劉　慧， 盧少平， 尚福軍， 牛曉琳， 艾永飛， 趙連友

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科，西安　710038； *通訊作者，E-mail:xnwz0011@sina.com)

辛伐他汀對結(jié)締組織生長因子誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響及其與ERK1/2的關(guān)系

劉慧， 盧少平， 尚福軍， 牛曉琳， 艾永飛， 趙連友*

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科，西安710038；*通訊作者，E-mail:xnwz0011@sina.com)

摘要：目的觀察辛伐他汀對結(jié)締組織生長因子(CTGF)誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響，探討其作用與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)的關(guān)系。方法以培養(yǎng)的新生的SD大鼠心肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分為對照組(DMEM培養(yǎng)液)、CTGF(50 ng/L)刺激組、CTGF+不同濃度辛伐他汀 (Sim) 組，分別用圖像分析法測定心肌細(xì)胞表面積，[3H]-亮氨酸摻入法測定心肌細(xì)胞蛋白合成速率，考馬斯亮蘭法測定心肌細(xì)胞蛋白含量，蛋白免疫印跡法測定心肌細(xì)胞總ERK1/2(t-ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果CTGF組的心肌細(xì)胞表面積、[3H]-亮氨酸摻入率、心肌細(xì)胞蛋白含量和p-ERK1/2表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.01)；CTGF+不同濃度辛伐他汀(Sim)組的心肌細(xì)胞表面積、[3H]-亮氨酸摻入率、心肌細(xì)胞蛋白含量和p-ERK1/2表達(dá)分別與CTGF組比較均明顯降低(P<0.01)，而且隨著Sim劑量逐漸增加時，這些指標(biāo)也隨之逐漸下降，除CTGF+10-5mol/L Sim組和CTGF+10-4mol/L Sim組之間的細(xì)胞蛋白含量無明顯差異外，各Sim組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；且以上各項(xiàng)指標(biāo)在CTGF+10-4mol/L Sim組與對照組均無顯著差異。t-ERK1/2的表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組間均無差異。結(jié)論辛伐他汀可劑量依賴性地抑制CTGF誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，其作用機(jī)制可能與ERK1/2磷酸化有關(guān)。

關(guān)鍵詞：結(jié)締組織生長因子；辛伐他??；心肌細(xì)胞肥大；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；ERK1/2

心肌細(xì)胞肥大是高血壓左室肥厚(LVH)重要的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)，闡明其發(fā)生及調(diào)控機(jī)制對心血管疾病的防治具有重要意義。許多研究表明，結(jié)締組織生長因子(cardiac myocyte hypertrophy,CTGF)是可刺激心臟成纖維細(xì)胞增殖，膠原合成增多的生長因子[1,2]。本課題組之前的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CTGF也具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用，且其誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制可能是通過ERK1/2的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的[3]。他汀類藥物為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑。近年來，他汀類藥物抑制心肌細(xì)胞肥大，從而改善心臟重構(gòu)已成為一個學(xué)術(shù)界探討課題。辛伐他汀(Sim)對CTGF誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大有何作用，及其作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不十分清楚。本研究觀察辛伐他汀對CTGF誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞肥大的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，旨在探討心肌細(xì)胞肥大的分子生物學(xué)機(jī)制和影響因素，為辛伐他汀逆轉(zhuǎn)心肌肥厚提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動物

出生1-3 d的培養(yǎng)的清潔級封閉群SD大鼠，雌雄不拘，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1．2主要實(shí)驗(yàn)藥品、試劑

辛伐他汀純品由由武漢絲寶藥業(yè)集團(tuán)公司提供，CTGF由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供，[3H]亮氨酸購自中國原子能研究院同位素研究所，胰蛋白酶購自美國Sigma公司，DMEM(高糖)購自美國Gibco公司，新生牛血清購自杭州四季青公司，兔抗大鼠α-橫紋肌肌動蛋白多克隆抗體購自武漢博士德公司，兔抗大鼠t-ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗體購自美國Upstate公司。LS6500液體閃爍儀購自Beckman公司,電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購自Biorad公司，Leica-Q500細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)購自德國Leica公司。

1．3實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施

實(shí)驗(yàn)分為6組：對照組(DMEM培養(yǎng)液)，CTGF刺激組(CTGF加入DMEM培養(yǎng)液中，濃度為50 ng/L，作用24 h), CTGF+不同濃度辛伐他汀(Sim)干預(yù)組(10-7mol/L Sim，10-6mol/L Sim，10-5mol/L Sim，10-4mol/L Sim)(在DMEM培養(yǎng)液中分別加入50 μg/L CTGF和不同濃度Sim,作用24小時)。

