像系統(tǒng)掃描膜，檢測目的蛋白表達(dá)。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1CDKN3在肝癌組織、癌旁無瘤組織及人類肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)

CDKN3在肝癌組織中的mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1，見圖1A)，其在63.9%(23/36)肝癌組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào)。同時對36例肝癌標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)的23例標(biāo)本進(jìn)行了普通PCR的驗證，結(jié)果證實：與癌旁組織比較，CDKN3在對應(yīng)的癌組織中表達(dá)都是升高的(見圖1B)。隨機(jī)選擇了4對標(biāo)本，蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)其中2對癌組織中CDKN3蛋白表達(dá)顯著增加，1對略上調(diào)，1對無明顯差異(見圖2A)，與以上的實驗結(jié)果是吻合的。

圖1　CDKN3基因在肝癌組織中的mRNA表達(dá)規(guī)律Figure 1　Expression pattern of CDKN3 mRNA in HCC specimens

圖2　CDKN3蛋白在肝癌標(biāo)本和肝癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)水平Figure 2　Expression level of CDKN3 protein in HCC specimens and cell lines

如圖2B顯示，CDKN3在肝癌細(xì)胞株中廣泛表達(dá)，在HepG2、MHCC-LM3、Huh7、Focus和MHCC-97H細(xì)胞株中表達(dá)相對較高，而在SK-hep-1、PLC/PRF/5、Hep3B細(xì)胞株中表達(dá)相對較低。

2.2基因沉默CDKN3基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生長、克隆形成的影響

本實驗選擇了CDKN3基因表達(dá)量相對較高的肝癌細(xì)胞MHCC-LM3和Huh7細(xì)胞株作為模型。首先利用實時熒光定量PCR評價了siRNA干擾的效果：與陰性對照相比，兩個siRNAs都能夠顯著下調(diào)目的基因mRNA的表達(dá)(P<0.01，見圖3A和圖4A)。同樣蛋白免疫印跡也證實兩個siRNAs成功沉默蛋白CDKN3的表達(dá)(見圖3B和圖4B)。干擾CDKN3基因表達(dá)后，隨著時間的增長，MHCC-LM3和Huh7細(xì)胞的增殖明顯被抑制(P<0.05，見圖5)。進(jìn)一步的克隆形成實驗結(jié)果提示，與對照組比較，沉默CDKN3表達(dá)后，MHCC-LM3和Huh7細(xì)胞形成的克隆數(shù)目和大小都明顯減小(P<0.01，見圖6)。

圖3　MHCC-LM3細(xì)胞中siRNA沉默CDKN3的干擾效率評價Figure 3　Evaluation of CDKN3 knockdown efficiency by siRNA in MHCC-LM3 cells

圖4　Huh7細(xì)胞中siRNA沉默CDKN3的干擾效率評價Figure 4　Evaluation of CDKN3 knockdown efficiency by siRNA in Huh7 cells

圖5　CDKN3低表達(dá)對肝癌MHCC-LM3和Huh7細(xì)胞增殖的抑制作用 (n=3)Figure 5　CDKN3 knockdown suppressed the cell proliferation of MHCC-LM3 and Huh7 cells (n=3)

與對照組si-NC比較，*P<0.01圖6　敲降CDKN3表達(dá)抑制肝癌MHCC-LM3和Huh7細(xì)胞的克隆形成 (n=3)Figure 6　CDKN3 knockdown significantly inhibited the colony formation of MHCC-LM3 and Huh7 cells (n=3)

2.3CDKN3表達(dá)沉默后對肝癌細(xì)胞周期的影響

如圖7所示，si-NC對照組G0/G1期肝癌細(xì)胞的比例為(64.17±2.24)%，si-1和si-2兩干擾組G0/G1期肝癌細(xì)胞的比例分別為(79.09±1.13)%、(79.13±1.26)%。結(jié)果說明，與陰性對照組相比，RNA干擾CDKN3基因表達(dá)后，si-1和si-2這兩干擾組的G0/G1期細(xì)胞比例均明顯增加(P<0.05)，相應(yīng)的S期細(xì)胞明顯減少(P<0.01)。

與對照組si-NC比較，*P<0.05，**P<0.01圖7　CDKN3低表達(dá)對MHCC-LM3細(xì)胞周期的影響Figure 7　Effect of CDKN3 knockdown on cell cycle of MHCC-LM3 cells

