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        [Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O抑制人宮頸癌Hela細胞增殖的研究

        2016-06-30 03:37:03曲小姝劉樹萍楊艷艷
        東北師大學報(自然科學版) 2016年2期
        關鍵詞:顯微鏡吉林宮頸癌

        曲小姝,劉樹萍,寧 波,楊艷艷

        (1.吉林化工學院化學與制藥工程學院,吉林 吉林 132022;2.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江 哈爾濱 150076;3.長春職業(yè)技術學院食品與生物技術學院,吉林 長春 130021)

        [Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O抑制人宮頸癌Hela細胞增殖的研究

        曲小姝1,劉樹萍2,寧波3,楊艷艷1

        (1.吉林化工學院化學與制藥工程學院,吉林 吉林 132022;2.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江 哈爾濱 150076;3.長春職業(yè)技術學院食品與生物技術學院,吉林 長春 130021)

        [摘要]研究了過渡金屬銅修飾的仲鎢酸鹽化合物[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O(Na2Cu4W12)的體外抗腫瘤活性.取人宮頸癌細胞Hela加入不同濃度Na2Cu4W12處理,應用MTT法分析細胞增殖,計算了半數(shù)抑制濃度(IC50);采用光學顯微鏡觀察Hela細胞的凋亡形態(tài)變化;用流式細胞術分析細胞周期和細胞凋亡,計算了各期細胞比例及細胞凋亡率.結果表明:Na2Cu4W12對Hela細胞增殖抑制的IC50值為10.2 μmol/L,且呈劑量依賴性;光學顯微鏡下可觀察到Na2Cu4W12處理組細胞數(shù)目明顯減少,出現(xiàn)變圓、縮小、老化等形態(tài)變化;不同濃度Na2Cu4W12處理12 h后,早期凋亡細胞所占的百分比顯著增加且呈劑量依賴性.

        [關鍵詞][Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O;人宮頸癌細胞Hela;抗腫瘤;體外研究

        0引言

        惡性腫瘤是當今世界危害人類生命健康的一種重大疾病,其發(fā)病率逐年增長,目前臨床使用的多數(shù)抗腫瘤化學藥物有效率低、選擇性差、毒副反應大及腫瘤細胞耐藥等缺點.世界科研機構和制藥公司紛紛投入大量的人力、物力進行抗癌新藥研發(fā),因此,研究開發(fā)高效、低毒,具有我國自主知識產權的抗腫瘤藥物乃當務之急[1-2].多金屬氧酸鹽(Polyoxometalates,POMs)又稱多酸,包括雜多酸和同多酸,是由d0組態(tài)的過渡金屬離子與氧高度聚合形成的具有空間網(wǎng)絡結構的金屬-氧簇合物[3],其抗腫瘤作用研究已有30多年的歷史,具有抗腫瘤作用廣、對腫瘤細胞均有一定抑制作用的優(yōu)點,某些種類的多酸在抑瘤效果上較之現(xiàn)在市售的商品藥物更令人滿意[4-9].近些年的研究報道表明,盡管POMs類化合物具有一定的抗腫瘤活性,但在溶解性、藥物活性和細胞內靶點特異性方面還不盡如人意,通過POMs結構的改進和配位集團修飾,可以合成不同結構和特性的新分子,能為進一步篩選高效抗腫瘤新藥提供備選分子.[10-16]

        仲鎢酸鹽-B是一種經(jīng)典的同多酸,多陰離子結構式為[H2W12O42]10-,它具有優(yōu)異的抗艾滋病毒活性[9].但是目前沒有關于仲鎢酸鹽-B類結構多酸化合物抗腫瘤作用的研究報道.本文使用自主研發(fā)的一種過渡金屬銅修飾的仲鎢酸鹽化合物[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O(簡稱Na2Cu4W12)[17],選擇人宮頸癌Hela細胞對其體外抗腫瘤活性進行了研究.

        1實驗部分

        1.1儀器和試劑

        儀器:蘇州蘇靜集團FLB-lB型超凈工作室;美國SHELL/JB型CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱;日本Olympus倒置相差顯微鏡;日本KA-1000型低速離心機;BIORAD公司680型酶標儀;美國BD公司BD FAC ScantoTM流式細胞儀.

