王衛(wèi)衛(wèi)，王佳佳，徐春紅，郭白銀，戴保秀，徐國萍

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理　671000）

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HDAC1 siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞EMT的影響

王衛(wèi)衛(wèi)，王佳佳，徐春紅，郭白銀，戴保秀，徐國萍*

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

［摘要］目的：探討HDAC1 siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞EMT過程中細(xì)胞表型、功能的影響。方法：加入HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染RLE-6TN后，再加TGF-β1后收取細(xì)胞。采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)改變，免疫熒光檢測表型改變，W.B及實(shí)時定量PCR檢測其HDAC1、8，E-cad及α-SMA的表達(dá)；Transwell小室檢測細(xì)胞體外遷移能力。結(jié)果：形態(tài)學(xué)上，TGF-β1能誘導(dǎo)RLE-6TN發(fā)生EMT，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞多邊形、鋪路石狀；熒光顯微鏡下，TGF-β1組出現(xiàn)α-SMA表達(dá)，HDAC1表達(dá)增加，轉(zhuǎn)染組相反；在mRNA水平，TGF-β1組E-cad表達(dá)下調(diào)、HDAC1、8上調(diào)，轉(zhuǎn)染組HDAC1、8表達(dá)下調(diào)，α-SMA上調(diào)。在蛋白水平，TGF-β1組E-cad表達(dá)下調(diào)、α-SMA及HDAC1上調(diào)，轉(zhuǎn)染組相反。體外遷移能力方面，TGF-β1組遷移細(xì)胞增多、轉(zhuǎn)染組減少。結(jié)論：HDAC1 siRNA能部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮EMT。

［關(guān)鍵詞］HDAC1 siRNA；TGF-β1；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

［DOI］10. 3969 / j. issn. 2096-2266. 2016. 04. 009

肺纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）是多種肺間質(zhì)性疾病的共同結(jié)果，引起呼吸衰竭的重要原因。近年隨著人口老齡化進(jìn)程，肺間質(zhì)纖維化發(fā)病率逐年上升。但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，治療效果不佳。

肺纖維化主要的效應(yīng)細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞（Myofibroblast，MFb）。早期研究發(fā)現(xiàn)，MFb可來自肺間充質(zhì)細(xì)胞及骨髓〔1〕。近年及本課題組前期的研究證實(shí)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞通過上皮向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）也可成為MFb的另一個主要來源〔2-3〕。越來越多的研究明確了EMT在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的重要作用〔4〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）與多種組織和器官纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其抑制劑Trichostatin A（TSA）能通過降低細(xì)胞內(nèi)HDAC的水平、抑制細(xì)胞EMT，而能防止心、腎、肝及皮膚纖維化〔5-8〕。本課題前期研究亦證實(shí)TSA能部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮EMT〔9〕。本部分研究擬通過siRNA技術(shù)進(jìn)一步佐證抑制HDAC對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮EMT的影響，從不同角度探討HDAC在肺上皮EMT過程中的作用，為器官纖維化治療提供新的靶點(diǎn)。

1　材料

1.1細(xì)胞培養(yǎng)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞系RLE-6TN購自美國ATCC，采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2主要試劑FBS購自Gibco公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購自Corning公司，細(xì)胞凍存液、TSA、TGF-β1購自Sigma公司，E-cad抗體購自CST公司，α-SMA、HDAC1、HDAC8抗體購自abcam公司，β-actin抗體購自santacruz公司，RT-PCR Kit購自Invitrogen，X-tremeGENE、siRNA Transfection Reagent購自Roche公司；siRNA序列、NC對照均由廣州吉格生物科技有限公司合成。

1.3主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱、-80℃超低溫冰箱、超凈臺、multisKan酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)（ThermoForma公司，USA），熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS），實(shí)時熒光PCR儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD）低溫高速離心機(jī)、移液器（Eppendorf）。

