聶元元　李霞　毛凌華　顏滿蓮　顏龍安　蔡耀輝*

（1江西省超級(jí)水稻研究發(fā)展中心/國(guó)家水稻工程實(shí)驗(yàn)室，南昌330200；2江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/國(guó)家水稻改良中心南昌分中心，南昌330200；*通訊作者）

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分子標(biāo)記輔助選擇改良三系雜交稻恢復(fù)系R225稻瘟病抗性

聶元元1李霞2毛凌華1顏滿蓮1顏龍安1蔡耀輝1*

（1江西省超級(jí)水稻研究發(fā)展中心/國(guó)家水稻工程實(shí)驗(yàn)室，南昌330200；2江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/國(guó)家水稻改良中心南昌分中心，南昌330200；*通訊作者）

摘要：稻瘟病是水稻的主要病害，培育抗稻瘟病品種是防治稻瘟病的有效途徑。本研究通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇與雜交育種相結(jié)合的方式，將稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2和Pi9導(dǎo)入到三系雜交稻恢復(fù)系R225。對(duì)BC3F3代材料進(jìn)行苗期和成熟期稻瘟病抗性鑒定，攜帶1個(gè)或2個(gè)抗性基因的目標(biāo)株系抗性達(dá)到中抗以上水平，稻瘟病抗性顯著高于各自的輪回親本。SSR標(biāo)記分析表明，改良株系的遺傳背景回復(fù)率達(dá)到86.1%～95.3%。通過(guò)標(biāo)記輔助選擇獲得的改良材料為三系雜交稻恢復(fù)系的培育提供了稻瘟病抗性親本。

關(guān)鍵詞：標(biāo)記輔助選擇；稻瘟??；三系雜交稻；恢復(fù)系

稻瘟病是由真菌Magnaporthe oryzae引起的水稻毀滅性病害，是水稻生產(chǎn)的主要病害，選育和應(yīng)用抗病品種是防治稻瘟病、減少其危害的有效途徑［1］，同時(shí)也是保護(hù)環(huán)境、發(fā)展綠色水稻產(chǎn)業(yè)、實(shí)現(xiàn)水稻可持續(xù)性發(fā)展和確保糧食安全的迫切需要。然而，由于稻瘟菌小種的高度變異性，大面積推廣的水稻品種含有的抗性基因往往在3～5年之后就失去抗性，導(dǎo)入廣譜抗性基因和選育抗瘟性強(qiáng)的水稻品種是目前最常用的預(yù)防稻瘟病的方法［2］。

目前已標(biāo)記定位的稻瘟病抗性基因達(dá)80多個(gè)，不同稻區(qū)稻瘟病的生理小種差異很大，因此，利用什么樣的抗病基因進(jìn)行品種改良，也會(huì)因稻區(qū)的不同而不同。此外，用于雜交稻育種的基因必須具有較強(qiáng)的顯性作用。在本研究中選用的Pi1對(duì)我國(guó)792個(gè)稻瘟病小種的絕大部分表現(xiàn)抗性，其抗性頻率達(dá)89.65%，是一個(gè)廣譜的稻瘟病抗性基因［3］，利用RM224和MRG4766對(duì)Pi1選擇的準(zhǔn)確率達(dá)100%［4］。Pi2也是一個(gè)廣譜抗性基因，對(duì)455個(gè)菲律賓小種及來(lái)自16個(gè)國(guó)家和地區(qū)的43個(gè)小種中的36個(gè)小種表現(xiàn)抗性，Zhou等［5］已克隆該基因。而Pi9基因來(lái)自小粒野生稻Oryza minuta，對(duì)所有供試菲律賓小種，來(lái)自16個(gè)國(guó)家和地區(qū)的43個(gè)小種表現(xiàn)抗性［6］，Qu等［7］已成功克隆了該基因。Pi2與Pi9是位于第6染色體著絲粒附近位置非常接近的抗病基因。

受體輪回親本R225是江西省超級(jí)水稻研究發(fā)展中心選育的優(yōu)良恢復(fù)系，株型適中，分蘗力強(qiáng)，穗大粒多，結(jié)實(shí)率高，后期落色好。所配組合榮優(yōu)225于2009年通過(guò)江西省審定，并被列為江西省晚秈主栽品種之一，2012年通過(guò)國(guó)家審定，2014年通過(guò)農(nóng)業(yè)部超級(jí)稻認(rèn)定，同時(shí)被列為農(nóng)業(yè)部主導(dǎo)品種。榮優(yōu)225已申請(qǐng)植物新品種保護(hù)，具有較好的應(yīng)用前景［8］。本研究通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇和回交育種的策略，利用攜帶稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2基因的材料BL6與含Pi9基因的親本材料75-1-127分別與R225雜交，將Pi1、Pi2和Pi9基因聚合到優(yōu)良恢復(fù)系R225中，以選育稻瘟病抗性增強(qiáng)的優(yōu)良株系。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以含有抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的材料BL6和含有抗稻瘟病基因Pi9的材料75-1-127作為本試驗(yàn)的供體，以恢復(fù)系R225為受體，通過(guò)雜交、回交和分子標(biāo)記輔助選擇，建立回交BC1F1分離群體，同時(shí)分子標(biāo)記檢測(cè)，選擇陽(yáng)性植株與輪回親本R225回交，在回交后自交兩代獲得BC3F3，獲得含目標(biāo)抗性基因的單株，每個(gè)世代均用分子標(biāo)記進(jìn)行目標(biāo)基因選擇（圖1）。

