劉振華，李步瀠，段維勛，金振曉，俞世強(qiáng)

?

褪黑素抑制磷酸鈣誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡

劉振華，李步瀠，段維勛，金振曉，俞世強(qiáng)

［摘要］：目的 觀察褪黑素（Mel）對(duì)磷酸鈣誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（SMCs）凋亡的影響。方法 組織貼塊法原代培養(yǎng)的血管SMCs隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（PBS）、磷酸鈣（CaPO4）組、磷酸鈣+褪黑素（CaPO4+Mel）組，Mel又按濃度分為0.1 mmol/ L，0.5 mmol/ L，1 mmol/ L，2 mmol/ L四組。CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖變化，TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot印跡法測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bcl-2、Bax表達(dá)。結(jié)果 CCK8法檢測(cè)顯示褪黑素可以抑制CaPO4誘導(dǎo)的SMCs凋亡，促進(jìn)其增殖，并具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。以1 mmol/ L作用6 h顯著。褪黑素作用6 h后，TUNEL檢測(cè)顯示CaPO4誘導(dǎo)的SMCs凋亡明顯減少（P＜0.01），Western blot結(jié)果分析顯示，與CaPO4組比較，caspase3表達(dá)明顯下降，同時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論 褪黑素可以抑制CaPO4誘導(dǎo)的SMCs凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)caspase3和Bax蛋白，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］：褪黑素；平滑肌細(xì)胞；CaPO4誘導(dǎo)；細(xì)胞凋亡

作者單位：710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心臟外科

主動(dòng)脈瘤是一種病情相當(dāng)兇險(xiǎn)、死亡率較高的大血管疾?。?］，近年來(lái)，隨著檢查手段和診療水平的提高，檢出率逐年上升。但是，其發(fā)病機(jī)制還不是很清楚，基本病理生理是：中膜彈性蛋白退化、崩解，膠原溶解和主動(dòng)脈壁中膜大量平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cells，SMCs）凋亡。許多學(xué)者［2］為了研究主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制和治療方法，以氯化鈣（CaCl2）誘導(dǎo)嚙齒動(dòng)物腹主動(dòng)脈瘤模型，達(dá)到與人主動(dòng)脈瘤類(lèi)似的病理改變：主動(dòng)脈鈣化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、新生血管形成、彈性蛋白降解和血管SMCs凋亡等。Yamanouchi D等［3］比較CaCl2和磷酸鈣（CaPO4）誘導(dǎo)的SMCs模型，發(fā)現(xiàn)CaPO4誘導(dǎo)的SMCs模型更符合主動(dòng)脈瘤發(fā)生時(shí)中膜SMCs的凋亡變化。褪黑素（melatonin，Mel）是松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，化學(xué)名稱(chēng)為5-甲氧基-N-乙酰色胺，具有廣泛的生物學(xué)活性，其中，它的抗炎、抗氧化、降血壓、抑制血小板凝集和血中膽固醇合成等活性與心血管疾病密切相關(guān)［4］，Mel的上述生物學(xué)活性可能對(duì)主動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。本文采用Ca?PO4誘導(dǎo)的SMCs凋亡模型，探討Mel對(duì)主動(dòng)脈瘤SMCs凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，180～200 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供，DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清（Gibco公司），Mel（Sigma公司），稱(chēng)取Mel 0.0232 g，用1 ml無(wú)水乙醇完全溶解，再用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，即配成0.1 mol/ L Mel母液。CaCl2（Sigma公司），CCK8檢測(cè)試劑盒（同仁化學(xué)研究所，日本），原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)試劑盒（Roche公司），二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)），倒置相差顯微鏡（Nikon，日本），流式細(xì)胞儀（BD公司），RIPA裂解液（碧云天，上海）SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天，北京），An?nexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（sigma公司），兔抗大鼠caspase3、兔抗大鼠Bcl-2、兔抗大鼠Bax抗體（abcam公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠胸主動(dòng)脈SMCs原代培養(yǎng) SD大鼠脫頸處死后浸泡在75%酒精中5 min，在超凈工作臺(tái)上迅速分離胸主動(dòng)脈，在含DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中仔細(xì)剝除血管外組織和外膜，更換眼科剪縱行剪開(kāi)，用無(wú)菌棉簽輕刮3～5遍，去除內(nèi)膜，將血管中膜剪成1 mm×1 mm大小，再用吸管從培養(yǎng)皿中吸出小組織塊貼于培養(yǎng)瓶底，加入適量（3～5滴）含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中孵育5 h，使組織塊干涸并與瓶底黏附，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，3 d換1次培養(yǎng)液，約1 w有細(xì)胞從組織塊周邊爬出。待細(xì)胞融合以后消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2CaPO4損傷大鼠胸主動(dòng)脈SMCs模型建立和流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取上述原代培養(yǎng)的第5代SMCs，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)24 h，SMCs隨機(jī)分為兩組：①對(duì)照組（PBS）：n= 6，細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗2遍，再加入適量PBS培養(yǎng)在37℃，5%CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中15 min，吸棄PBS，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h；②CaPO4組：n= 6，細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗2遍，加入用PBS稀釋的CaCl2（稱(chēng)取55.49 mg CaCl2溶于100 ml PBS充分溶解后，用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，即配成0.5 mol/ L CaPO4母液。再用無(wú)菌PBS稀釋10倍，終濃度0.05 mol/ L）在37℃，5%CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，吸棄含CaCl2的PBS，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基洗2遍，加入適量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，模型建立。之后用PBS洗滌2遍，0.25%胰酶消化后，收集各組細(xì)胞，加100 μl結(jié)合緩沖液（binding buffer）和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白（An?nexin-V 20 mg/ L）10 μl，室溫避光30 min，再加20 mg/ L PI 10 μl，避光反應(yīng)5 min后，加入400 μl結(jié)合緩沖液，立即上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3不同濃度Mel對(duì)CaPO4損傷大鼠胸主動(dòng)脈SMCs模型增殖能力的影響 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMCs，以4×104/孔接種于96孔板，每孔加入100 μl培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%融合后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分三組，分別為①對(duì)照組（PBS）：n=6。方法同1.2.2中的對(duì)照組，在培養(yǎng)6 h后再分別培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、8 h；②CaPO4組：n = 6。方法與1.2.2中的CaPO4組相同，在培養(yǎng)6 h后再分別培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、8 h；③CaPO4+Mel組：在1.2.2中的CaPO4組模型的基礎(chǔ)上，再加入不同濃度的Mel（濃度分別為0.1 mmol/ L，0.5 mmol/ L，1 mmol/ L，2 mmol/ L，各組分別在37℃，5%CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、8 h。上述所有細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，每孔加入CCK8溶液（與DMEM 1∶10稀釋?zhuān)?00 μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，450 nm測(cè)定吸光度，以增殖率和藥物濃度為縱橫坐標(biāo)繪制曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Mel對(duì)CaPO4損傷大鼠胸主動(dòng)脈SMCs凋亡的影響 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMCs，以1×105/孔接種于24孔板，行細(xì)胞爬片，實(shí)驗(yàn)分三組，分別為①對(duì)照組（PBS）：n= 6。方法同1.2.2對(duì)照組模型建立，僅為培養(yǎng)12 h；②CaPO4組：n = 6。方法同CaPO4組的模型建立，培養(yǎng)時(shí)間為12 h；③CaPO4+Mel組：n= 6。按CaPO4組模型建立后，再加入Mel（濃度為1 mmol/ L）繼續(xù)培養(yǎng)6 h。按TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色TUNEL染凋亡細(xì)胞核（綠色熒光），DAPI染整個(gè)細(xì)胞核（藍(lán)色熒光）。每張爬片在凋亡區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞核數(shù)，計(jì)算SMCs凋亡率。

