吳佳玲，羅 丹，傅滿姣，石國(guó)民，成 燦，潘建華

·診治分析·

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)、腺苷脫氨酶及結(jié)核桿菌抗體對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值分析

吳佳玲，羅 丹，傅滿姣，石國(guó)民，成 燦，潘建華

410004湖南省長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科

【摘要】目的分析結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)、腺苷脫氨酶(ADA)及結(jié)核桿菌抗體(TB-Ab)對(duì)結(jié)核性胸膜炎(TBP)的診斷價(jià)值。方法選取長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院胸科中心2015年3—11月收治的疑似TBP患者136例，其中明確診斷為TBP 114例(TBP組)，非TBP 22例(非TBP組)。比較兩組患者胸腔積液常規(guī)檢查結(jié)果、T-SPOT.TB陽性率、胸腔積液ADA和乳酸脫氫酶(LDH)濃度、TB-Ab陽性率，并分析T-SPOT.TB、ADA及TB-Ab對(duì)TBP的診斷價(jià)值。結(jié)果兩組患者胸腔積液白細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞分?jǐn)?shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TBP組患者胸腔積液抗酸染色陽性率高于非TBP組(P<0.05)。TBP組患者T-SPOT.TB陽性率、胸腔積液ADA濃度及TB-Ab陽性率均高于非TBP組(P<0.05)；兩組患者胸腔積液LDH濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以T-SPOT.TB、ADA及TB-Ab任意一項(xiàng)陽性為TBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示其靈敏度為98.24%、特異度為63.64%；以T-SPOT.TB陽性或ADA、TB-Ab兩項(xiàng)結(jié)果陽性為TBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示其靈敏度為91.23%、特異度為81.81%。結(jié)論將T-SPOT.TB陽性或ADA、TB-Ab兩項(xiàng)結(jié)果陽性作為TBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，其診斷價(jià)值較高，靈敏度和特異度均較高。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核，胸膜；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；腺苷脫氨酶；結(jié)核分枝桿菌；抗體

吳佳玲，羅丹，傅滿姣，等.結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)、腺苷脫氨酶及結(jié)核桿菌抗體對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值分析[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2016，24(5)：71-74.[www.syxnf.net]

Wu JL，Luo D，F(xiàn)u MJ，et al.Diagnostic value of T-SPOT.TB，adenosine deaminase and TB-Ab on tuberculous pleurisy[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(5)：71-74.

目前，我國(guó)結(jié)核桿菌感染率在22個(gè)結(jié)核病高發(fā)國(guó)家中位居第二，僅次于印度，因此抗結(jié)核形勢(shì)十分嚴(yán)峻[1]。結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleurisy，TBP)是結(jié)核桿菌及其自溶產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物進(jìn)入超敏感機(jī)體胸膜腔而引起的胸膜炎癥，是一種常見的肺外結(jié)核。TBP無特異性臨床表現(xiàn)，常需要借助實(shí)驗(yàn)室檢查(如病原學(xué)檢查、B超、X線等)進(jìn)行確診，但實(shí)驗(yàn)室檢查也存在一些不足，如結(jié)核桿菌培養(yǎng)周期較長(zhǎng)且陽性率較低，病理活檢創(chuàng)傷較大，B超、X線檢查特異度較低等，因此臨床迫切需要探索一種診斷快速、準(zhǔn)確且特異度和靈敏度均較高的方法。本研究分析了結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)、腺苷脫氨酶(ADA)及結(jié)核桿菌抗體(TB-Ab)對(duì)TBP的診斷價(jià)值，旨在探究TBP的早期診斷方法。

1資料與方法

1.1一般資料選取長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院胸科中心2015年3—11月收治的疑似TBP患者136例，其中男78例，女58例；年齡14～68歲；明確診斷為TBP 114例(TBP組)，非TBP 22例(非TBP組)。排除標(biāo)準(zhǔn)：HIV感染者，妊娠期婦女，自身免疫性疾病及肝腎功能衰竭者。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)滲出液符合Light′s標(biāo)準(zhǔn)，即積液/血清乳酸脫氫酶(LDH)>0.6；積液/血清蛋白>0.5；積液LDH大于血液中LDH參考值上限的2/3。TBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床癥狀：伴有發(fā)熱、干咳、胸痛或呼吸困難；(2)體征：有胸腔積液體征；(3)影像學(xué)檢查：X線表現(xiàn)、超聲檢查顯示胸腔積液征象；(4)胸腔積液檢查：積液為滲出液，白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高，以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，ADA>45 U/L，胸腔積液ADA與血清ADA比值>1，胸腔積液涂片和/或培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性；(5)結(jié)核菌素試驗(yàn)陽性；(6)胸膜活檢：胸膜組織有典型的結(jié)核性病理改變；(7)排除其他原因引起的胸腔積液，且抗結(jié)核治療有效[2]。

