田黎　崔巍　孫紅

四君子湯含藥血清抑制甲狀腺癌側(cè)群細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

田黎崔巍孫紅

710000 西安，西安市北方醫(yī)院老年科(田黎)；710043 西安，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(崔巍)，腫瘤科(孫紅)

【摘要】目的評(píng)估四君子湯含藥血清對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞株(KMH-2和8305C)生長(zhǎng)的抑制作用。方法SD大鼠模型制備四君子湯含藥血清；MTT試驗(yàn)檢測(cè)四君子湯含藥血清對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞株KMH-2和8305C體外增殖的影響；Annexin V/PI雙染法檢測(cè)四君子湯含藥血清對(duì)KMH-2和8305C細(xì)胞凋亡的影響；流式細(xì)胞儀技術(shù)篩選和鑒定KMH-2和8305C的側(cè)群細(xì)胞；并采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cytochrome C和Caspase-3的表達(dá)水平變化。結(jié)果四君子湯含藥血清顯著抑制KMH-2和8305C細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；KMH-2和8305C細(xì)胞中存在一定比例側(cè)群細(xì)胞(1.45±0.01)%和(1.75±0.01)%，側(cè)群細(xì)胞中ALDH、CD44和ABCG2蛋白表達(dá)水平較高；四君子湯含藥血清可以上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2、促進(jìn)Cytochrome C釋放，激活Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。結(jié)論四君子湯含藥血清對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，而且這種抑制作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。

【關(guān)鍵詞】四君子湯含藥血清; 甲狀腺癌; 側(cè)群細(xì)胞; 細(xì)胞凋亡

目前一些中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥在治療腫瘤上取得令人矚目的療效，得到國(guó)際上的認(rèn)可和接受，如三氧化砷、靛玉紅、苦參堿等[1-3]。四君子湯作為補(bǔ)脾益氣的代表方劑臨床主要應(yīng)用于消化性胃潰瘍以及脾虛體弱等疾病的治療。近年一些研究發(fā)現(xiàn)四君子湯對(duì)于多種實(shí)體腫瘤具有一定的療效[4]。有研究表明四君子湯能夠有效抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901接種于裸鼠形成荷瘤的生長(zhǎng)[5]。另有研究顯示四君子湯還可以調(diào)控內(nèi)分泌系統(tǒng)，如機(jī)體內(nèi)血清T3、甲狀腺素(T4)、TSH、下丘腦促甲狀腺激素釋放激素(TRH)的分泌水平[5]。眾所周知，甲狀腺癌發(fā)病與TSH、TRH等激素分泌異常具有密切關(guān)系[6-7]。目前關(guān)于四君子湯在甲狀腺癌治療中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究檢測(cè)四君子湯含藥血清對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞株KMH-2和8305C生長(zhǎng)和凋亡的影響，希望為甲狀腺癌輔助治療提供一種新的治療策略。

材料與方法

一、藥物制備

四君子湯含藥血清采用SD大鼠模型提取，先將四君子湯熬制成湯劑，詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)[8]。24只SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，隨機(jī)分為4組：生理鹽水組和四君子湯低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各6只。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物按等體積藥物灌胃，生理鹽水組采用生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃3 d，末次灌胃后1 h，乙醚麻醉后無(wú)菌腹主動(dòng)脈采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。四君子湯用藥劑量按公式?jì)算：大鼠每日用藥量(g/kg) =人日用劑量×0.007/1.5，即為中劑量組；高劑量組為中劑量組的2倍；低劑量組為中劑量組的1/2。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

KMH-2和8305C細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞研究所。2種細(xì)胞均采用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2、95%濕度條件下的培養(yǎng)箱中。在細(xì)胞增殖至80%融合率時(shí)傳代。

三、MTT試驗(yàn)

取5×103對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板過(guò)夜，分別采用10%和20%四君子湯含藥血清(低、中、高劑量組)處理。72 h后加MTT溶液(5 g/L)20 μl繼續(xù)孵育4 h，每孔加DMSO 100 μl，避光振蕩10 min充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光值 (A值)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

四、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集經(jīng)10%和20%四君子湯含藥血清(高劑量組)處理48 h的至少1×106個(gè)細(xì)胞，分別進(jìn)行Annexin V-FITC和PI染色，在室溫靜置15 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

五、側(cè)群細(xì)胞分選和鑒定

將細(xì)胞分成對(duì)照組和維拉帕米組，收集1×106個(gè)細(xì)胞加入5 μg/ml Hoechst 33342，維拉帕米組同時(shí)加入100 μg/ml維拉帕米，避光37℃孵育70 min，離心后棄上清液用2%的胎牛血清的PBS重懸，再加入終濃度1 μg/ml的PI染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選，350 nm(375)波長(zhǎng)紫外光激發(fā)Hoechst染色，于450/20 nm帶通下收集測(cè)定藍(lán)光，675 nm帶通下收集測(cè)定紅光。通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ALDH、CD44和ABCG2蛋白表達(dá)水平以分子鑒定。