1.2.5Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bcl -2和Bax表達(dá) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMCs，以6× 105/孔接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分組與各組細(xì)胞處理方法與1.2.4部分相同，處理完畢后收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的RIPA裂解液，于冰上充分溶解，提取細(xì)胞蛋白，加入樣本緩沖液后在沸水中煮7 min，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯膜上，在5%的脫脂牛奶（1×TBST配置）中封閉2 h。分別使用加入1∶500兔抗caspase3抗體、1∶500兔抗Bcl-2抗體、1∶500兔抗Bax抗體和鼠抗GAPDH抗體，4℃孵育過(guò)夜后，TBST洗3遍，每遍10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫下結(jié)合2 h；TBST洗3遍，每遍10 min，標(biāo)準(zhǔn)ECL法底物發(fā)光并顯影，檢測(cè)caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。

2　結(jié)果

2.1CaPO4可以誘導(dǎo)主動(dòng)脈血管SMCs凋亡 原代培養(yǎng)的主動(dòng)脈血管SMCs經(jīng)過(guò)CaPO4處理15 min，再培養(yǎng)6 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SMCs凋亡，結(jié)果（如圖1），右上象限為早期凋亡，右下象限為晚期凋亡。對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率為（0.3±0.5）%，晚期凋亡率為（1.4±2.1）%，CaPO4處理組細(xì)胞早期凋亡率為（17.8±1.6）%，晚期凋亡率為（9.7±2.4）%，兩者之間細(xì)胞總凋亡率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