1.3主要儀器和試劑海爾BⅡ級(jí)生物安全柜，三騰DH-1605二氧化碳培養(yǎng)箱，可調(diào)式計(jì)數(shù)儀，日立7600生化儀，T-SPOT.TB試劑盒購自O(shè)xford Immunotec Ltd，RPMI-1640及人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，ADA及LDH試劑盒購自寧波美康生物有限公司，結(jié)核分枝桿菌抗體IgG、IgM試劑盒購自濰坊康華生物技術(shù)有限公司，抗酸染色試劑盒購自湖南省天騎醫(yī)學(xué)新技術(shù)有限公司。

1.4方法

1.4.1胸腔積液常規(guī)檢查按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第4版)》檢測(cè)胸腔積液白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞分?jǐn)?shù)，抗酸染色依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.2T-SPOT.TB無菌抽取胸腔積液，肝素抗凝，1 800 r/min離心5 min，除去上清液，10 ml 1640重懸。懸液分成兩份，分別按1∶1和1∶2的比例加入RPMI-1640和Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，將RPMI-1640稀釋后的血液樣本緩慢倒入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液中。將混合物分別以1 000×g、600×gg、350×g離心力離心3次，7 min/次，除去上清液后加入500 μl AIM-V培養(yǎng)液配制成細(xì)胞懸液，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 2.5×106/ml，分別在T-SPOT.TB板的陽性對(duì)照孔、抗原A孔、抗原B孔及空白對(duì)照孔中加入細(xì)胞液100 μl，5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)16～20 h。次日，用200 μl 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板4次后，每孔加酶結(jié)合物50 μl，4～8 ℃孵育1 h。PBS洗滌4次，每孔加顯色液50 μl，暗處靜置7 min，加蒸餾水終止反應(yīng)。徹底干燥后，可調(diào)式計(jì)數(shù)儀讀取結(jié)果。結(jié)果判定：當(dāng)空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)<6時(shí)，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6即為陽性；空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)>6，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)大于空白孔斑點(diǎn)數(shù)的兩倍即為陽性(見圖1)。

1.4.3ADA及LDH檢測(cè)方法按照操作說明書設(shè)置上機(jī)參數(shù)，無菌抽取胸腔積液后，肝素抗凝，離心后取上清液檢測(cè)ADA及LDH濃度，其中ADA>36.22 U/L可診斷為TBP。

1.4.4TB-Ab檢測(cè)方法采用膠體金法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體IgG，先加1滴緩沖液于反應(yīng)孔中，加待測(cè)血清150 μl，3滴金標(biāo)液，最后加3滴洗滌液，3 min內(nèi)觀測(cè)結(jié)果，檢測(cè)T區(qū)有紅色印跡出現(xiàn)為陽性；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體IgM，分別加100 μl稀釋液、5 μl標(biāo)本，37 ℃溫浴10 min，洗滌5次后加50 μl酶結(jié)合物，溫浴洗板后加顯色液，酶標(biāo)儀比色，OD值≥0.2為陽性。結(jié)核分枝桿菌抗體IgG和/或IgM陽性為TB-Ab陽性。

2結(jié)果

2.1胸腔積液常規(guī)檢查結(jié)果兩組患者胸腔積液白細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞分?jǐn)?shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TBP組患者胸腔積液抗酸染色陽性率高于非TBP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1兩組患者胸腔積液常規(guī)檢查結(jié)果比較

Table 1Comparison of routine examination results of pleural effusion between the two groups

組別例數(shù)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(x±s,×109/L)淋巴細(xì)胞分?jǐn)?shù)(x±s)抗酸染色陽性〔n(%)〕TBP組1140.58±0.120.55±0.1410(8.8)非TBP組 22 0.43±0.060.45±0.09 0 t(χ2)值1.6121.4365.240aP值0.1240.1680.022

注：a為χ2值；TBP=結(jié)核性胸膜炎

2.2T-SPOT.TB陽性率、胸腔積液ADA和LDH濃度、TB-Ab陽性率TBP組患者T-SPOT.TB陽性率、胸腔積液ADA濃度及TB-Ab陽性率均高于非TBP組，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；兩組患者胸腔積液LDH濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.3T-SPOT.TB、ADA及TB-Ab對(duì)TBP的診斷價(jià)值以T-SPOT.TB、ADA及TB-Ab任意一項(xiàng)陽性為TBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示其靈敏度為98.24%、特異度為63.64%，見表3。以T-SPOT.TB陽性或ADA、TB-Ab兩項(xiàng)結(jié)果陽性為TBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示其靈敏度為91.23%、特異度81.81%，見表4。

