葛章文，吳利，張望明.貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽(yáng)　55000；.遵義縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州遵義　5600；.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽(yáng)　55000

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莽草酸抑制BLM解旋酶活性及肝癌細(xì)胞的研究

葛章文1，吳利2，張望明3
1.貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽(yáng)550002；2.遵義縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州遵義563100；3.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽(yáng)550002

［摘要］目的研究莽草酸（shikimic acid）對(duì)BLM解旋酶的生物學(xué)特性的影響及對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用。方法2012年11月—2013年7月應(yīng)用熒光偏振技術(shù)研究莽草酸對(duì)BLM解旋酶的DNA結(jié)合活性，CCK-8檢測(cè)莽草酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果培養(yǎng)24h，A100（100 μmol/L）、A50（50 μmol/L）、A25（25 μmol/L）三組與不加藥對(duì)照組相比，抑制率分別為25.73％、21.31％、18.25％，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖具有抑制作用（P＜0.05）。結(jié)論①莽草酸不能結(jié)合BLM解旋酶，不能抑制其與DNA的結(jié)合，不能抑制BLM解旋酶的生物學(xué)活性。②莽草酸對(duì)HpG2細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，HpG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)有減弱的表現(xiàn)。③莽草酸抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制不是其通過(guò)對(duì)BLM解旋酶DNA結(jié)合活性的抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

［關(guān)鍵詞］莽草酸；BLM解旋酶；DNA結(jié)合活性；HpG2；CCK-8

解旋酶第二大超家族中的RecQ解旋酶家族是其中最保守的一個(gè)家族，RecQ解旋酶家族在各種生物體的遺傳穩(wěn)定性的維持中發(fā)揮著非常重要的作用［1］。目前仍未見(jiàn)有關(guān)人DNA解旋酶結(jié)構(gòu)、功能受莽草酸影響的相關(guān)報(bào)道。該課題于2012年11月—2013年7月采用熒光偏振和CCK-8技術(shù)，研究了莽草酸對(duì)BLM642-1290解旋酶的結(jié)構(gòu)和功能的影響，為人類(lèi)BLM解旋酶缺陷與腫瘤、遺傳性疾病、環(huán)境相關(guān)疾病關(guān)系及致病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1 BLM642～1290解旋酶的制備

BLM642～1290重組菌pET-15b-BLM642-1290-BL21由法國(guó)巴黎第十一大學(xué)居里研究所的奚緒光主任研究員饋贈(zèng).含有6個(gè)組氨酸串聯(lián)標(biāo)簽（6×His）的BLM重組大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)BLM解旋酶表達(dá)20h（18℃、190 rpm），收集菌體超聲破碎，經(jīng)鎳離子親和層析柱分離純化，獲得可用于開(kāi)展酶活性研究的重組BLM解旋酶。莽草酸購(gòu)自阿拉?。╝laddin）公司。

1.2 DNA底物

帶有熒光標(biāo)記的和不帶標(biāo)記的單鏈DNA（ssDNA）底物：委托北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。序列如下：A1（45bp）：5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAGG ttaggttaggttagtttttttttt-3'；A2（21bp）：3'-FAM-TTAGGCAGCTCGTCTCAATCC-5'。（注：FAM為羧基熒光素）

1.3莽草酸對(duì)大腸桿菌BLM解旋酶結(jié)合活性影響的檢測(cè)

采用兩種方法完成：①向測(cè)定管中加入ddH2O、15μL10×Buffer、3μL DNA（雙鏈DNA（A1A2）、單鏈DNA（A2）），置于熒光偏振儀中檢測(cè)熒光各向異性值至穩(wěn)定，加入不同終濃度的莽草酸，測(cè)定熒光各向異性值至穩(wěn)定，再加入BLM解旋酶使DNA底物飽和，測(cè)定熒光各向異性值至穩(wěn)定。記錄熒光各向異性值的變化。②向測(cè)定管中加入ddH2O、15μL 10×Buffer、3μL DNA（雙鏈DNA（A1A2）、單鏈DNA（A2）），置于熒光偏振儀中檢測(cè)熒光各向異性值至穩(wěn)定，加入BLM解旋酶使DNA底物飽和，測(cè)定熒光各向異性值至穩(wěn)定，加入不同終濃度的莽草酸，測(cè)定熒光各向異性值至穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)調(diào)節(jié)ddH2O的體積，使反應(yīng)體系總體積保持在150μL。

1.4莽草酸對(duì)肝癌細(xì)胞系HpG2生長(zhǎng)抑制作用的研究

CCK-8檢測(cè)莽草酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組正常對(duì)照組：10％FBS的高糖DMEM。乙醇對(duì)照組：10％FBS的高糖DMEM+無(wú)水乙醇（濃度小于0.01％）。實(shí)驗(yàn)組10％FBS的高糖DMEM+莽草酸（0.5，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，100 μmol/L）

