趙會(huì)然，王玉珍，許瑞嵐，宗莉莉，胡　軍，郭　潔

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理　671000）

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云南部分蘭科植物多糖的提取及含量測定

趙會(huì)然，王玉珍，許瑞嵐，宗莉莉，胡軍，郭潔*

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

［摘要］目的：建立云南部分蘭科植物多糖含量測定的方法，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行研究。方法：采用傳統(tǒng)水提取方法提取多糖，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，用苯酚-硫酸法測定多糖的含量，并以其為考察指標(biāo)，采用提取條件的優(yōu)化篩選最佳提取工藝。結(jié)果：葡萄糖在0.000～0.020 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為A=55.55c（mg/mL）+ 0.001（r=0.999 8），平均加標(biāo)回收率為99.7%，RSD=3.13%（n=6）；最佳顯色條件：苯酚用量1.0 mL、濃硫酸用量7.0 mL、顯色溫度80℃、顯色時(shí)間30 min；提取蘭科植物多糖的最佳工藝條件為：提取溫度70℃，料液比1：40，提取時(shí)間2 h。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確，優(yōu)選出的提取工藝重復(fù)性好。

［關(guān)鍵詞］蘭科植物；多糖；提取條件；含量測定；苯酚-硫酸法

［DOI］10. 3969 / j. issn. 2096-2266. 2016. 04. 007

蘭科（Orchidaceac）約700屬，20 000～35 000種〔1〕，主要分布在熱帶地區(qū)〔2〕。中國有194屬，1 388種，而云南、臺(tái)灣和海南島居多，其中云南目前有151屬，709種〔3〕，在各省區(qū)中居第1位，故有“植物王國”的美譽(yù)。蘭科植物中的石斛、天麻、白芨、芋蘭、杜鵑蘭等是重要的中藥材。石斛的主要藥用成分為多糖和生物堿等〔4〕，而植物多糖因有增強(qiáng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，抗衰老，抗腫瘤，抗輻射等作用而受到廣泛的重視〔5-6〕。石斛混淆品眾多，包括石斛屬外的金石斛屬、石仙桃屬、石豆蘭屬和貝母蘭屬等植物〔7〕，但其藥用物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，不利于這些藥用植物的深度開發(fā)或質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，有必要對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行深入的研究。

經(jīng)過查閱文獻(xiàn)資料，篩選出部分云南產(chǎn)蘭科植物作為研究對(duì)象，對(duì)這些植物中多糖含量的研究尚未見報(bào)道。本文用苯酚-硫酸法〔8〕對(duì)這些石斛混淆品的多糖含量進(jìn)行測定，為進(jìn)一步開發(fā)和利用蘭科植物提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；AL204電子天平（梅特勒—托利多儀器上海有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SZCL-2數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；FW100型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2試劑無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸，以上試劑均為分析純。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖250.0 mg，以適量蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，即得濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取5 mL濃度為1 mg/mL葡萄糖溶液至50 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，即得濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

5%苯酚溶液的配制：在40℃的溫度下，溶解部分苯酚，再向溶解的苯酚中加入0.1 g鋁片進(jìn)行常壓蒸餾，收集182℃餾分。稱取苯酚餾分5.0 g，用適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，然后將其轉(zhuǎn)移至100 mL棕色瓶中，即得5%苯酚溶液，備用。

1.3樣品蘭科植物：滇西貝母蘭Coelogynecalcicola；喉紅石斛Dendrobium christyanum；密花毛蘭Eriaspicata；鐮翅羊耳蒜Liparis bootanensis；溫氏卷瓣蘭Bulbophyllum wendlandianum。把各株植被分開，再單獨(dú)烘干，粉碎，過孔徑0.30 mm篩，備用。以上樣品均采購于云南大理三月街藥材市場，由昆明植物研究所胡江苗副研究員鑒定。

樣品溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取5.000 0 g樣品粉末，置于圓底燒瓶中，依次加入200 mL蒸餾水，在70℃的水浴中加熱提取1 h，重復(fù)提取2次，合并提取液并濃縮至20 mL左右，冷卻至室溫后加入3倍體積的95%乙醇，搖勻，在4℃下放置12 h，抽濾，風(fēng)干得粗多糖。稱取粗多糖0.025 0 g，用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，即得樣品溶液。

1.4方法分別取適量試液和空白液置于干燥的具塞比色管中，加蒸餾水至2.0 mL，然后加入5%苯酚溶液1.0 mL，將試管放入冰水中，沿試管壁緩慢加入濃H2SO47.0 mL，待冷卻后，在冰水中搖勻。然后放入80℃水浴中加熱30 min，流水冷卻至室溫。在選定波長下，以試劑空白為參比，測定試液的吸光度。

1.5實(shí)驗(yàn)條件的選擇

1.5.1測定波長的選擇取適量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、滇西貝母蘭提取液、蒸餾水，按實(shí)驗(yàn)方法顯色后，以蒸餾水為參比，在400～600 nm波長內(nèi)分別測繪3種溶液的吸收曲線。見圖1。結(jié)果表明，葡萄糖和樣品提取液均在488 nm處有最大吸收。因此以488 nm作為測定波長。