表2兩組患者T-SPOT.TB陽性率、胸腔積液ADA和LDH濃度、TB-Ab陽性率比較

Table 2Comparison of positive rate of T-SPOT.TB，ADA concentration and LDH concentration of pleural effusion，positive rate of TB-Ab between the two groups

組別例數(shù)T-SPOT.TB陽性〔n(%)〕ADA(x±s,U/L)LDH(x±s,U/L)TB-Ab陽性〔n(%)〕TBP組11493(81.6)46.37±10.15407.53±186.4178(68.4)非TBP組 22 4(18.2) 10.15±6.73309.59±174.853(13.6)t(χ2)值36.238a27.3411.43822.979aP值0.0000.0000.1690.000

注：T-SPOT.TB=結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)，ADA=腺苷脫氨酶，LDH=乳酸脫氫酶，TB-Ab=結(jié)核桿菌抗體；a為χ2值

注：圖A為陽性結(jié)果，圖B為陰性結(jié)果

圖1　T-SPOT.TB結(jié)果判定

表4T-SPOT.TB陽性或ADA、TB-Ab兩項(xiàng)結(jié)果陽性對(duì)TBP的診斷價(jià)值

Table 4Diagnostic value of T-SPOT.TB or both of ADA and TB-Ab on TBP

T-SPOT.TB陽性或ADA、TB-Ab兩項(xiàng)結(jié)果陽性 金標(biāo)準(zhǔn)TBP 非TBP合計(jì)陽性1044108陰性101828合計(jì)11422136

3討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的感染性疾病，以肺結(jié)核較常見，但仍有15%～25%的結(jié)核病表現(xiàn)為淋巴結(jié)核、TBP、結(jié)核性腦膜炎等肺外結(jié)核。本研究結(jié)果顯示，TBP組患者胸腔積液抗酸染色陽性率為8.8%，診斷價(jià)值較低，且由于TBP患者胸腔積液白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞分?jǐn)?shù)無特異性表現(xiàn)，因此胸腔積液常規(guī)檢查不能及時(shí)診斷TBP。

γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assays，IGRAs)是近年來發(fā)展起來的抗原特異性T細(xì)胞的檢測(cè)方法，其檢測(cè)原理為結(jié)核桿菌感染后引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，T細(xì)胞在初次感染致敏后成為記憶T細(xì)胞，當(dāng)再次接觸結(jié)核桿菌時(shí)活化增殖為效應(yīng)T細(xì)胞，釋放多種細(xì)胞因子，其中由輔助T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的γ干擾素是最關(guān)鍵的細(xì)胞因子。T-SPOT.TB以靶向抗原6 kD和濾過蛋白10 kD為特異性抗原，可刺激從外周血或體液分離的單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素，再通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)計(jì)數(shù)特異性T細(xì)胞數(shù)目。這兩種特異性抗原在RD1基因區(qū)進(jìn)行編碼，且該區(qū)域僅存在于結(jié)核分枝桿菌和少數(shù)致病性分枝桿菌的基因組中，兩種抗原聯(lián)合檢測(cè)針對(duì)不同表位進(jìn)行反應(yīng)，從理論上保證了T-SPOT.TB的靈敏度和特異度。研究表明，TBP患者胸腔積液T-SPOT.TB的90.32%斑點(diǎn)數(shù)>50可能與趨化因子使感染部位局部淋巴細(xì)胞數(shù)增多有關(guān)[4]，但仍有18.42%檢測(cè)陰性可能是由較多的潛伏感染所致[5]。

TB-Ab試驗(yàn)是將結(jié)核分枝桿菌抗原包被在固相載體上，與待測(cè)血清反應(yīng)，血清中相應(yīng)的抗體可結(jié)合于其上，再以膠體金(或酶)標(biāo)志，顯示反應(yīng)，可檢出血清中結(jié)核分枝桿菌抗體。

本研究旨在分析T-SPOT.TB、ADA、TB-Ab對(duì)TBP的診斷價(jià)值，首先將T-SPOT.TB、ADA、TB-Ab任意一項(xiàng)陽性作為TBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其靈敏度為98.24%、特異度為63.64%，與其他研究結(jié)果相似[6-7]。高敏感度、低特異度雖不易漏診，但易造成誤診；為了降低誤診率，本研究修改了聯(lián)合檢測(cè)TBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，改為T-SPOT.TB陽性或ADA、TB-Ab兩項(xiàng)結(jié)果陽性作為TBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其靈敏度為91.23%、特異度為81.81%，提高了特異度，從而降低了誤診率，與國(guó)外報(bào)道結(jié)果一致[8]。