        試劑:3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)及DMSO購自美國sigma公司;胎牛血清(Fetalbovineserum)、RPMI 1640(pH7.0~7.2)、胰蛋白酶(tyrsin)均購自Gibco公司;雙抗(青霉素鈉、硫酸鏈霉素)購自西安制藥公司;Hoechst33258試劑盒、碘化丙啶(Propidium Iodine,PI)均購自南京凱基生物工程研究所;[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O為自制單晶,結構經(jīng)過X射線單晶衍射、紅外光譜、元素分析表征[17],精密稱取溶于DMSO中,再用培養(yǎng)液稀釋成終濃度為100 mmol·L-1的母液,4℃保存?zhèn)溆?;Hela細胞株來自吉林醫(yī)藥學院科學實驗室.

        1.2MTT法測腫瘤細胞活力

        把對數(shù)生長期的Hela細胞調成密度為1×105個/mL,在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μL密度為1×105個/mL的Hela細胞懸液,在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),24 h后把Hela細胞分為兩大組.將細胞分成空白對照組及實驗組(濃度為0.1,1,10,20,50及100 μmol/L的藥物溶液共6組),用DMEM培養(yǎng)基稀釋液分別培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)結束每孔加入新鮮配制的MTT溶液20 μL,溫育4 h使MTT還原為甲瓚,當在倒置顯微鏡下看到孔板內的細胞周圍出現(xiàn)絲狀紫色結晶體時倒掉上清液,每孔加DMSO 150 μL 震蕩溶解細胞,用平板搖床搖勻后,使用酶標儀測定其光密度值(OD)(檢測波長為570 nm).計算增殖抑制率的公式:增殖抑制率=(1-藥物試驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%.重復試驗3次,取平均值.

        1.3細胞凋亡的形態(tài)學觀察

        取對數(shù)生長期的Hela細胞,培養(yǎng)24 h后,去上清液,將細胞分成空白對照組和實驗組(濃度為0.1,1,10,20,50及100 μmol/L的藥物溶液200 μL),用DMEM培養(yǎng)基稀釋液培養(yǎng)24 h后,于倒置顯微鏡下觀察不同濃度對腫瘤細胞的影響,從生長抑制、細胞形態(tài)進行評估.

        1.4Annex in V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率

        取對數(shù)生長期Hela細胞5×105個接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中,待細胞貼壁后,更換培養(yǎng)液,加入總濃度為0,0.1,1,10,20,50及100 μmol/L的藥物溶液10 mL,其中0為陰性對照,12 h后收集對照組和實驗組細胞,PBS洗滌2次,在溫度為4℃時用70%乙醇固定30 min,用Annex in V-FITC/PI雙標記染色后上機檢測細胞凋亡率.

        2結果與討論

        2.1MTT比色實驗

        由于活細胞的線粒體具有還原MTT形成紫色化合物的能力,該化合物在570 nm波長下有強吸收.細胞死亡或增殖功能下降時,還原MTT的能力下降,570 nm波長下吸光度值會降低(見表1).由表1可見,與對照組比較,不同濃度的Na2Cu4W12處理Hela細胞24 h后,可使Hela細胞的OD值明顯減小,表明Na2Cu4W12對Hela細胞具有抑制作用,且隨著濃度的增加細胞的存活率下降,具有藥物劑量依賴性,IC50為10.2 μmol/L.

        圖1 表1 不同濃度Na2CuW12處理Hela細胞24 h后OD值抑制率和IC50

        注:OD值為光密度值.

        2.2不同濃度Na2Cu4W12對腫瘤細胞形態(tài)學的影響

        分別用0.1,1,10,20,50,100 μmol/L濃度的Na2Cu4W12處理腫瘤24 h后,結果顯示:實驗組的腫瘤細胞緊貼瓶底,細胞密集,細胞間連接緊密,呈有規(guī)則的多邊形,細胞觸角較短,圓形細胞少;Na2Cu4W12處理后,細胞較為稀疏,附壁疏松,脫壁,細胞變圓.圖1為濃度50 μmol/L的Na2Cu4W12對腫瘤細胞形態(tài)學的影響.