2.2Mel可以抑制CaPO4誘導(dǎo)的主動(dòng)脈血管SMCs凋亡 按照實(shí)驗(yàn)分組，不同濃度的Mel分別作用于CaPO4誘導(dǎo)的SMCs凋亡模型后2 h、4 h、6 h、8 h，CCK8結(jié)果顯示（如圖2），Mel對(duì)CaPO4誘導(dǎo)的主動(dòng)脈血管SMCs凋亡具有抑制作用，但是具有時(shí)間和劑量的依賴(lài)性，以1 mmol/ L作用6 h效果最為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。后面的實(shí)驗(yàn)研究采用1 mmol/ L的Mel進(jìn)行。

圖1　CaPO4誘導(dǎo)SMCs凋亡

圖2　不同濃度Mel對(duì)CaPO4誘導(dǎo)的SMCs增殖的影響

2.3Mel對(duì)SMCs凋亡率的影響 細(xì)胞爬片后，按實(shí)驗(yàn)分組，CaPO4+Mel素組（Mel以1 mmol/ L濃度作用6 h），TUNEL檢測(cè)各組SMCs凋亡率顯示（如圖3），與對(duì)照組比較，CaPO4組SMCs凋亡率明顯增加（P＜0.01），與CaPO4組比較，CaPO4+ Mel組SMCs凋亡率明顯減少（P＜0.01）。

2.4Mel對(duì)SMCs上凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bcl-2 和Bax表達(dá)的影響 按實(shí)驗(yàn)分組，CaPO4+Mel組（Mel以1 mmol/ L濃度作用6 h），提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測(cè)顯示（如圖4），與對(duì)照組比較，Ca?PO4組SMCs上凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bax表達(dá)明顯增加，Bcl-2表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；與CaPO4組比較，CaPO4+ Mel組SMCs凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bax表達(dá)明顯減少，Bcl-2表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。

圖3　各組SMCs凋亡率的比較

3　討論

主動(dòng)脈瘤中膜SMCs凋亡是主動(dòng)脈瘤發(fā)生的一個(gè)重要病理生理基礎(chǔ)，對(duì)于研究主動(dòng)脈瘤的發(fā)生具有重要意義。許多學(xué)者為了研究主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制和治療方法，采用CaCl2誘導(dǎo)嚙齒動(dòng)物腹主動(dòng)脈瘤模型，達(dá)到了與人主動(dòng)脈瘤類(lèi)似的病理改變。Ya?manouchi D等［3］報(bào)道，CaPO4誘導(dǎo)嚙齒動(dòng)物腹主動(dòng)脈瘤模型效果優(yōu)于CaCl2，誘導(dǎo)的主動(dòng)脈瘤直徑更大，彈力纖維斷裂更徹底，中膜SMCs凋亡更多，引起上述變化的主要原因可能是CaPO4晶體的形成。與Ewence AE等［5］報(bào)道的磷酸鈣晶體可以誘導(dǎo)人血管SMCs死亡結(jié)果相一致。本研究同樣采用CaCl2和PBS混合產(chǎn)生CaPO4晶體，達(dá)到了誘導(dǎo)SMCs凋亡的效果。

Mel是一種松果體分泌的吲哚類(lèi)神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在生物鐘、生殖、免疫、消化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗氧化以及抗腫瘤方面具有廣泛的生物學(xué)活性，在催眠、抗衰老、抗腫瘤和抗心血管疾病方面已經(jīng)應(yīng)用［6］，高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化是主動(dòng)脈瘤發(fā)生的兩個(gè)主要危險(xiǎn)因素，Mel在高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中具有重要的保護(hù)作用［7-10］，Shi DB等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Mel可以抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的SMCs的炎癥反應(yīng)。

圖4　Mel對(duì)各組SMCs凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bax和Bcl-2的影響

本研究通過(guò)觀察Mel對(duì)CaPO4誘導(dǎo)主動(dòng)脈血管SMCs的凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)Mel可以抑制SMCs的凋亡，且具有時(shí)間和劑量的依賴(lài)性。通過(guò)檢測(cè)SMCs上凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bcl-2和Bax表達(dá)，證實(shí)Mel作用后，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)caspase3、Bax表達(dá)，從而達(dá)到抑制SMCs凋亡的效果。本研究?jī)H僅是發(fā)現(xiàn)Mel可以抑制CaPO4誘導(dǎo)主動(dòng)脈血管SMCs的凋亡，其具體機(jī)制還需要深入研究。Mel是否對(duì)主動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展有影響，還需要進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物模型和臨床研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］景華.胸主動(dòng)脈瘤的外科治療進(jìn)展［J］.中國(guó)體外循環(huán)雜志，2006，4（4）：241-244.

［2］Wang Y，Krishna S，Golledge J.The calcium chloride-induced rodent model of abdominal aortic aneurysm［J］.Atherosclerosis，2013，226（1）：29-39.

［3］Yamanouchi D，Morgan S，Stair C，et al.Accelerated aneurys?mal dilation associated with apoptosis and inflammation in a newly developed calcium phosphate rodent abdominal aortic aneurysm model［J］.J Vasc Surg，2012，56（2）：455-461.