六、蛋白免疫印跡法

含藥血清處理48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用Bradford法定量，取25 μg蛋白樣本分別經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光、顯影、定影等過(guò)程對(duì)蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)。Cox IV和β-actin蛋白分別作為線粒體和胞漿蛋白內(nèi)參照。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、低、中、高劑量組含藥血清對(duì)KMH-2和8305C細(xì)胞增殖影響的比較

MTT結(jié)果顯示(圖1)，10%和20%(中、高劑量組)含藥血清可以抑制KMH-2和8305C細(xì)胞增殖(F=4.521,P=0.013)，而低劑量和生理鹽水組含藥血清對(duì)KMH-2和8305C細(xì)胞增殖并無(wú)顯著抑制。

二、低、中、高劑量組含藥血清對(duì)KMH-2和8305C細(xì)胞凋亡影響的比較

Annexin V/PI試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，在10%和20%中、高劑量組含藥血清處理48 h后，KMH-2和8305C細(xì)胞凋亡比例顯著高于生理鹽水組(F=8.965,P=0.005)；其他處理組則未出現(xiàn)顯著的細(xì)胞凋亡。

三、KMH-2和8305C中側(cè)群細(xì)胞篩選和鑒定

Hoechst 33342染色顯示(圖3)，KMH-2和8305C細(xì)胞中均存在一定比例的側(cè)群細(xì)胞，比例分別為(1.45±0.01)%和(1.75±0.01)%；當(dāng)采用維拉帕米處理后，兩種細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞比例明顯下降，分別為(0.48±0.00)%和(0.50±0.01)%。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示側(cè)群細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH、CD44和ABCG2蛋白表達(dá)顯著高于非側(cè)群細(xì)胞。

圖1　中、高劑量四君子湯灌胃組含藥血清抑制兩種細(xì)胞增殖

A：各劑量組含藥血清對(duì)KMH-2細(xì)胞增殖的影響；B：各劑量組含藥血清對(duì)8305C細(xì)胞增殖的影響

圖2　中、高劑量四君子湯灌胃組含藥血清誘導(dǎo)兩種細(xì)胞凋亡

A：流式細(xì)胞儀凋亡分析圖，左下象限代表活細(xì)胞、右下象限代表早期凋亡細(xì)胞、右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞；B和C：各劑量組含藥血清對(duì)KMH-2和8305C細(xì)胞凋亡的影響

四、四君子湯抑制側(cè)群細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)側(cè)群細(xì)胞凋亡

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)，20%高劑量灌胃組含藥血清可以抑制KMH-2和8305C細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞增殖，而其他處理組并不能抑制側(cè)群細(xì)胞增殖。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20%高劑量灌胃組含藥血清誘導(dǎo)KMH-2和8305C細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞凋亡，而其他處理組則并未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。

圖3　側(cè)群細(xì)胞篩選和鑒定

A：利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hoechst 33342熒光，篩選側(cè)群細(xì)胞，圖中小框中所示即為側(cè)群細(xì)胞；B：兩種細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞比例以及維拉帕米對(duì)側(cè)群細(xì)胞比例的影響；C：腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH、CD44和ABCG2蛋白在側(cè)群和非側(cè)群細(xì)胞的表達(dá)水平

五、四君子湯激活側(cè)群細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示(圖5)，20%四君子湯高劑量組含藥血清處理48 h后， 側(cè)群細(xì)胞內(nèi)bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降，胞漿內(nèi)Cytochrome C含量增高，另外可檢測(cè)到Caspase-3的活性片段，說(shuō)明內(nèi)源性凋亡途徑被激活。

討論

在晚期甲狀腺癌治療的臨床實(shí)踐中，面對(duì)臨床常用化療藥物較嚴(yán)重的毒副作用，人們更加迫切地希望找到治療甲狀腺癌的新方法?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯治療中晚期惡性腫瘤，不僅能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而且能增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，改善癥狀，延長(zhǎng)生存期，提高生活質(zhì)量。四君子湯由4種天然植物熬制而成，其有效活性成分非常復(fù)雜難以明確，這也是許多在臨床上被證明有效的中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥無(wú)法獲得國(guó)際認(rèn)可的重要原因。在本研究中，我們采用血清藥物學(xué)方法提取更適用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的四君子湯含藥血清，含藥血清比湯劑成分更純凈，不會(huì)存在過(guò)多影響細(xì)胞生物學(xué)行為的雜質(zhì)[9]。

圖4　20%高劑量灌胃組含藥血清抑制側(cè)群細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)側(cè)群細(xì)胞凋亡