2　方法

2.1觀察HDAC1 siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞EMT的影響

2.1.1HDAC1siRNA合成HDAC1 siRNA序列和陰性對照均由廣州吉格生物科技有限公司合成。HDAC1siRNA序列，正義鏈：5’-GCCGGUCAUGUCCAAAGUATT-3’；反義鏈：5’-UACUUUGGACAUGACCGGCTT-3’。

2.1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理體外培養(yǎng)的RLE-6TN，實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、TGF-β1組、陰性對照組、HDAC1 siRNA組、TGF-β1+HDAC1 siRNA共用組（轉(zhuǎn)染組）。

2.1.3倒置相差顯微鏡觀察HDAC1 siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞形態(tài)的影響當(dāng)細(xì)胞生長融合至60%～80%時，換含0.5%FBS培液靜止24 h，實(shí)驗(yàn)同上分組后將HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入細(xì)胞中，再加TGF-β1作用48 h后，使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)并拍照。以空白及陰性siRNA組作對照組。

2.1.4免疫熒光檢測HDAC1 siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞表型改變的影響實(shí)驗(yàn)同上分組，作用48 h后，甲醇固定，PBS漂洗后；加入一抗，37℃1 h，4℃過夜；次日，加二抗，37℃1 h，DAPI復(fù)染，封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。以空白及陰性siRNA組作對照。

2.1.5Real-time RT-PCR檢測HDAC1 siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞HDAC1、8及EMT標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響細(xì)胞培液靜止24 h后，實(shí)驗(yàn)同上分組后將HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入細(xì)胞中，再加TGF-β1作用0、6、12、24 h后，Trizol提取細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度且進(jìn)行RNA電泳鑒定，保存?zhèn)溆?。Real-time RT-PCR反應(yīng)體系略。以空白及陰性siRNA組作對照。

2.1.6Western Blot檢測HDAC1 siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞HDAC1、8及EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響各組細(xì)胞作用0、12、24、48、72 h后，收取細(xì)胞提取蛋白，檢測濃度后，取50 μg蛋白進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。加一抗，37℃1 h，4℃過夜。洗滌后加二抗，37℃1 h，加發(fā)光液后封膜、顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，用隨機(jī)附帶軟件計(jì)算灰度值。

2.1.7Transwell小室檢測HDAC1 siRNA對TGF-β 1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞體外遷移能力的影響將100 mL RLE-6TN細(xì)胞懸液（1×106個/mL）加入到24-transwell小室的上室中，下室加入600 mL DMEM/ F12培液后實(shí)驗(yàn)同上分組，于37℃培養(yǎng)箱孵育12 h；經(jīng)HE染色后，輕輕用棉簽擦凈24-transwell小室上室面未遷移的細(xì)胞，計(jì)數(shù)穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)目，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組間比較采用單因素方差分析，Post Hoc檢驗(yàn)，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析處理數(shù)據(jù)。

3　結(jié)果

3.1HDAC siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞形態(tài)的影響與空白對照組、陰性對照組及HDAC1 siRNA組比較，TGF-β1組細(xì)胞稍小，細(xì)胞間隙略變大，形態(tài)成梭形、紡錘形，HDAC1 siRNA+ TGF-β1組細(xì)胞呈多邊形、鋪路石狀。

3.2HDAC siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞表型改變的影響與空白對照組和陰性對照組比較，TGF-β1組E- cad蛋白表達(dá)明顯減弱，HDAC1 siRNA組及HDAC1 siRNA+ TGF-β1組可見E-cadherin蛋白呈顆粒狀、膜及胞漿表達(dá)（空白對照和陰性對照組呈線狀、膜表達(dá)）；與空白和陰性對照組比較，TGF-β1組細(xì)胞有α-SMA蛋白表達(dá)，HDAC1 siRNA組未見α-SMA蛋白表達(dá)，HDAC1 siRNA+ TGF-β1組有弱表達(dá)。與空白和陰性對照組比較，TGF-β1組細(xì)胞HDAC1蛋白表達(dá)增加，HDAC1 siRNA組及HDAC1 siRNA + TGF-β1組HDAC1蛋白表達(dá)減弱（HDAC1表達(dá)于胞核）?？瞻讓φ战M、陰性對照組、TGF-β1組及HDAC1 siRNA+ TGF-β1組細(xì)胞均未檢測到HDAC8蛋白表達(dá)，HDAC1 siRNA組胞漿內(nèi)有HDAC8蛋白弱表達(dá)。