1.4.2 CCK-8檢測(cè)莽草酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用

①在24孔板里培養(yǎng)肝癌HpG2細(xì)胞，分別于一周內(nèi)每天天消化細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。②取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的肝癌細(xì)胞，在96孔板中接種細(xì)胞懸液（8×103/孔），將96板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃，5％ CO2）。③細(xì)胞貼壁后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行饑餓培養(yǎng)3h，后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，加入莽草酸培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)無(wú)細(xì)胞組為空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)空，分別于24，48和72h后向每孔加入10μL CCK溶液和90 uL的細(xì)胞培養(yǎng)基。④將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4h。⑤用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.5統(tǒng)計(jì)方法

全部資料采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。藥物組與不加藥物對(duì)照組BLM表達(dá)水平比較，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以％表示，采用Χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1莽草酸對(duì)BLM642-1290解旋酶結(jié)合活性的影響

莽草酸對(duì)BLM642-1290解旋酶的結(jié)合活性無(wú)明顯的影響（Fig1）。無(wú)論以dsDNA（Fig 1B，D）還是ssDNA（Fig 1A，C）作底物時(shí)，體系的熒光各向異性值均無(wú)明顯變化（P＞0.05），說(shuō)明莽草酸不能抑制BLM解旋酶的結(jié)合活性。

圖A、B.隨著莽草酸濃度升高，單鏈DNA（A2）和雙鏈DNA（A1A2）與莽草酸反應(yīng)后熒光偏振值無(wú)明顯變化，說(shuō)明莽草酸不與單鏈DNA（A2）或者雙鏈DNA（A1A2）結(jié)合，加入酶后熒光偏振值明顯升高并且與藥物濃度無(wú)關(guān)，說(shuō)明先前加入的莽草酸不能抑制BLM解旋酶與單鏈DNA或者雙鏈DNA（A1A2）的結(jié)合。圖C、 D.加入酶后熒光偏振值明顯升高，說(shuō)明酶與單鏈DNA（A2）或者雙鏈DNA（A1A2）發(fā)生結(jié)合，加藥物后隨著藥物濃度升高熒光偏振值無(wú)明顯變化，說(shuō)明加入的莽草酸對(duì)BLM解旋酶與單鏈DNA（A2）或者雙鏈DNA（A1A2）的結(jié)合無(wú)抑制作用。

圖1　BLM解旋酶的DNA結(jié)合活性注：A、B：將BLM解旋酶加入DNA和不同濃度莽草酸混合物中；C、D：將不同濃度莽草酸加入DNA和BLM解旋酶混合物中。

2.2莽草酸對(duì)肝癌細(xì)胞系HpG2生長(zhǎng)抑制作用的研究

莽草酸對(duì)HpG2細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。加藥24h后監(jiān)測(cè)，A100（100 μmol/L）、A50（50 μmol/L）、A25（25 μmol/L）3組與不加藥對(duì)照組相比，抑制率分別為25.73％、21.31％、18.25％，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖具有抑制作用（P＜0.05）。培養(yǎng)48h，僅A100（100 μmol/L）組顯示有抑制作用，抑制率為8.19％。培養(yǎng)72h，所有組對(duì)HpG2細(xì)胞均無(wú)抑制作用（P＞0.05）。

圖2　莽草酸加藥24h后CCK-8注：與不加藥物對(duì)照組比較，A100（100 μmol/L）、A50（50 μmol/L）、A25（25 μmol/L）3組P＜0.05，抑制率分別為25.73％、21.31％、18.25％。其余組P＞0.05，無(wú)抑制作用。n=4。

圖3　莽草酸加藥48h后CCK-8注：與不加藥物對(duì)照組比較，A100組P＜0.05，抑制率為8.19％。其余組P＞0.05，無(wú)抑制作用。n=4。

圖4　莽草酸加藥72h后CCK-8注：與不加藥物對(duì)照組比較，P＞0.05，均無(wú)抑制作用。n=4。

3討論

3.1熒光偏振技術(shù)研究莽草酸對(duì)BLM解旋酶的DNA結(jié)合活性

熒光偏振技術(shù)被廣泛應(yīng)用于熒光免疫分析、食品安全與環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物篩選、測(cè)定蛋白質(zhì)-核酸及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用［2］等領(lǐng)域。利用熒光偏振技術(shù)，許厚強(qiáng)等［3］發(fā)現(xiàn)甘草次酸對(duì)BLM解旋酶的活性有抑制作用。此實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)莽草酸與單、雙鏈DNA均不能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，圖1中A圖顯示莽草酸與單鏈DNA（A2）反應(yīng)后使得熒光各向異性值未見(jiàn)升高，而B(niǎo)圖顯示莽草酸與雙鏈DNA（A1A2）的反應(yīng)后熒光各向異性值也未見(jiàn)升高，可知莽草酸與單鏈DNA和雙鏈DNA均不能結(jié)合。加入BLM解旋酶后，發(fā)現(xiàn)熒光各向異性值明顯增高，但是隨著莽草酸濃度增加，經(jīng)不同濃度莽草酸作用后的DNA鏈與BLM解旋酶發(fā)生反應(yīng)后的熒光各向異性值無(wú)明顯變化（P＞0.05），這就說(shuō)明莽草酸不能抑制DNA鏈與BLM解旋酶結(jié)合。同時(shí)，我們采用在加入DNA鏈后，先加入BLM解旋酶再加入不同濃度莽草酸進(jìn)行測(cè)試，圖1中C、D圖顯示：加入BLM解旋酶后熒光各向異性值迅速升高，說(shuō)明DNA鏈與BLM解旋酶發(fā)生了結(jié)合。再加入不同濃度莽草酸，反應(yīng)后的熒光各向異性值與加入BLM解旋酶時(shí)熒光各向異性值相比無(wú)明顯變化（P＞0.05）。說(shuō)明莽草酸不能與DNA鏈與BLM解旋酶發(fā)生反應(yīng)后的復(fù)合體結(jié)合。

