廖斷修　易興陽　張標(biāo)　王淳　林靜　池麗芬

(1.德陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 四川 德陽 618000;2.溫州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 浙江 溫州 325200)

·論著·

ALOX5AP和CYP3A5基因多態(tài)性與缺血性卒中后血栓事件的相關(guān)性*

廖斷修1易興陽1張標(biāo)1王淳1林靜2池麗芬2

(1.德陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 四川 德陽 618000;2.溫州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 浙江 溫州 325200)

【摘要】目的探討基因多態(tài)性及基因-基因交互作用與缺血性卒中、卒中后血栓事件的相關(guān)性。方法采用基質(zhì)輔助激光解吸附電離/飛行時間質(zhì)譜法(MDLDI-TOF-MS)對396例缺血性卒中患者及378例對照者ALOX5AP-SG13S32(rs9551963)、SG13S42(rs4769060)、SG13S89(rs4769874)、SG13S114(rs10507391)、EPHX2 G860A(rs751141)、CYP2C9*2 C430T(rs1799853)、CYP2C9*3 A1075C(rs1057910)、 CYP3A5 A6986G(rs776746)等5個基因8個位點的多態(tài)性進行檢測。用廣義多因子降維法(GMDR)檢測基因與基因之間的交互作用，并對所有的缺血性卒中患者血栓事件進行12個月隨訪。血栓事件包括：缺血性卒中復(fù)發(fā)(RIS)和其他血管事件。結(jié)果單個基因分析表明，8個位點基因型分布在病例組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但GMDR分析顯示，rs10507391和rs776746存在有意義的交互作用，同時攜帶rs10507391 AA 和rs776746 GG者，缺血性卒中風(fēng)險增加2.014倍(95% CI: 1.896～6.299, P=0.006)，并與隨訪期間血栓事件發(fā)生相關(guān)。多元 Cox 回歸分析顯示，rs10507391 AA 和rs776746 GG的交互作用是缺血性卒中后血栓事件發(fā)生的獨立危險因素(RR=2.921, 95% CI: 1.118～7.012, P=0.008)。結(jié)論rs10507391和rs776746間的交互作用增加了缺血性卒中的易感性，并與缺血性卒中后血栓事件發(fā)生相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】急性缺血性卒中；基因多態(tài)性；5-脂氧合酶激活蛋白；細(xì)胞色素p450

腦血管病已成為我國居民第一位死亡原因,同時也是單病種致殘率最高的疾病[1]。卒中的發(fā)生受多種危險因素影響，其中動脈硬化是一種慢性炎癥過程，與卒中的發(fā)生密切相關(guān)[2]?；ㄉ南┧?AA)代謝產(chǎn)物是這些慢性炎癥疾病的主要的炎癥介質(zhì)[3]?；蜃儺愂钦{(diào)控炎癥反應(yīng)的主要因素。有研究表明，ALOX5AP基因變異增加了蘇格蘭人群心肌梗死(MI)和卒中的風(fēng)險[4-6]。CYP3A5為氯吡格雷代謝關(guān)鍵酶，但也有表氧化物酶活性[7]。有研究表明，CYP3A5多態(tài)性是用氯吡格雷者血栓事件發(fā)生的預(yù)測指標(biāo)[8]。

卒中是一種復(fù)雜性疾病，是基因-基因和基因-環(huán)境因素相互作用的共同結(jié)果，單基因?qū)δX梗死患病影響可能很少，甚至檢測不到，但多個弱勢位點的聯(lián)合作用可能會成為患病的主要誘因[9]。AA代謝復(fù)雜，LOX和CYP 通路都參與其代謝，因此這兩條通路可能存在有交互作用，而這種交互作用可能與卒中發(fā)病有關(guān)。Lou等提出了廣義多因子降維法來分析基因-基因是否有交互作用[10]。本研究采用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)檢測技術(shù)對缺血性卒中患者和對照者LOX和CYP 通路中5個基因8個位點多態(tài)性進行檢測，旨在探討這些基因-基因交互作用與缺血性卒中后血栓事件的相關(guān)性?，F(xiàn)報告如下。