1.2稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性鑒定采用大棚人工接種鑒定和井岡山稻瘟病自然鑒定。井岡山鑒定點(diǎn)是國(guó)家和省級(jí)區(qū)試水稻稻瘟病抗性鑒定點(diǎn)，溪溝縱橫，四面環(huán)山，屬典型的山陰梯田，日照時(shí)間短，霧露時(shí)間長(zhǎng)，高溫高濕，極有利于稻瘟病的發(fā)生。

1.3抗性基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

采集水稻幼嫩葉片用CTAB法快速提取DNA［9］，引物由上海生工合成。選擇親本間擴(kuò)增片段差異較大引物，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)。

圖1　分子標(biāo)記輔助選擇聚合稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2和Pi9

圖2　Pi1、Pi2和Pi9基因選擇標(biāo)記RM144、AP22和PB8的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

2　結(jié)果與分析

2.1目標(biāo)基因選擇的分子標(biāo)記

分別合成RM144、RM224、MRG4766等3對(duì)與Pi1基因緊密連鎖標(biāo)記的引物［10］，AP22、SRM24、Nbs2P3、RM527等4對(duì)與Pi2基因緊密連鎖及基因內(nèi)標(biāo)記的引物［11］，PB8和Nbs-Pi9等2對(duì)與Pi9基因緊密連鎖或基因內(nèi)標(biāo)記的引物［12］。通過(guò)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳分子標(biāo)記檢測(cè)，篩選本實(shí)驗(yàn)中所涉及輪回親本R225和相應(yīng)供體親本BL6、75-1-127間的多態(tài)性。根據(jù)篩選多態(tài)性結(jié)果，選擇瓊脂糖凝膠電泳可以檢測(cè)供體-受體間差異的標(biāo)記，分別為RM144對(duì)Pi1基因，AP22對(duì)Pi2基因，PB8對(duì)Pi9基因進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇（圖2）。

2.2 BC3F3改良材料的稻瘟病抗性表型鑒定

分子標(biāo)記輔助選擇獲得聚合Pi1、Pi2及Pi9基因改良株系116株，聚合Pi1、Pi2基因改良株系327株。對(duì)受體、供體親本及改良株系在井岡山鑒定點(diǎn)進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定。苗期調(diào)查分級(jí)參照Tharreu D的6級(jí)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)將病斑分為6級(jí)，1～3級(jí)為抗病表型，4～6級(jí)為感病表型［13］。調(diào)查結(jié)果表明，輪回親本R225自然狀態(tài)下表現(xiàn)感病，抗病級(jí)別為5級(jí)；供體親本BL6自然狀態(tài)下表現(xiàn)抗病，抗病級(jí)別為1級(jí)，供體親本75-1-127自然狀態(tài)下表現(xiàn)抗病，抗病級(jí)別為1級(jí)；改良群體自然狀態(tài)下抗病級(jí)別為2～4級(jí)，其中聚合了Pi1、Pi2及Pi9基因的改良株系抗病效果得到明顯提高，抗病級(jí)別為1級(jí)，聚合了Pi1、Pi2基因的改良株系抗病效果也很明顯，抗病級(jí)別為1～2級(jí)。

成熟后期重點(diǎn)調(diào)查穗頸瘟。輪回親本R225自然狀態(tài)下表現(xiàn)感病，抗病級(jí)別為6級(jí)，穗頸瘟嚴(yán)重；供體親本BL6自然狀態(tài)下表現(xiàn)抗病，抗病級(jí)別為1級(jí)；供體親本75-1-127自然狀態(tài)下表現(xiàn)抗病，抗病級(jí)別為1級(jí)；改良群體自然狀態(tài)下抗病級(jí)別為3～4級(jí)，其中116株聚合了Pi1、Pi2及Pi9基因的改良株系中表現(xiàn)高抗的有21株，抗病級(jí)別為1級(jí)，其余95株表現(xiàn)抗病，但是也有少量單株出現(xiàn)穗頸瘟，抗病級(jí)別為2～3級(jí)；聚合了Pi1、Pi2基因的327株改良株系抗病級(jí)別為1～2級(jí)，其中96株表現(xiàn)高抗，抗病級(jí)別為1級(jí)。