        a:空白對照組;b:50 μmol/L Na2Cu4W12處理的Hela

        2.3不同濃度的Na2Cu4W12對Hela細胞早期凋亡率的影響

        正常生長的Hela細胞早期凋亡率為3.07%.經(jīng)不同濃度Na2Cu4W12處理12 h后,Hela細胞早期凋亡率顯著增加,0.1,1,10, 20,50和100 μmol/L Na2Cu4W12組分別為4.15%,10.67%,13.51%,23.29%,34.86%和44.4% (見圖2).早期凋亡細胞所占的百分比由3.07%增加到44.4%;表明Na2Cu4W12誘導Hela細胞的死亡性質為凋亡,且其作用具有明顯劑量依賴性.

        a為對照組;b為0.1 μmol/L;c為1 μmol/L;d為10 μmol/L;e為20 μmol/L;f為 50 μmol/L;g為100 μmol/L

        象限 1為死亡細胞(UL左上);象限2為晚期凋亡(UR右上);象限3為正常細胞(LL左下 );象限4為早期凋亡(LR 右下)

        圖2不同濃度Na2Cu4W12作用12 h后Annex in V-FITC/ PI 雙染法檢測Hela細胞凋亡率

        3結論

        本文探討了過渡金屬銅修飾的仲鎢酸鹽化合物Na2Cu4W12對人宮頸癌Hela細胞生長及凋亡的影響.MTT細胞活性檢測、光學顯微鏡細胞凋亡形態(tài)觀察以及細胞流式儀檢測表明:Na2Cu4W12對Hela細胞有較明顯的抑制作用,IC50為10.2 μmol/L;光學顯微鏡下處理組細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、縮小等形態(tài)變化;不同濃度Na2Cu4W12處理12 h后早期凋亡細胞所占的百分比顯著增加且呈劑量依賴性.通過誘導腫瘤細胞調亡進行腫瘤治療是抗癌治療的新觀點,比殺傷腫瘤細胞的治療有明顯的優(yōu)越性,故尋找能有效誘導腫瘤細胞凋亡的藥物是目前的研究熱點.本文首次發(fā)現(xiàn)仲鎢酸鹽化合物Na2Cu4W12具有抑制宮頸癌細胞株Hela細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用,其抗腫瘤活性有進一步研究價值.

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        Inhibitory effect of [Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O

        (責任編輯:石紹慶)

        on the growth of human cervical carcinoma Hela cells

        QU Xiao-shu1,LIU Shu-ping2,NING Bo3,YANG Yan-yan1

        (1.Chemical and Pharmaceutical Engineering Institute,Jilin Institute of Chemical Technology,Jilin 132022,China;2.College of Tourism and Cuisine,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China;3.School of Food Production and Biotechnology,Changchun Vocational Institute of Technology,Changchun 130021,China)

        Abstract:The in vitro anti-tumor activity of a novel paradodecatungstate-B compound decorated by transition metal copper:[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O (abbreviated form:Na2Cu4W12)has been studied.Hela cells were treated with different concentration of Na2Cu4W12,then its IC50was measured by MTT assay;The morphological change in Hela cells were observed by optical microscopes;Flow cytometry was applied to analyze cell cycle and apoptosis by computing the ratio of Hela cells in different phase and its apoptotic ratio.The results show that Na2Cu4W12can inhibit Hela cell proliferation with IC50of 10.2 μmol/L,showing dose-dependent.Under the optical microscopes,The number of Hela cells treated with Na2Cu4W12decreased significantly,cell rounding,shrinking and aging were observed.Treated with different concentrations of Na2Cu4W12after 12 h,the proportions of Hela cells on the early apoptosis increased markedly,showing dose-dependent.

        Keywords:[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O;human cervical carcinoma Hela cell;anti-tumor;in vitro study

        [文章編號]1000-1832(2016)02-0103-05

        [收稿日期]2015-01-10

        [基金項目]國家自然科學基金資助項目(21301041).

        [作者簡介]曲小姝(1974—),女,博士,副教授,主要從事多酸化學和配位化學研究.

        [中圖分類號]O 611[學科代碼]150·15

        [文獻標志碼]A

        [DOI]10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.02.022

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