A、B：各劑量組含藥血清對(duì)側(cè)群細(xì)胞增殖的影響；C、D ：Annexin V/PI試驗(yàn)(20%高劑量組含藥血清處理組，其余處理組未顯示)；E、F：各劑量組含藥血清對(duì)側(cè)群細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)四君子湯含藥血清能夠抑制KMH-2和8305C細(xì)胞增殖，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)KMH-2和8305C細(xì)胞中的側(cè)群細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤組織中存在極少量的腫瘤干細(xì)胞，它們具有自我更新和無(wú)限增殖能力，與其他腫瘤細(xì)胞相比，它們具有更強(qiáng)的成瘤性、轉(zhuǎn)移性和抗藥性，腫瘤之所以難以消滅，手術(shù)后易復(fù)發(fā)，都是因?yàn)槌Ｒ?guī)治療方法并未徹底殺死腫瘤干細(xì)胞。側(cè)群細(xì)胞被認(rèn)為是一群具有腫瘤干細(xì)胞特征的細(xì)胞，它們可以表達(dá)豐富的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠迅速泵出熒光染料Hoechst[10]。通過(guò)流式細(xì)胞儀技術(shù)人們相繼在肺癌、肝癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)側(cè)群細(xì)胞[11-14]。甲狀腺癌組織中也存在側(cè)群細(xì)胞，并且認(rèn)為ALDH、CD44和ABCG2是甲狀腺癌SP細(xì)胞的標(biāo)記物[15-16]。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)KMH-2和8305C細(xì)胞株中存在一定比例側(cè)群細(xì)胞，并且這部分細(xì)胞中ALDH、CD44和ABCG2蛋白表達(dá)水平顯著高于其他腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步證明它們是側(cè)群細(xì)胞。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和凋亡實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)四君子湯能顯著地抑制側(cè)群細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)側(cè)群細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡過(guò)程涉及一系列基因調(diào)控和信號(hào)通路，例如線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑等[17-18]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)四君子湯含藥血清可以誘導(dǎo)Bax/Bcl-2比例增加，促進(jìn)Cytochrome C含量升高，并且激活Caspase-3，因此可以推斷四君子湯是通過(guò)激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)側(cè)群細(xì)胞凋亡。

圖5　20%四君子湯高劑量組含藥血清對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

綜上所述， KMH-2和8305C細(xì)胞中存在側(cè)群細(xì)胞，四君子湯含藥血清能夠通過(guò)激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)側(cè)群細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。在本研究中我們使用四君子湯含藥血清作為刺激物，在后續(xù)研究中將利用現(xiàn)代色譜技術(shù)設(shè)法找到四君子湯中的有效活性分子。

參考文獻(xiàn)

[1]Chen GQ, Shi XG, Tang W, Xiong SM, Zhu J, Cai X, Han ZG, Ni JH, Shi GY, Jia PM, Liu MM, He KL, Niu C, Ma J, Zhang P, Zhang TD, Paul P, Naoe T, Kitamura K, Miller W, Waxman S, Wang ZY, de The H, Chen SJ, Chen Z. Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL): I. As2O3 exerts dose-dependent dual effects on APL cells. Blood，1997，89(9):3345-3353.

[2]Nam S, Scuto A, Yang F, Chen W, Park S, Yoo HS, Konig H, Bhatia R, Cheng X, Merz KH, Eisenbrand G, Jove R. Indirubin derivatives induce apoptosis of chronic myelogenous leukemia cells involving inhibition of Stat5 signaling. Mol Oncol，2012，6(3):276-283.

[3]Wang HQ, Jin JJ, Wang J. Matrine induces mitochondrial apoptosis in cisplatin-resistant non-small cell lung cancer cells via suppression of β-catenin/survivin signaling. Oncol Rep，2015，33(5):2561-2566.

[4]Wu B, Xuan ZR. Progress in research on applying Sijunzi Decoction in treating digestive malignant tumor. Chin J Integr Med，2007，13(2):156-159.

[5]Zhao AG, Zhao HL, Jin XJ, Yang JK, Tang LD. Effects of Chinese Jianpi herbs on cell apoptosis and related gene expression in human gastric cancer grafted onto nude mice. World J Gastroenterol，2002，8(5):792-796.

[6]Cao Y, Liu F, Huang Z, Zhang Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-α-induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Exp Ther Med，2014，8(3):998-1004.

[7]Jiang YR, Miao Y, Yang L, Xue M, Guo CY, Ma XJ, Yin HJ, Shi DZ, Chen KJ. Effect of chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors’ expression in endothelial cells. Chin J Integr Med，2012，18(1):30-33.

[8]賈建光，馬莉，李靖，金鑫，張立功，劉建文，錢軍. 四君子湯及拆方含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞株側(cè)群細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制研究.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2013，18(5): 513-518.