3討論

細(xì)胞周期和癌癥發(fā)生的機(jī)制是近年來腫瘤學(xué)研究熱點。細(xì)胞周期的調(diào)控是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，很多癌基因和抑癌基因直接參與了細(xì)胞周期的調(diào)控，甚至本身就是細(xì)胞周期調(diào)控復(fù)合體的主要成分。這些基因變異導(dǎo)致了細(xì)胞周期的失控，失去控制的細(xì)胞無限制增殖，形成的克隆群就是腫瘤。參與細(xì)胞周期調(diào)控的因子主要包括：細(xì)胞周期蛋白(cyclins)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)和細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKI/CDKN)等。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(CDKN3)編碼的蛋白質(zhì)屬于雙特異性蛋白磷酸酶家族。作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子家族成員之一，CDKN3可同時抑制及促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程[8,9]。首先，CDKN3可選擇性地與CDK2特異性結(jié)合并抑制其對Rb蛋白的磷酸化[9]，非磷酸化的Rb蛋白通過與轉(zhuǎn)錄因子E2F1結(jié)合而抑制G1/S期蛋白合成，從而導(dǎo)致G1/S期阻滯[10,11]。其次，CDKN3可與P53、Mdm2蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，進(jìn)而抑制P21蛋白的誘導(dǎo)和阻滯p53靶基因合成，最終易化細(xì)胞周期進(jìn)程[12]。

越來越多的證據(jù)表明，CDKN3在很多腫瘤中表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，如CDKN3在乳腺癌、前列腺癌中高表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和表型的轉(zhuǎn)化[13]；而在卵巢癌中高表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力[14]。本研究闡述了CDKN3在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)情況，并通過RNAi沉默其表達(dá)分析了CDKN3對肝癌細(xì)胞增殖的影響。實驗結(jié)果表明，CDKN3在肝癌中表達(dá)升高，沉默其表達(dá)，肝癌細(xì)胞增殖速率降低，細(xì)胞周期受到阻滯，提示與乳腺癌和前列腺癌類似，CDKN3在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中也起重要的促進(jìn)作用。然而有意思的是，在其他腫瘤中，如腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤，CDKN3呈現(xiàn)低表達(dá)，并通過CDC2信號通路控制細(xì)胞有絲分裂而發(fā)揮抑癌作用[15]。據(jù)此可見，在不同的腫瘤組織CDKN3發(fā)揮的功能不同，甚至截然相反，進(jìn)一步說明CDKN3在細(xì)胞生命活動中的重要性和復(fù)雜性。目前CDKN3在肝癌中發(fā)揮促進(jìn)作用的分子機(jī)制尚不清楚。今后的研究應(yīng)集中在CDKN3如何對下游信號調(diào)控及尋找其所發(fā)揮功能的下游效應(yīng)因子，闡明其在肝癌中的作用機(jī)制。

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Expression of CDKN3 in hepatocellular carcinoma and its effects on cell proliferation and cell cycle of hepatocellular carcinoma cells

LI Miaomiao1*, WANG Haixiao2, TAO Guoquan2

(1DepartmentofGastroenterology,Huai’anFirstPeople’sHospital,NanjingMedicalUniversity,Huai’an223300,China;2DepartmentofGeneralSurgery,Huai’anFirstPeople’sHospital,NanjingMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:13770875120@163.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of CDKN3 gene in hepatocellular carcinoma tissues and explore the effects of CDKN3 silencing on cellular proliferation and cell cycle of hepatocellular carcinoma cells.MethodsThe expression levels of CDKN3 were detected in 36 pairs of HCC samples and corresponding adjacent non-cancerous tissues from surgical resection and human HCC cell lines by semiquantitative RT-PCR, quantitative real-time PCR and Western blot. And the cell proliferation, colony formation and cell cycle were investigated after CDKN3 knockdown by siRNAs.ResultsCompared with adjacent non-cancerous tissues, CDKN3 was significantly upregulated in 63.9%(23/36) HCC tissues at the mRNA level(P<0.000 1). Silencing of CDKN3 by siRNAs significantly inhibited the cell growth and colony formation of MHCC-LM3 and Huh-7 cells(P<0.05). CDKN3 knockdown induced HCC cell arrest at G0/G1 phase using flow cytometry(P<0.05).ConclusionCDKN3 gene is frequently upregulated in HCC and may promote cell growth of HCC by regulating cell cycle. CDKN3 may play an important role in the initiation and development of HCC.

Key words:hepatocellular carcinoma;CDKN3;RNA interference;gene silencing;cell cycle

作者簡介：李苗苗，女，1988-06生，碩士，住院醫(yī)師，E-mail：13770875120@163.com

收稿日期：2016-03-03

中圖分類號：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)06-0496-06

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.003