1．4心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

無菌條件下取出新生SD大鼠的心臟，剪去心房及血管，將心室在D-Hanks液中剪碎，以0.08%的胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，過濾，1 000 r/min離心5 min，用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸浮，在5%CO2、37 ℃孵箱差速貼壁90 min后取上清，加入0.1 mol/L的5-溴脫氧尿苷，抑制非心肌細(xì)胞的生長。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，培養(yǎng)24 h后逐漸出現(xiàn)自發(fā)性同步搏動，頻率約80-120次/分；免疫組化染色提示α-橫紋肌肌動蛋白免疫組化染色陽性，α-平滑肌肌動蛋白染色陰性，符合心肌細(xì)胞的染色特征；從而鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為心肌細(xì)胞。臺盼藍(lán)染色提示本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞活力大于95%。培養(yǎng)細(xì)胞2 d換液一次。試驗(yàn)中使用的細(xì)胞均為原代培養(yǎng)4 d的細(xì)胞。

1．5心肌細(xì)胞表面積測定

將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞以4×105/ml密度接種于置入玻片的6孔板中，給予干預(yù)因素24 h后，用95%乙醇固定爬片15 min，HE染色。采用Leica-Q500圖像分析系統(tǒng)測定心肌細(xì)胞表面積，隨機(jī)選取5個視野，每個視野隨機(jī)測定5個細(xì)胞，取其平均值，結(jié)果以μm2表示。

1．6心肌細(xì)胞蛋白合成速率的測定

將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞以4×105/ml接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 ml。給予干預(yù)因素后每孔加入預(yù)溫至37 ℃的[3H]-亮氨酸(終濃度為3.7×104Bq/ml)繼續(xù)培養(yǎng)6 h，用4 ℃PBS洗細(xì)胞2次，多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞裂解液至玻璃纖維濾膜上，用10%三氯乙酸沖洗，濾膜烘干后置閃爍記數(shù)管中，加入閃爍液，以LS6500型液態(tài)閃爍計數(shù)儀測定放射性。結(jié)果以cpm/well值表示。

1．7心肌細(xì)胞蛋白含量的測定

將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞以4×105/ml密度接種于24孔板，給予干預(yù)因素24 h后，吸盡培養(yǎng)液棄掉，用PBS洗2次,用0.125%的胰蛋白酶消化收集每孔細(xì)胞。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，加0.1 ml SDS(0.1%)，置100 ℃水浴30 min，使細(xì)胞裂解。用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用考馬斯亮蘭法測定各孔總蛋白含量，根據(jù)每孔細(xì)胞數(shù)，算出每個心肌細(xì)胞蛋白含量,單位用ng/cell表示。1．8蛋白免疫印跡法測定t-ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白水平給予干預(yù)因素24 h后終止心肌細(xì)胞的培養(yǎng)，加細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。取20 μg蛋白加上樣緩沖液煮沸變性5 min。行SDS-PAGE電泳和蛋白轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加兔抗大鼠t-ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗體(按說明稀釋)，4 ℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(按1∶10 000稀釋)孵育2 h,ECL發(fā)光，在暗室中X片曝光、顯影、定影，顯示特異的蛋白條帶,最后對結(jié)果進(jìn)行吸光度掃描分析。

1．9統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1不同濃度辛伐他汀對CTGF誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞表面積、蛋白合成速率、蛋白含量的影響

CTGF刺激組心肌細(xì)胞表面積、蛋白合成速率及蛋白含量與對照組比較均顯著增加(P<0.01)；CTGF+不同濃度Sim組的心肌細(xì)胞表面積、蛋白合成速率及蛋白含量與CTGF刺激組比較均明顯降低(P<0.01，見表1)，且Sim劑量逐漸增加時，這些指標(biāo)也隨之逐漸下降，除CTGF+10-5l/L Sim組和CTGF+10-4mol/L之間的細(xì)胞蛋白含量無明顯差異外，各Sim組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01，見表1)。且當(dāng)Sim濃度達(dá)到10-4mol/L時，以上各指標(biāo)均較對照組無顯著差異。

表1辛伐他汀對CTGF誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表面積、蛋白合成速率及蛋白含量的影響

Table 1Effect of simvastatin on CTGF-induced myocardial cell surface, protein synthesis rate and protein contents

組別細(xì)胞表面積(μm2)細(xì)胞蛋白合成速率(cpm/well)細(xì)胞蛋白含量(ng/cell)對照組676.38±90.25926.32±83.560.635±0.072CTGF(50μg/L)組1825.36±173.55ab2300.55±115.47ab1.656±0.216abCTGF+10-7mol/LSim組1530.58±151.58ab1989.36±101.22ab1.206±0.152abCTGF+10-6mol/LSim組1111.46±135.63ab1551.14±102.55ab0.895±0.123abCTGF+10-5mol/LSim組901.18±110.47ab1232.10±93.58ab0.722±0.082bCTGF+10-4mol/LSim組725.24±92.35b1033.46±90.29b0.685±0.065b