1對象和方法

1.1研究人群研究對象為396例首次發(fā)病的缺血性卒中患者和378例對照組組成。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲。②臨床診斷為缺血性卒中，并被頭部CT和MRI證實。③TOAST分型為動脈粥樣硬化血栓型(AT型，n=260)和小動脈病變型(SAD，n=136)[11]。④同意參與本項目研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心源性腦栓塞、其他病因型或原因不明確型腦梗死。②有卒中家族史。③既往有腦卒中病史。④腦出血。⑤不愿參與該研究的患者。對照組為同期選自上述兩家醫(yī)院門診的患者，無卒中病史，頭部CT或MRI檢查未發(fā)現(xiàn)無癥狀梗死和出血，彼此之間和與缺血性卒中患者之間無血緣關(guān)系。病例組和對照組均無動脈炎、感染、腫瘤、血液系統(tǒng)疾?。粺o嚴(yán)重心、肝、腎疾病；無甲狀腺疾病和自身免疫性疾病。對所有研究對象危險因素進行評估，包括：吸煙、酗酒情況，有無高血壓、糖尿病、冠心病、總甘油三脂、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇等。

1.2基因型檢測抽取清晨空腹靜脈血3ml，用乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝處理，保存于-80℃冰箱中備用。采用低滲溶血、酚氯仿法從白細(xì)胞中抽提DNA，適量雙蒸水溶解，核酸分析儀測定DNA濃度(MALDI-TOF；上海生工有限公司)[12]。

研究位點的選擇基于以前研究[13～17]和每個單核甘酸多態(tài)性(SNP)最小等位基因頻率。設(shè)置最小等位基因頻率(MAP)≥0.10，獲得各基因的標(biāo)簽SNP(TagSNP)，即為本研究各基因研究的位點。據(jù)此rs9551963、rs4769060、rs4769874、rs10507391、rs751141、rs1799853、rs1057910和rs776746為檢測位點。此8個位點基因型的檢測采用MALDI-TOF方法[16,18]。通過PCR擴增第1個靶序列，然后加入特異性延伸產(chǎn)物將擴增的片段SNPs連接。PCR引物和單堿基延伸引物都使用Assay Designer軟件包設(shè)計。SNPs的分型數(shù)據(jù)獲得是利用PCR的引物延伸和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF)測定。最終結(jié)果利用MassARRAY RT系統(tǒng)(版本號3.4)完成并實時讀取，由MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)進行基因型分析(上海生工有限公司)。

1.3隨訪及終點事件評估所有缺血性卒中患者出院后1個月門診隨訪1次，以后每3個月至少門診隨訪1次。臨床事件基于門診隨訪結(jié)果及專人電話家訪結(jié)果，對所有患者進行12個月隨訪。對終點事件采用盲法評估，即評估者不知曉之前DNA分析的結(jié)果。原發(fā)終點為血栓事件復(fù)合終點，包括：缺血性卒中復(fù)發(fā)(RIS)、心肌梗死(MI)、深靜脈血栓(DVT)和死亡。RIS診斷此次卒中后突然發(fā)生的、持續(xù)時間>24小時的神經(jīng)功能缺損，符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)且影像學(xué)發(fā)現(xiàn)新發(fā)缺血性卒中。MI診斷根據(jù)心臟缺血癥狀、心肌酶譜增高2倍以上和心電圖結(jié)果。死亡解釋為因缺血性卒中、MI和其他血管因素所致的死亡。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，哈迪-溫伯格平衡的符合程度采用2檢驗，計量資料組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用2，如頻率很小則使用Fisher確切概率分析。使用廣義多因子降維法(GMDR) Beta V 0.7軟件包計算基因-基因交互作用和多因素Logistic 回歸，用優(yōu)勢比(OR) 和 95%可信區(qū)間(CI)表示。缺血性卒中患者不同基因型和不同危險因素與臨床終點事件比較采用2檢驗。缺血性卒中患者卒中后12個月復(fù)合終點發(fā)生風(fēng)險采用Cox 比例風(fēng)險模型分析，用相對危險度(RR)和95%CI表示。所有檢驗均為雙側(cè)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1研究對象臨床特征和基因型結(jié)果病例組和對照組基本特征見表1。表1顯示，缺血性卒中患者年齡偏大(P<0.001)，患高血壓(P<0.001)、糖尿病(P=0.032)的比例明顯高于對照組；病例組及對照組的基因型分布見表2。8個檢測位點基因型分布均符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)，其基因型分布頻率在病例組和對照組及在AT和SAD患者之間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表1　病例組與對照組的臨床特征比較