圖1　吸收曲線

1.5.2試劑用量、顯色溫度、顯色時(shí)間的選擇分別考察了苯酚用量、濃H2SO4用量、顯色溫度和顯色時(shí)間對(duì)測定結(jié)果的影響。在選定波長下測定試液吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：5%苯酚溶液用量在0.9～1.0 mL、濃H2SO4用量在6.5～7.5 mL、顯色溫度在60～90℃、顯色時(shí)間在10～50 min范圍內(nèi)，測定體系的吸光度較大且基本不變，所以確定5%苯酚用量為1.0 mL、濃H2SO4用量為7.0 mL、顯色溫度為70℃、顯色時(shí)間為30 min作為最佳測定條件。

1.5.3精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)移取樣品溶液1.0 mL，分別置于6個(gè)10 mL具塞比色管中，按實(shí)驗(yàn)方法顯色后，測定吸光度，計(jì)算RSD=2.00%（n=6）。實(shí)驗(yàn)表明，在選定的測定條件下，測定體系在室溫下至少穩(wěn)定2 h。

2　結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL至干燥的具塞比色管中，按實(shí)驗(yàn)方法、在選定實(shí)驗(yàn)條件下測定試液的吸光度并測繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在葡萄糖含量為0.000～0.020 mg/mL范圍內(nèi)，試液的吸光度與葡萄糖濃度有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A=55.55c（mg/mL）-0.001，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 8。

2.2樣品溶液多糖含量的測定移取1.0 mL樣品溶液，按實(shí)驗(yàn)方法、在選定條件下顯色后測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算多糖的含量，平行測定6次，取平均值。見表1。

表1　樣品中多糖含量測定結(jié)果（n=6）

由表1可知，不同樣品中多糖的含量有差異，其中滇西貝母蘭的多糖含量最高，鐮翅羊耳蒜的多糖含量最低。

2.3加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)移取適量樣品溶液，分別加入0.02、0.08 mg葡萄糖，進(jìn)行回收率測定（n=6）。平均回收率為99.7%，RSD=3.13%。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度高。見表2。

2.4樣品中多糖提取條件的優(yōu)化

2.4.1粗多糖的提取流程樣品粉末→加適量水后加熱提取→抽濾→合并提取液→濃縮→加入適量95%乙醇在4℃下醇沉12 h→抽濾→風(fēng)干→稱重。

2.4.2提取條件的優(yōu)化考察提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對(duì)提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取率隨提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)的增加均有所增加，當(dāng)溫度增加到70℃后，提取率稍有下降；提取時(shí)間增加到2 h后、料液比增大到1：40以上、提取次數(shù)增加到2次以上，提取率基本不變。因此選定提取溫度為70℃，提取時(shí)間為2 h，料液比為1：40，為節(jié)約時(shí)間及降低能耗，選擇提取次數(shù)為2次。

表2　加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在選定的提取條件下，分別對(duì)不同樣品進(jìn)行3次平行提取，計(jì)算提取率。見表3。

表3　樣品提取率測定結(jié)果（n=3）

3　討論

本實(shí)驗(yàn)通過水提醇沉法提取多糖，并優(yōu)化了提取條件，方法簡便、準(zhǔn)確，使樣品中的多糖提取較為完全，保障了后續(xù)測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸比色法測定多糖的含量，由精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法的精密度、準(zhǔn)確度較高，穩(wěn)定性好，可作為蘭科植物多糖含量測定方法。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)試液顯色的起始溫度不一致會(huì)對(duì)測定結(jié)果有影響，我們采取在冰水浴中緩慢加入濃硫酸，并在冰水浴中將試液搖勻，保證了顯色起始溫度不受濃硫酸稀釋時(shí)放熱的影響，使顯色起始溫度一致，從而使樣品測定結(jié)果更準(zhǔn)確。

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（責(zé)任編輯毛本勇）

Extraction of Polysaccharide and Content Determination of Yunnan Orchidaceae Plants

Zhao Huiran，Wang Yuzhen，Xu Ruilan，Zong Lili，Hu Jun，Guo Jie*
（College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

〔Abstract〕Objective: To establish the method for determining the contents of polysaccharides and to explore the extraction technique for polysaccharides from Yunnan orchidaceae plants. Methods: The polysaccharide was extracted with the traditional water extraction，using glucose as the standard，and the contents of polysaccharides was measured by the phenol-sulfuric acid method. With the content of polysaccharides as an index，the univariate test were performed to find the optimal extraction technique. Results: A good linear relationship with a regression equation of A=55.55c（mg/mL）+0.001（r=0.999 8）was achieved when the concentration of glucose ranged between 0.000 and 0.020 mg/mL. The average recovery rate was 99.7%，and the relative standard deviation was 3.13%（n=6）. The best conditions of color are as follows，the dosage of phenol and sulphuric acid was 1.0 mL and 7.0 mL respectively，temperature of color was at 80℃，and developing time was 30 minutes. The optimal extraction of polysaccharide was performed by 2 hours soaking using 1 : 40 volumes of solvent at 70℃. Conclusion: The established method is simple and accurate and the optimal extraction technique shows good reproducibility.

〔Key words〕Orchidaceae plants；polysaccharide；extraction conditions；determination of content；phenol sulfuric acid method

［中圖分類號(hào)］R284.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號(hào)］2096-2266（2016）04-0026-03

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81160393）；大理大學(xué)大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（yh201404）

［收稿日期］2016-01-09［修回日期］2016-03-14

［作者簡介］趙會(huì)然，碩士研究生，主要從事天然藥物化學(xué)研究.

*通信作者：郭潔，教授.