綜上所述，將T-SPOT.TB陽性或ADA、TB-Ab兩項(xiàng)結(jié)果陽性作為TBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其靈敏度和特異度均較高。但由于本研究樣本量小、胸腔積液ADA對(duì)TBP的診斷臨界值選擇等均會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)一定偏差，因此仍需大樣本量、前瞻性研究進(jìn)一步證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

[1]王黎霞，成詩明，陳明亭，等.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)防癆通訊，2012，34(8)：485-508.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì).肺結(jié)核診斷和治療指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24(2)：5.

[3]李多孚，陳郁琳，夏雨.胸水ADA、LDH診斷結(jié)核性胸膜炎的臨床效能評(píng)價(jià)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2015，30(10)：987-990.

[4]Zhang I，Zhang Y，Shi X，et al.Utility of T-cell interferon-r release lease assays fordiagnosing tuberculous serositis：a prospective study in Beijing.China[J].PLoS One，2014，9(1)：e85030.

[5]Janssens JP，Roux-Lombard P，Perneger T，et al.Quantitative scoring of an interferon-gamma assay for differentiating active form latent tuberculosis[J].Eur Respir J，2007，30(4)：722-728.

[6]Aggarwal AN，Agarwal R，Gupta D，et al.Interferon Gamma Release Assays for Diagnosis of Pleural Tuberculosis： a Systematic Review and Meta-Analysis[J].J Clin Microbiol，2015，53(8)：2451-2459.

[7]李津，潘燕玉，張寶華，等.IGRA 檢測(cè)在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價(jià)值[J].臨床肺科雜志，2014，19 (6)：1055-1057.

[8]He Y，Zhang W，Huang T，et al.Evaluation of a diagnostic flow chart applying medical thoracoscopy，adenosine deaminase and T-SPOT.TB in diagnosis of tuberculous pleural effusion[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19(19)：3563-3568.

(本文編輯：謝武英)

Diagnostic Value of T-SPOT.TB，Adenosine Deaminase and TB-Ab on Tuberculous Pleurisy

WUJia-ling，LUODan，F(xiàn)UMan-jiao，etal.

ClinicalLaboratory，theCentralHospitalofChangsha，Changsha410004，China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the diagnostic value of T-SPOT.TB，adenosine deaminase(ADA)and TB-Ab on tuberculous pleurisy(TBP).MethodsFrom March to October in 2015，a total of suspected patients with TBP were selected in the Center of Chest，the Central Hospital of Changsha，thereinto 114 cased finally diagnosed as TBP were served as A group，while other 22 cases were served as B group.Routine examination results of pleural effusion，positive rate of T-SPOT.TB，ADA concentration and lactic dehydrogenase(LDH)concentration of pleural effusion，positive rate of TB-Ab were compared between the two groups，diagnostic value of T-SPOT.TB，ADA and TB-Ab on TBP were analyzed.ResultsNo statistically significant differences of white blood cell count or lymphocyte percentage of pleural effusion was found between the two groups(P>0.05)，while positive rate of acid-fast staining of A group was statistically significantly higher than that of B group(P<0.05).Positive rate of T-SPOT.TB，ADA concentration of pleural effusion and positive rate of TB-Ab of A group were statistically significantly higher than those of B group(P<0.05)，while no statistically significant differences of LDH concentration of pleural effusion was found between the two groups(P>0.05).Take either T-SPOT.TB，ADA or TB-Ab as diagnostic criteria for TBP，the sensitivity was 98.24%，the specificity was 63.64%；take T-SPOT.TB or both of ADA and TB-Ab as diagnostic criteria for TBP，the sensitivity was 91.23%，the specificity was 81.81%.ConclusionTake T-SPOT.TB or both of ADA and TB-Ab as diagnostic criteria for TBP，the diagnostic value is relatively high，with high sensitivity and specificity.

【Key words】Tuberculosis，pleural；T cell spot test for tuberculosis infection；Adenosine deaminase；Mycobacterium tuberculosis；Antibodies

基金項(xiàng)目：國(guó)家“十二五”傳染病科技重大專項(xiàng)(2013ZX10005004)

通信作者：羅丹，410004湖南省長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科；E-mail：luodanfiles@163.com

【中圖分類號(hào)】R 521.7

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

doi:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.05.018

(收稿日期：2016-01-03；修回日期：2016-04-18)