[9]Gao SY, Gong YF, Sun QJ, Bai J, Wang L, Fan ZQ, Sun Y, Su YJ, Gang J, Ji YB. Screening antitumor bioactive fraction from Sauromatum giganteum (Engl.) Cusimano & Hett and sensitive cell lines with the serum pharmacology method and identification by UPLC-TOF-MS. Molecules，2015，20(3):4290-4306.

[10]Chiba T, Kita K, Zheng YW, Yokosuka O, Saisho H, Iwama A, Nakauchi H, Taniguchi H. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology，2006，44(1):240-251.

[11]Niess H, Camaj P, Renner A, Ischenko I, Zhao Y, Krebs S, Mysliwietz J, J?ckel C, Nelson PJ, Blum H, Jauch KW, Ellwart JW, Bruns CJ. Side population cells of pancreatic cancer show characteristics of cancer stem cells responsible for resistance and metastasis. Target Oncol，2015，10(2):215-227.

[12]Sussman RT, Ricci MS, Hart LS, Sun SY, El-Deiry WS. Chemotherapy-resistant side-population of colon cancer cells has a higher sensitivity to TRAIL than the non-SP, a higher expression of c-Myc and TRAIL-receptor DR4. Cancer Biol Ther，2007，6(9):1490-1495.

[13]Schmuck R, Warneke V, Behrens HM, Simon E, Weichert W, R?cken C. Genotypic and phenotypic characterization of side population of gastric cancer cell lines. Am J Pathol，2011，178(4):1792-1804.

[14]Fukuda K, Saikawa Y, Ohashi M, Kumagai K, Kitajima M, Okano H, Matsuzaki Y, Kitagawa Y. Tumor initiating potential of side population cells in human gastric cancer. Int J Oncol，2009，34(5):1201-1207.

[15]Guo Z, Jiang JH, Zhang J, Yang HJ, Yang FQ, Qi YP, Zhong YP, Su J, Yang RR, Li LQ, Xiang BD. COX-2 Promotes Migration and Invasion by the Side Population of Cancer Stem Cell-Like Hepatocellular Carcinoma Cells. Medicine (Baltimore)， 2015，94(44):e1806.

[16]Hayase S, Sasaki Y, Matsubara T, Seo D, Miyakoshi M, Murata T, Ozaki T, Kakudo K, Kumamoto K, Ylaya K, Cheng SY, Thorgeirsson SS, Hewitt SM, Ward JM, Kimura S. Expression of stanniocalcin 1 in thyroid side population cells and thyroid cancer cells. Thyroid，2015，25(4):425-436.

[17]李天曉,元?jiǎng)?葉麗君,孫健,黎曙霞. 棉酚衍生物ApoG2誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及對(duì)Wnt6調(diào)控作用的研究. 新醫(yī)學(xué), 2014, 45(6): 359-363.

[18]劉偉才. 二氯乙酸對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的研究.新醫(yī)學(xué)， 2013，44(6): 430-433.

(本文編輯：楊江瑜)

Study on anti-tumor activities of Sijunzi decoction against growth of side population in thyroid cancer cells

TianLi，CuiWei,SunHong.

DepartmentofGeriatric,NorthHospitalofXi’anCity,Xi’an710000,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the inhibiting effects of Sijunzi decoction (SJZD) on the growth of thyroid cancer cell lines (KMH-2 and 8305c). MethodsThe SJZD-containing serum was obtained by using model of SD rats . The effects of SJZD-containing serum on proliferation of KMH-2 and 8305c cells were examined by using MTT assay. The effects of SJZD-containing serum on apoptosis of KMH-2 and 8305c cells were examined by using Annexin V/PI double staining assay. The side population (SP) of KMH-2 and 8305c cells was screened and identified by Flow cytometry analysis. In addition, the expressions of apoptosis-related proteins including Bax, Bcl-2, Cytochrome C and Caspase-3 were examined by western blot assay. ResultsSJZD-containing serum significantly inhibited the prolifecation of KMH-2 and 8305C cells and induced apoptosis. There existed SP(1.45±0.01)% and (1.75±0.01)% in a certain proportion that in the KMH-2 and 8305c cells, and protein expression level of ALDH, CD44 and ABCG2 in the SP were higher. Further analysis showed that SJZD-containing serum promoted apoptosis of SP cells of KMH-2 and 8305C cells by up-regulating Bax, Cytochrome C and Caspase-3 and down-regulating Bcl-2. ConclusionsOur data revealed the mechanism of the anti-cancer effect of SJZD-containing serum, and this effect was mainly produced through inducing the apoptosis of cells.

【Key words】Sijunzi decoction； Thyroid cancer；Side population； Apoptosis

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.06.004

通訊作者，田黎，E-mail：tianlihappy1234@sina.com

Corresponding author， Tian Li, E-mail：tianlihappy1234@sina.com

(收稿日期：2015-08-11)

·基礎(chǔ)研究論著·