注：BMI: 體重指數(shù)； LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇；TC: 總膽固醇;TG: 甘油三酯

2.2基因-基因交互作用與卒中關(guān)系基因-基因交互作用與卒中相關(guān)性用GMDR分析，結(jié)果顯示，最優(yōu)模型為rs10507391 和rs776746兩基因位點聯(lián)合作用模型，交叉檢驗一致性為10/10，符號檢驗9/10(P=0.0108)，見表3。將rs10507391 和rs776746基因位點的9種組合設(shè)為交互變量，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，調(diào)整年齡、高血壓、糖尿病因素后，10507391 AA 和rs776746 GG交互變量增加了缺血性卒中患病風(fēng)險(OR=2.014, 95% CI為1.896～6.299,P=0.006)，見表4，而這兩個基因位點其他基因型組合與缺血性卒中關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3基因-基因交互作用與卒中后終點事件的關(guān)系396例缺血性卒中患者中，4例(1.01%)在隨訪期失訪，因此392例(98.99%)完成隨訪。在12個月隨訪期內(nèi)有54 例患者發(fā)生血栓事件(37例RIS，5例死亡，6例MI，6例DVT)，結(jié)果見表5。8個位點各基因型與隨訪期血栓事件發(fā)生無明顯差異(P>0.05)，但同時攜帶rs10507391 AA 和rs776746 GG者隨訪期血栓事件發(fā)生率明顯高于其他基因型組合患者(P<0.001)。年齡>68歲，AT型腦梗死，伴高血壓、糖尿病、高LDL的缺血性卒中患者隨訪期血栓事件發(fā)生率明顯增高(P<0.05)。Cox比例風(fēng)險模型分析結(jié)果表明，高血壓病(RR=1.412, 95% CI: 1.001～3.232,P=0.042)、糖尿病(RR=1.522, 95% CI: 1.011～3.722,P=0.016)，同時攜帶rs10507391 AA 和rs776746 GG基因型者(RR=2.921, 95% CI: 1.118～7.012,P=0.008)為缺血性卒中后隨訪期內(nèi)血栓事件發(fā)生的獨立危險因素，見表6。

表2　病例組與對照組的基因型分布[n(×10-2)]

表3基因交互作用的GMDR模型

Table 3Comparison of the best models for prediction accuracy, cross-validation consistency, and P values identified by GMDR

模型訓(xùn)練準(zhǔn)確度檢驗準(zhǔn)確度檢驗一致性符號檢驗(P)10.54760.46327/103(0.9435)1,20.59230.564610/109(0.0108)1,2,30.55650.43535/102(0.9763)1,2,4,50.65230.42314/102(0.9796)1,2,3,4,50.71560.476510/105(0.9693)1,2,3,4,5,60.72380.482210/105(0.7233)1,2,3,4,5,6,70.73540.485610/104(0.8325)1,2,3,4,5,6,7,80.73860.492110/104(0.8426)

注： 1～8分別代表rs10507391、rs776746、rs751141、rs9551963、rs4769060、rs1057910、rs4769874和rs1799853

表4卒中危險因素的多元 logistic regression 分析

Table 4Multiplied logistic regression analysis of the major risk factors for stroke