3.2莽草酸對(duì)肝癌細(xì)胞系HpG2生長(zhǎng)抑制作用的研究

在對(duì)CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析中我們發(fā)現(xiàn)，在芒草酸濃度較低時(shí)（0.5 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L），其對(duì)HpG2細(xì)胞無(wú)抑制作用。加藥24h后監(jiān)測(cè)，A100（100 μmol/L）、A50（50 μmol/L）、A25（25 μmol/L）3組與不加藥對(duì)照組相比，抑制率分別為25.73％、21.31％、18.25％，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖具有抑制作用（P＜0.05），加藥組隨著藥物濃度的升高，莽草酸對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用越來(lái)越大，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。加藥48h后監(jiān)測(cè)，僅A100（100 μmol/L）組顯示有抑制作用，抑制率為8.19％。加藥72h后，所有組對(duì)HpG2細(xì)胞均無(wú)抑制作用（P＞0.05）。HpG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)卻有減弱的表現(xiàn)。在查閱相關(guān)文獻(xiàn)后［3］，我們分析發(fā)生該現(xiàn)象的原因可能是所試腫瘤細(xì)胞在莽草酸作用下產(chǎn)生了耐藥。易雪等［4］所做的研究工作對(duì)我們很有啟發(fā)意義，他們?cè)谟媒z裂霉素C作用于Jurkat細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)MMC對(duì)Jurkat細(xì)胞作用48h的凋亡率相比24h反而下降，而在MMC作用于Jurkat細(xì)胞48h后BLM mRNA的水平要明顯高于MMC作用24h的水平。孟惠惠［5］、賴(lài)衛(wèi)強(qiáng)［6］等發(fā)現(xiàn)多株腫瘤細(xì)胞和白血病骨髓細(xì)胞中BLM解旋酶表達(dá)量高于正常細(xì)胞，Darya Bogdanova等［7-8］發(fā)現(xiàn)乳腺癌和卵巢癌中有BLM基因突變的發(fā)生，所以我們思考，所試腫瘤細(xì)胞對(duì)莽草酸耐藥現(xiàn)象的發(fā)生可能也與BLM基因的高表達(dá)或者突變有關(guān)。

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The Research of Effects of Shikimic Acid on BLM Helicase Activities and Hepatoma Cells

GE Zhang-wen1，WU Li2，ZHANG Wang-ming3
1.Clinical Laboratory，The People's Hospital of Guizhou Province，Guiyang，Guizhou Province，550002 China；2.Clinical Laboratory，The People's Hospital of Zunyi County，Zunyi，Guizhou Province，563100 China；3.Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou Province，550002 China

［Abstract］Objective To study the effects of shikimic acid on biological properties of BLM helicase and inhibitory effect on hepatoma cells.Methods From November 2012—July 2013，effects of shikimic acid on DNA-binding activity were detected by fluorescence polarization；Effects of shikimic acid on the growth of hepatoma cells were detected by CCK-8.Results Culture for 24h，compared with the control group，the inhibition rate of A100（100 μmol/L），A50（50 μmol/L）and A25（25 μmol/L）group were 25.73％，21.31％and 18.25％respectively（P＜0.05）.Conclusion 1.Shikimic acid can not bound to BLM helicase，inhibit its binding to DNA and inhibit the biological activities of the helicase .2.Shikimic acid have a mild inhibitory effect on the growth of hepatoma cancer cell line HepG2，but its inhibitory effect decreased with the drug action time prolonged.3.the mechanism of shikimic acid to inhibit the growth of HepG2 cells is not the activity suppression on the DNA binding activity of the BLM helicase.

［Key words］Shikimic acid；BLM helicase；DNA binding activity；HpG2；CCK-8

［中圖分類(lèi)號(hào)］R5

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-0742（2016）06（a）-0009-03

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2015.16.009

［作者簡(jiǎn)介］葛章文（1987.2-），男，湖南人，碩士，初級(jí)檢驗(yàn)技師，主要從事腫瘤生物治療的研究工作。

［通訊作者］張望明（1986.7-），男，湖南人，碩士，主管檢驗(yàn)師，研究方向：腫瘤生物治療。Email：83142903@qq.com

收稿日期：（2016-03-05）