3.3HDAC1 siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞上皮及間質(zhì)mRNA表達(dá)的影響與不加TGF-β1組相比，TGF-β1作用24 h后，E-cad mRNA表達(dá)下調(diào)，HDAC1、HDAC8 mRNA表達(dá)上調(diào)，α- SMA mRNA的表達(dá)無明顯改變，TGF-β1+HDAC1 siRNA組，HDAC1、HDAC8 mRNA表達(dá)下調(diào)，E-cad mRNA表達(dá)無明顯改變。α-SMA mRNA的表達(dá)上調(diào)。

3.4HDAC1 siRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞上皮及間質(zhì)蛋白表達(dá)的影響與不加TGF-β1組及siRNA陰性對照組相比，TGF-β1作用48 h后，E-cad蛋白表達(dá)下調(diào)，為對照組的0.94倍（P=1.000）、α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)，為對照組的1.23倍（P = 0.064）、HDAC1蛋白表達(dá)上調(diào)，為對照組的1.07倍（P=0.590）；與TGF-β1作用加HDAC1 siRNA組比較，TGF-β1作用48 h后，E-cad蛋白表達(dá)上調(diào)，為對照組的1.37倍（P=0.057）、α-SMA蛋白表達(dá)下調(diào)，為對照組的0.84倍（P=0.105）、HDAC1蛋白表達(dá)下調(diào)，為對照組的0.82倍（P=0.174）、HDAC8蛋白表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組間無明顯差異。

3.5HDAC1 siRNA對RLE-6TN細(xì)胞體外遷移能力的影響與空白及陰性對照組比較，TGF-β1作用后12 h，遷移到微孔濾膜上的RLE-6TN細(xì)胞是對照組的2.95倍（P=0.000）；HDAC1 siRNA處理組及HDAC1 siRNA處理同時加入TGF-β1組后12 h，遷移到微孔濾膜上的RLE-6TN細(xì)胞減少，分別為對照組的1.73倍（P=0.002）、1.57倍（P=0.004）。見圖1。

圖1　HDAC1-siRAN對TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞遷移能力的影響

4　討論

肺纖維化是一種能引起呼吸衰竭的慢性進(jìn)行性、致死性肺部疾病，目前臨床所用藥物有一定療效，但副作用大，應(yīng)用受限〔10〕。進(jìn)一步尋找毒性小的、安全的治療藥物迫在眉睫。近年研究表明，組蛋白去乙?；福℉istone deacetylase，HDAC）在多種器官纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，而其抑制劑（HDACi）通過不同的作用機(jī)制能不同程度改善、逆轉(zhuǎn)腎、肝、心肌、皮膚纖維化〔5-8〕，且在肝、腎纖維化中，應(yīng)用HDAC抑制劑對正常肝及腎小管細(xì)胞幾乎無毒性。本課題組前期的研究亦表明，HDAC抑制劑TSA能在體外部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺Ⅱ型上皮細(xì)胞的EMT〔5〕，也能改善肺纖維化。