危險因素OR95%CIPvalue年齡 1.8951.116～3.9860.012高血壓11.1277.474～19.0460.000糖尿病1.1241.001～2.4570.035rs10507391AA和rs776746GG組合2.0141.896～6.2990.006

注：OR，優(yōu)勢比；CI，可信區(qū)間

表5　卒中后12個月隨訪期血栓事件發(fā)生情況[n=396,n(×10-2)]

注：AT:動脈粥樣硬化性; DVT: 深靜脈血栓形成LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇;MI: 心肌梗死; RIS: 再發(fā)缺血性腦卒中; SAD:小動脈病變型; TC:總膽固醇; TG: 甘油三酯

表6卒中后隨訪12個月血栓事件發(fā)生危險因素的Cox 分析

Table 6Cox regression analysis of the risk factors for atherothrombotic events within 12 months after first stroke

因素 PRR95%CI女性0.1520.9360.962～1.884年齡(y)0.0851.1240.956～1.252高血壓0.0421.4121.001～3.232糖尿病0.0161.5221.011～3.722吸煙0.2740.9210.856～1.312高LDL-C0.0871.3230.985～2.965高TC0.2630.9540.825～1.536交互變量0.0082.9211.118～7.012AT型卒中1.060.93～2.860.079

注：RR:相對風(fēng)險；CI:可信區(qū)間；LDL-C: 低密度脂蛋白膽固醇；TC: 總膽固醇；AT:動脈粥樣硬化性

3討論

本研究結(jié)果顯示，8個檢測位點基因型分布頻率在病例組和對照組及在AT和SAD患者之間比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，此發(fā)現(xiàn)與以前國外學(xué)者研究結(jié)果有差別。Helgadottir等通過對冰島人群研究發(fā)現(xiàn)，ALOX5AP基因單倍體使MI和心血管疾病發(fā)病風(fēng)險增高了2倍[4,5]。L?hmussaar等認(rèn)為，ALOX5AP基因變異與卒中相關(guān)，特別是男性[19]。CYP基因變異在卒中發(fā)病中作用目前還不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，EPHX2基因突變增加了缺血性卒中的風(fēng)險[20,21]。本研究結(jié)果與這些研究結(jié)果不一致的原因還不是很清楚，首先可能與種族不同有關(guān)；其次因卒中是多因素復(fù)雜性疾病，是多基因和多種危險因素作用結(jié)果，無主基因效應(yīng)[22]，單基因位點對卒中患病影響可能很小，甚至于檢測不到，但是多個這樣的弱勢位點的聯(lián)合作用卻可能會成為患病的主要誘因。因此對單基因病研究的單基因連鎖分析方法對卒中的研究不適合。

本研究中我們用GMDR分析方法研究了基因-基因交互作用。雖然單基因分析8個檢測位點基因型分布頻率在病例組和對照組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但GMDR分析發(fā)現(xiàn)，攜帶rs10507391 AA 和rs776746 GG者卒中風(fēng)險增高，提示這兩個基因位點的交互作用增加了卒中的易感性。本研究結(jié)果支持對復(fù)雜性疾病如卒中基因的研究，應(yīng)該分析基因-基因的交互作用[23]。

到目前相關(guān)基因多態(tài)性與卒中相關(guān)性研究多為病例對照研究，前瞻性隊列研究少。本研究發(fā)現(xiàn)8個檢測位點各基因型與隨訪期內(nèi)血栓事件發(fā)生無明顯差異(P>0.05)，但同時攜帶rs10507391 AA 和rs776746 GG者隨訪期血栓事件發(fā)生率明顯高于其他基因型組合患者，Cox比例風(fēng)險模型分析發(fā)現(xiàn)這兩個基因位點的交互作用是缺血性卒中后隨訪期血栓事件發(fā)生的獨立危險因素。