與對照組比較，aP<0.01；與CTGF組比較，bP<0.01；細(xì)胞表面積和蛋白合成速率中4個Sim組間比較，P<0.01；蛋白含量除CTGF+10-5mol/L Sim組與CTGF+10-4mol/L Sim組間沒有差異，其余Sim組間差異P<0.05或P<0.01

2.2辛伐他汀對CTGF誘導(dǎo)心肌細(xì)胞t-ERK1/2和p-ERK1/2表達(dá)的影響

CTGF刺激組的心肌細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)明顯高于對照組，CTGF+不同濃度Sim組心肌細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)與CTGF刺激組比較均明顯降低(P<0.01)，且Sim劑量增加時，p-ERK1/2表達(dá)水平也隨之逐漸下降，各Sim組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。且當(dāng)Sim濃度達(dá)到10-4mol/L時，p-ERK1/2表達(dá)較對照組無顯著差異。心肌細(xì)胞t-ERK1/2的表達(dá)在各組沒有明顯的差異(見圖1和表2)。

1.對照組(DMEM培養(yǎng)液組)；2.CTGF(50 g/L)刺激組；3.CTGF+10-7 ol/L Sim組；4.CTGF+10-6 mol/L Sim組；5. CTGF+10-5 mol/L Sim組；6.CTGF+10-4 mol/L Sim組圖1　辛伐他汀對CTGF誘導(dǎo)心肌細(xì)胞t-ERK1/2和p-ERK1/2表達(dá)的影響Figure 1　Effects of simvastatin on the expression of t-ERK1/2 and p-ERK1/2 in cardiac myocytes induced by CTGF

表2辛伐他汀對CTGF誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ERK1/2表達(dá)的影響(%)

Table 2Effects of simvastatin on the expression of t-ERK1/2 and p-ERK1/2 in cardiac myocytes induced by CTGF (%)

組別t-ERK1/2p-ERK1/2對照組100100CTGF刺激組107.23±15.83220.65±20.69abCTGF+10-7mol/LSim組105.13±13.25176.57±16.47abCTGF+10-6mol/LSim組103.59±13.56143.33±15.23abCTGF+10-5mol/LSim組103.26±14.41120.15±12.65abCTGF+10-4mol/LSim組105.36±12.58108.34±12.79b

與對照組比較,aP<0.01；與CTGF刺激組比較，bP<0.01； p-ERK1/2中除CTGF+10-5mol/L Sim組和CTGF+10-4mol/L Sim組比較，P<0.05，其余Sim組間比較均P<0.01

3討論

左室肥厚是近年來研究熱點(diǎn)，其病理改變主要包括兩方面：一是心肌細(xì)胞的肥大；二是細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加[4]。目前認(rèn)為，左室肥厚是心力衰竭、心律失常、心絞痛、急性心肌梗死、猝死心血管事件的獨(dú)立危險因素。因此，有關(guān)如何有效預(yù)防和逆轉(zhuǎn)左室肥厚及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，對心血管疾病的防治具有非常重要的作用。

CTGF是Bradham等[5]于1991年在篩選人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)文庫時首次發(fā)現(xiàn)的,為含有349個氨基酸的肝素結(jié)合型蛋白。近年來許多研究證實(shí)：CTGF在高血壓、心力衰竭等各種心血管疾病中CTGF表達(dá)均明顯增高，并可通過其多種生物學(xué)作用參與心肌重塑、心臟纖維化等病變的發(fā)生發(fā)展[2]。Clerk等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮素-1等致肥大激動劑誘導(dǎo)的肥大的心肌細(xì)胞中，CTGF表達(dá)增加，并可持續(xù)8-24 h。他汀類藥物為膽固醇抑制劑，近年研究表明，他汀還具有獨(dú)立于調(diào)脂之外的心血管保護(hù)作用，如抗炎、改善血管內(nèi)皮、穩(wěn)定斑塊等，同時可抑制血管平滑肌增殖，抑制心肌細(xì)胞肥大，從而逆轉(zhuǎn)左室肥厚[7,8]。我們在本實(shí)驗(yàn)中觀察了CTGF和CTGF+不同濃度Sim對心肌細(xì)胞肥大的影響，結(jié)果表明，在50 μg/L CTGF刺激下，心肌細(xì)胞表面積、蛋白合成速率、蛋白含量較對照組顯著增加，這與本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致[3]；給予不同濃度Sim干預(yù)后，心肌細(xì)胞表面積、蛋白合成速率、蛋白含量較CTGF組均明顯降低(P<0.01)，且Sim劑量逐漸增加時，這些指標(biāo)也隨之逐漸下降,除CTGF+10-5mol/L Sim組和CTGF+10-4mol/L Sim組之間的細(xì)胞蛋白含量無明顯差異外，各Sim組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),且當(dāng)Sim濃度達(dá)到10-4mol/L時，以上各指標(biāo)均較對照組無顯著差異。提示Sim可劑量依賴性抑制心肌細(xì)胞肥大，且Sim抑制心肌細(xì)胞肥大的理想濃度可能是10-4mol/L。