RNA干擾（RNAi）是用于研究疾病基因組學(xué)和功能基因組學(xué)信號傳導(dǎo)通路的工具。RNAi在RNA水平起作用，又被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默。其發(fā)揮效應(yīng)所必須的中介因子是siRNA。與其他技術(shù)相比，RNAi技術(shù)高效性、特異性及簡便快捷。楊洋等〔11〕采用瞬時轉(zhuǎn)染證實(shí)HDAC1-siRNA能有效抑制腎小管上皮細(xì)胞的增殖，其作用與TSA一致。研究表明，HDAC1可通過抑制E-cad及ZO-1的啟動子活性調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，利用RNAi降低HDAC1水平或者過表達(dá)其顯性失活突變體可抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞EMT〔12〕。本實(shí)驗(yàn)在前述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染HDAC1siRNA到體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞RLE-6TN、再加TGF-β1后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞呈多邊形、鋪路石狀等典型上皮細(xì)胞形態(tài)，而單用TGF-β1細(xì)胞成梭形、紡錘形；轉(zhuǎn)染后細(xì)胞保留上皮標(biāo)志物E-cad、未出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物SMA的熒光；在蛋白及mRNA水平，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞HDAC1、8及SMA表達(dá)下調(diào)，E-cad表達(dá)上調(diào)；本實(shí)驗(yàn)Transwell小室體外遷移表明，轉(zhuǎn)染RNAi后RLE-6TN細(xì)胞遷移能力下降，與Weiwei Leia等〔12〕在小鼠肝細(xì)胞中的報(bào)道一致。

上述實(shí)驗(yàn)表明，TGF-β1體外誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變，可以通過應(yīng)用HDAC1 siRNA部分逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而達(dá)到抑制EMT、降低肺纖維化發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的目的。采用RNA干擾技術(shù)沉默、封閉HDAC將有望成為阻抑器官纖維化新的分子靶點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯李楊）

Effect of HDAC1 siRNA on Alveolar Epithelial TypeⅡCells EMT Induced by TGF-β1

Wang Weiwei，Wang Jiajia，Xu Chunhong，Guo Baiyin，Dai Baoxiu，Xu Guoping*
（Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

〔Abstract〕Objective: To investigate the effect of HDAC1siRNA on phenotypic changes and function of TGF-β1-induced typeⅡalveolar epithelial cells（RLE-6TN）to EMT. Methods: RLE-6TN cells were cultured and treated with HDAC1 siRNA，then TGF-β1 was added to the cells before collecting cells. The morphological changes were examined by phase-contrast microscope while the phenotypic changes were examined by the immune fluorescence method. The protein and mRNA expression of HDAC1，HDAC8，E-cad and α-SMA of RLE-6TN Cells were assayed by Western Blot and Real-time RT-PCR，respectively. The migration in vitro of cells was assayed by Transwell chambers. Results: Morphologically，TGF-β1 could induce the EMT process of the RLE-6TN cells；after transfection，cells were polygonal and like the flagstones. Under fluorescence microscope，the cells had expression of α-SMA with increasing expression of HDAC1 in the group treated with TGF-β1，transfection group is the opposite. At the mRNA level，TGF-β1 could down-regulate the expression of E-cad with up-regulation the HDAC1 and HDAC8 expressions；after transfection，the HDAC1 and HDAC8 expressions were down-regulated with up-regulation the α-SMA expression. At the protein level，TGF-β1 could induce the down-regulation expression of E-cad with up-regulation expression of the α-SMA and HDAC1，transfection group is the opposite. In vitro migration ability，TGF-β1 could increase migration cells while transfection group reduced. Conclusion: HDAC1 siRNA could partially reverse the EMT of RLE-6TN cells induced by TGF-β1 in vitro.

〔Key words〕HDAC1 siRNA；TGF-β1；alveolar epithelial typeⅡcells；EMT

［中圖分類號］R563.1+3

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號］2096-2266（2016）04-0033-04

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81100045）

［收稿日期］2015-12-23［修回日期］2016-01-13

［作者簡介］王衛(wèi)衛(wèi)，碩士研究生，主要從事肺纖維化基礎(chǔ)研究.

*通信作者：徐國萍，教授，博士.