ALOX5AP和CYP3A5基因交互作用原因和影響卒中的生物學(xué)特性還不清楚。一種解釋原因為這兩個基因都參與了AA的代謝，這兩個基因的交互作用可能使EETs水平失衡。ALOX5AP基因編碼FLAP蛋白，參與白三烯合成[24]。ALOX5AP基因突變可使FLAP蛋白活性增高，促進了白三烯介導(dǎo)的血管壁損傷和不穩(wěn)定斑塊的形成，進而導(dǎo)致缺血性卒中發(fā)生[25]。AA被CYP表氧化物酶代謝生成4種EETs，EETs對心血管有多種保護作用[26,27]。CYP3A5為CYP表氧化物酶中的一種亞型，CYP3A5基因突變可使EETs水平降低[28]，增加了高血壓發(fā)生的風(fēng)險[29]。高血壓為卒中最主要危險因素，CYP3A5基因多態(tài)性可能也與動脈硬化和卒中有關(guān)。因此這兩個基因交互作用結(jié)果可能導(dǎo)致動脈硬化進展，增加了腦梗死易感性和腦梗死后血栓事件風(fēng)險。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，rs10507391和rs776746間的交互作用增加了缺血性卒中的易感性，并與缺血性卒中后血栓事件的發(fā)生相關(guān)。但本研究的位點選擇是基于國外研究的文獻，因此可能失去了探索與中國卒中相關(guān)的基因；本研究出自兩個中心的研究結(jié)果，樣本量有限，其結(jié)果不能代表所有的中國人群，因此本結(jié)果還有待于更大樣本量和多中心研究來證實。

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Correlation study between ALOX5AP and CYP3A5 genetic polymorphisms with susceptibility to ischemic stroke and atherothrombotic events

LIAO Duanxiu1, YI Xingyang1, ZHANG Biao1,et al

(1.DepartmentofNeurology,ThePeople′sHospitalofDeyang,Deyang618000,Sichuan,China; 2.DepartmentofNeurology,TheThirdAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325200,Zhejiang,China)

【Abstract】ObjectiveThe present study was designed to investigate the associations between genetic variations and ischemic stroke risk, the roles of gene-gene interactions in ischemic stroke, and their associations with atherothrombotic events. MethodsAmong 396 patients with ischemic stroke and 378 controls, we examined 8 variants from 5 genes, including ALOX5AP-SG13S32 (rs9551963), SG13S42 (rs4769060), SG13S89 (rs4769874), SG13S114 (rs10507391), EPHX2 G860A (rs751141), CYP2C9*2 C430T (rs1799853), CYP2C9*3 A1075C (rs1057910), and CYP3A5 A6986G(rs776746), using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry. Gene-gene interactions were determined by the generalized multifactor dimensionality reduction (GMDR) method. All ischemic stroke patients were followed up 12 months for atherothrombotic events, including recurrent ischemic stroke and other vascular events. ResultsSingle-gene variant analysis showed no significant differences in the genotype distributions of the 8 variants between the 2 groups. However, GMDR analysis showed a significant interaction between rs10507391 and rs776746, in those cases carrying rs10507391 AA and rs776746 GG, the risk of ischemic stroke increased by 2.014 times (95% confidence interval[CI], 1.896-6.299; P =.006), and the atherothrombotic events occurred more frequently in those patients during follow-up period (P <.001). Multiple Cox regression analysis showed that the interaction between rs10507391 AA and rs776746 GG was an independent risk factor for atherothrombotic events (relative risk = 2.921; 95% CI, 1.118-7.012; P =.008). ConclusionThe interaction between rs10507391 and rs776746 increases the suscep-tibility to ischemic stroke and is associated with atherothrombotic events in stroke patients.

【Key words】Acute ischemic stroke; Gene polymorphism; 5-lipoxygenase activating protein; Cytochrome P450

基金項目：四川省衛(wèi)生廳科研課題(140025)；浙江省科學(xué)技術(shù)研究基金(2012c33106)

通訊作者：易興陽，主任醫(yī)師，E-mail: yixingyang64@126.com

【中圖分類號】R 743.3

【文獻標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.019

(收稿日期：2016-01-04； 編輯： 母存培)