在心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)的過程中，可能有多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同參與。目前國內(nèi)研究中，他汀抑制心肌細(xì)胞肥大、逆轉(zhuǎn)左室肥厚的機(jī)制有：通過抑制PI3K/PKB途徑而下調(diào)蛋白激酶表達(dá)[9]；抑制JAK-STAT信號途徑[10]；抑制Ca2+/CaN信號途徑從而抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[11]；對TLR4基因表達(dá)的影響[12]等。是否還有其他分子機(jī)制，目前尚在進(jìn)一步研究中。有人提出，ERK的表達(dá)及活化可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[13,14]。本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)，CTGF可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，其作用可能是通過ERK1/2的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的[3]。ERK 1/2是ERK1和ERK2的統(tǒng)稱，為絲裂原活化的蛋白激酶MAPKs家族成員之一,是將信號從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵。ERK途徑受細(xì)胞周期及以及細(xì)胞外刺激的調(diào)控，是細(xì)胞生長、活化與存活等過程的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，給予不同濃度Sim干預(yù)后，心肌細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)較CTGF組明顯降低，且Sim劑量逐漸增加時，p-ERK1/2的表達(dá)也隨之逐漸下降(P<0.01)；各Sim組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。且當(dāng)Sim濃度達(dá)到10-4mol/L時，p-ERK1/2較對照組無顯著差異。而t-ERK1/2表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組間變化則不明顯。心肌細(xì)胞在生理狀態(tài)下即有t-ERK1/2表達(dá)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)各組t-ERK1/2無明顯變化但p-ERK1/2的卻有顯著變化，進(jìn)一步提示ERK1/2在磷酸化后才介導(dǎo)Sim抑制CTGF誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用,這種抑制作用具有劑量依賴性，且Sim抑制心肌細(xì)胞肥大的理想濃度可能是10-4mol/L。

綜上所述，辛伐他汀可劑量依賴性地抑制CTGF誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，從而參與抑制心臟重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展，而且該作用機(jī)制可能與其抑制ERK1/2的磷酸化有關(guān)，這就為辛伐他汀抑制心肌重構(gòu)提供了進(jìn)一步的依據(jù)。但辛伐他汀抑制CTGF誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大還有無其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of simvastatin on hypertrophic cardiac myocytes induced by connective tissue growth factor and its relation with ERK1/2

LIU Hui, LU Shaoping,SHANG Fujun, NIU Xiaolin, AI Yongfei, ZHAO Lianyou*

(DepartmentofCardiology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China；*Correspondingauthor,E-mail:xnwz0011@sina.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of simvastatin on cardiac myocytes hypertrophy induced by connective tissue growth factor(CTGF) and its relationship with ERK1/2.MethodsThe neonatal Sprague-Daley(SD) rats cardiomyocytes were divided into six groups: control group(cultured with DMEM),CTGF(50 ng/L) group and CTGF+different concentrations of simvastin groups.Image analysis system was used to measure the cell surface area.[3H]-leucine incorporation method was used to measure protein synthesis rate of myocytes. Coomassie brilliant blue method was used to measure contents of cardiac myocytes protein.Western blot was used to study the protein expression levels of t-ERK1/2 and p-ERK1/2.ResultsCompared with control group, the myocardial cell surface area,[3H]-leucine incorporation rate, myocardial cell protein contents and p-ERK1/2 expression were significantly increased in CTGF group(P<0.01). The myocardial cell surface area,[3H]-leucine incorporation rate, myocardial cell protein and P-ERK1/2 expression in CTGF+different concentrations of Sim groups were significantly lower than in CTGF group(P<0.01), and these indexes were also gradually decreased with the increase of dose of Sim.The content of cardiac myocytes proteins was significantly different between different concentrations groups(P<0.05,P<0.01) except beween CTGF+10-5mol/L Sim group and CTGF+10-4mol/L Sim group. The above indexes showed no difference between CTGF+10-4mol/L Sim group and control group. The expression of t-ERK1/2 showed no difference among six groups.ConclusionSimvastatin could inhibit CTGF-induced myocyte hypertrophy in a dose dependent manner, which may be related to ERK1/2 phosphorylation.

Key words:connective tissue growth factor;simvastatin;cardiac myocyte hypertrophy；signal transduction;ERK1/2

作者簡介：劉慧，女，1978-09生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：wenbei0921@163.com

收稿日期：2016-01-28

中圖分類號：R363

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)06-0489-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.001