對(duì)16份攜帶Pi1、Pi2及Pi9基因的BC3F3代改良材料進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定，調(diào)查材料包含R225/BL6、R225/75-1-127、R225/BL6//75-1-127等，每份材料調(diào)查30株。調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，R225表現(xiàn)為中感，抗病級(jí)別為4級(jí)；BL6表現(xiàn)為高抗，抗病級(jí)別為1級(jí)；75-1-127表現(xiàn)為高抗，抗病級(jí)別為1級(jí)；攜帶有抗性基因的改良株系則表現(xiàn)為抗及中抗水平，不含抗性基因的材料對(duì)稻瘟病表現(xiàn)為感病或中感（表1）。

2.3改良株系遺傳背景的SSR標(biāo)記檢測(cè)

選取BC3F3代材料10個(gè)株系進(jìn)行SSR背景分析，在R225與75-1-127中篩選到101對(duì)SSR多態(tài)性標(biāo)記，在R225與BL6間篩選到114對(duì)SSR多態(tài)性標(biāo)記，這些引物在水稻12對(duì)染色體上近似平均分布，檢測(cè)的單株標(biāo)記基因型中輪回親本基因型的比率在86.1%～95.3%之間，改良株系遺傳背景近似輪回親本。

對(duì)獲得的BC3F3代材料進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀調(diào)查，改良株系與相應(yīng)輪回親本R225表型較為相似，改良材料在株型、株高、穗型和后期落色等性狀上與輪回親本表現(xiàn)基本一致。而部分性狀上有意識(shí)的傾向于選擇供體親本的性狀，以彌補(bǔ)輪回親本的一些缺點(diǎn)，例如，BL6來(lái)源的改良材料傾向于短圓粒，且谷殼顏色金黃的材料，而75-1-127來(lái)源的改良材料則分蘗力變強(qiáng)，生育期推遲3～5 d。

表1　改良后代株系及親本稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

3　討論

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的稻瘟病抗性位點(diǎn)與抗性基因［14］。目前已標(biāo)記定位的稻瘟病抗性基因達(dá)68個(gè)，其中23個(gè)被成功克隆，但不同稻區(qū)稻瘟病的生理小種差異很大，因此，利用什么樣的抗病基因進(jìn)行品種改良，也會(huì)因稻區(qū)的不同而不同。此外，用于雜交稻育種的基因必須具有較強(qiáng)的顯性作用［15］。本研究選用具有廣譜抗性的稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2 和Pi9作為目的基因，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)進(jìn)行水稻抗稻瘟病基因聚合育種，利用與抗性基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記同時(shí)鑒定多個(gè)抗性基因的存在與否，同時(shí)結(jié)合田間表型鑒定稻瘟病抗性。

育種實(shí)踐證明，要育成具有廣譜抗性的雜交稻新組合，其雙親之一應(yīng)具有廣譜抗性［16-17］。如福建省農(nóng)科院水稻所育成稻瘟病抗性不育系地谷A、福伊A，以及利用其配組選育而成抗稻瘟病的雜交稻組合地優(yōu)77、福優(yōu)964、福優(yōu)明86等，在武陵山區(qū)等稻瘟病重發(fā)區(qū)種植，表現(xiàn)出較強(qiáng)的稻瘟病抗性水平［18］。本研究通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇聚合具有廣譜抗性的3個(gè)稻瘟病抗性基因，改良恢復(fù)系R225稻瘟病抗性，從而達(dá)到改良其雜交稻組合稻瘟病抗性的目的。

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Improving Blast Resistance of Parental Restorer Lines R225 by Marker-assisted Selection

NIE Yuanyuan1，LI Xia2，MAO Linghua1，YAN Manlian1，YAN Longan1，CAI Yaohui1*
（1Jiangxi Super-rice Research and Development Center/National Engineering Laboratory for Rice，Nanchang 330200，China；2Rice Research Institute，Jiangxi Academy of Agricultural Sciences/Nanchang Branch of Chinese National Center for Rice Improvement，Nanchang 330200，China；*Corresponding author）

Abstract:Rice blast is one of the most devastating diseases in rice. Cultivating rice blast resistant varieties is an effective way to control rice blast. Using marker assisted selection and backcrossing，blast resistance genes Pi1，Pi2 and Pi9 were introgressed into restorer parental lines R225. The BC3F3progenies harboring Pi1，Pi2 or Pi9 were selected by linked markers. The lines carrying one or two target genes are significantly higher than their respective recurrent parent. Background SSR analysis showed that the recovery rate of the target lines reached 86.1%～95.3%. The improved lines can be used as candidate parental lines for rice breeding with blast resistance.

Key words:marker-assisted selection（MAS）；rice blast；three line hybrid rice；restorer line

中圖分類號(hào)：S511.03

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1006-8082（2016）03-0060-04

收稿日期：2015-12-11

基金項(xiàng)目：“863”計(jì)劃“綠色性狀基因聚合與種質(zhì)創(chuàng)新”（2014AA10A603）；江西省農(nóng)科院青年基金（2014CQN 001）