［4］Dominguez-Rodriguez A，Abreu-Gonzalez P，Sanchez-Sanchez JJ，et al.Melatonin and circadian biology in human cardiovascu?lar disease［J］.J Pineal Res，2010，49（1）：14-22.

［5］Ewence AE，Bootman M，Roderick HL，et al.Calcium phos?phate crystals induce cell death in human vascular smooth muscle cells：a potential mechanism in atherosclerotic plaque destabiliza?tion［J］.Circ Res，2008，103（5）：e28-34.

［6］肖建輝，劉作易，粱宗琦.褪黑激素的研究開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀［J］.生命的化學(xué)，2001，21（1）：69-70.

［7］Benova T，Viczenczova C，Radosinska J，et al.Melatonin attenu?ates hypertension-related proarrhythmic myocardial maladaptation of connexin-43 and propensity of the heart to lethal arrhythmias ［J］.Can J Physiol Pharmacol，2013，91（8）：633-639.

［8］Hung MW，Kravtsov GM，Lau CF，et al.Melatonin ameliorates endothelial dysfunction，vascular inflammation，and systemic hy?pertension in rats with chronic intermittent hypoxia［J］.J Pineal Res，2013，55（3）：247-256.

［9］Hu ZP，F(xiàn)ang XL，F(xiàn)ang N，et al.Melatonin ameliorates vascular endothelial dysfunction，inflammation，and atherosclerosis by suppressing the TLR4/ NF-kβsystem in highfat-fed rabbits［J］.J Pineal Res，2013，55（4）：388-398.

［10］Favero G，Rodella LF，Reiter RJ，et al.Melatonin and its ather?oprotective effects：a review［J］.Mol Cell Endocrinol，2014，382（2）：926-937.

［11］Shi D，Xiao X，Wang J，et al.Melatonin suppresses proinflam?matory mediators in lipopolysaccharide-stimulated CRL1999 cells via targeting MAPK，NF-kβ，c/ EBPβ，and p300 signaling［J］.J Pineal Res，2012，53（2）：154-165.

Melatonin inhibits apoptosis of rat aortic vascular smooth muscle cells induced by CaPO4

Liu Zhen-hua，Li Bu-ying，Yu Li-ming，Duan Wei-xun，Jin Zhen-xiao，Yu Shi-qiang
Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，the Fourth Military University，Shaanxi Xi＇an 710032，China Corresponding author：Yu Shi-qiang，Email：E-mail：shiqiangyu210＠126.com

［Abstract］：Objective To investigate the effect of melatonin（Mel）on apoptosis of rat aortic vascular smooth muscle cells in?duced by CaPO4.Methods VSMCs were primarily cultured by tissue-sticking method and randomly divided into 3 groups：control group，CaPO4group and CaPO4+Mel group.According to the concentration of Mel，the CaPO4+Mel groups were divided into 0.1 mmol/ L，0.5 mmol/ L，1 mmol/ L，2 mmol/ L four groups.SMCs proliferation was determined by CCK8.Cells apoptosis were detected by TUNEL.The expressions of caspase 3、Bcl-2 and Bax protein were investigated by Western blot.Results CCK8 method showed that Mel could inhibit SMCs apoptosis induced by CaPO4 and promoted SMCs proliferation，dependentof time and dose.Treatment with 1mmol/ L Mel for 6h had the most significant inhibitive effect.After SMCs were treated with 1mmol/ L Mel for 6h，TUNEL demonstrated that the apoptosis rate of the SMCs significantly decreased（P＜0.01）.Western blot demonstrated caspase3 expression significantly de?creased and Bcl-2 expression was up-regulated and Bax expression was down-regulated to compare to CaPO4group（P＜0.01）.Con?clusion Mel can inhibit SMCs apoptosis induced by CaPO4，Its mechanisms may be relate to down-regulated the caspase3 and Bax protein expression and up-regulated the Bcl-2 protein expression.

［Key words］：Mel；Smooth muscle cells；CaPO4induced；Cell apoptosis

DOI：10.13498/ j.cnki.chin.j.ecc.2016.02.13

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAI11B20）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81570231，81570230，81570232，81470415，81270170，81200151，81470411）；陜西省國(guó)際科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目（2015KW - 047）；陜西省社會(huì)發(fā)展公關(guān)計(jì)劃（2015SF104）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目（2013KTCL03-01）；陜西省自然科學(xué)基金（2014JM4106）；西京醫(yī)院學(xué)科助推計(jì)劃（XJZT14203，XJGX13LC15，XJGX12C11）

通訊作者：俞世強(qiáng)，E-mail：shiqiangyu210＠126.com

收稿日期：（2016?02?29）

修訂日期：（2016?03?10）