王　謙，溫　凱，沈建忠（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

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β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留分析的新型熒光檢測物

王謙，溫凱，沈建忠
（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

摘要：利用遺傳編碼非天然氨基酸技術(shù)（UaaTech）制備了帶有熒光氨基酸（7-羥基香豆素-4-基）-乙基甘氨酸（7HC）的重組青霉素結(jié)合蛋白PBP2x-7HC。以該新型熒光檢測物為基礎(chǔ)建立的β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測法對青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、氯唑西林、苯唑西林、雙氯西林、頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢匹林和頭孢乙腈的最低檢測限分別為0.49～2.44 ng/mL，均達到歐盟最低殘留限量（MRL）標(biāo)準(zhǔn)，原奶中添加回收率為78%～102%，成品奶中添加回收率為76%～112%。該新型熒光檢測物具有捕獲分析物和產(chǎn)生檢測信號的雙重功能，簡化了分析過程，實現(xiàn)了小分子物質(zhì)的非競爭性免疫分析，是獸藥殘留檢測方法的有益擴充。

關(guān)鍵詞：β-內(nèi)酰胺類抗生素；殘留分析；非天然氨基酸；熒光

1　材料與方法

1.1試劑與材料限制性內(nèi)切酶和DNA聚合酶，購自NEB公司；引物合成和測序在Invitrogen公司進行，pET40b載體和UaaTech工具分子質(zhì)粒pE?VOL-7HCRS由美國SALK研究所Lei教授饋贈，分子克隆試劑盒及BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細胞，購自天根生化科技（北京）有限公司；大鼠抗

His抗體本實驗室自制，β-內(nèi)酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，購自Sigma Aldrich，其他常規(guī)化學(xué)試劑，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2原核表達載體的構(gòu)建利用引物P1和P2 （P1：gggCATAGTaagtggacaaaaa；P2：gggCTCGAGgtctcctaaagttaa），將目的基因片段（PBP2x，Met 1-Asp 750，Δ29-49aa）擴增并亞克隆到pET40b載體中，命名為pET40b-PBP2x。利用引物P3和P4（P3：CCACGATTCGAGATtagGACGTTAATG；P4：TAATCTCGAATCGTGGCATCTGCAAT）以及全式金Fast Mutagenesis System試劑盒對pET40b-PBP2x進行點突變，將PBP2x的第374位色氨酸Trp的密碼子由TGG突變?yōu)殓牾＝K止密碼子TAG，經(jīng)過測序驗證，命名為pET40b-PBP2x_W374TAG。

1.3PBP2x-7HC重組蛋白的表達將青霉素結(jié)合蛋白表達質(zhì)粒pET40b-PBP2x_W374TAG與UaaTech工具分子質(zhì)粒pEVOL-7HCRS共轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單菌接種至5 mL含30 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.8～1.0時，將培養(yǎng)物按1∶100稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值=1.4，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，阿拉伯糖終濃度0.02%，7HC至終濃度1 mmol/L，30℃下誘導(dǎo)4 h。離心收菌，菌體重懸于pH值8.0的PBS中，ATS細胞高壓破碎儀破碎細胞，收集上清，在AKTA純化系統(tǒng)中使用5 mL GE HisTrap FF預(yù)裝柱純化蛋白，蛋白命名為PBP2x-7HC，SDS-PAGE分析并用365 nm紫外光照射，拍照。

1.4非競爭性受體熒光分析法的建立

1.4.1激發(fā)波長的確定在1 mL離心管中，分別加入5 μL 0.1 mg/mL PBP2x-7HC，45 μL 1x PBS和50 μL 10 μg/mL的β-內(nèi)酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，混勻作為測試樣本；在另外1個1 mL離心管中，分別加入5 μL 0.1mg/mL PBP2x-7HC和95 μL 1x PBS，作為空白對照。測試樣本和空白對照在37℃水浴放置2 h后分別吸取70 μL加入到石英杯中，使用300 nm～420 nm波長的激發(fā)光進行激發(fā)掃描，固定記錄450 nm的發(fā)射光強，狹縫寬度設(shè)置為4 nm，掃描速度設(shè)置為1 nm/s，積分時間設(shè)置為0.2 s。根據(jù)激發(fā)光譜選擇激發(fā)波長。

1.4.2微孔板包被濃度確定以30 μg/mL大鼠抗His抗體預(yù)處理微孔板，酪蛋白封閉后，加入PBS稀釋的不同濃度的PBP2x-7HC（帶有His標(biāo)簽）包被板孔。加入10 ng/mL氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育2 h，洗滌后甩干，每孔加入100 μL PBS，多功能讀板儀讀取發(fā)射熒光強度（頂部讀取，激發(fā)波長366 nm±5 nm，發(fā)射波長450 nm±10 nm）。選擇信噪比最高的濃度作為包被濃度。

1.4.3靈敏度及測量范圍測定根據(jù)以上確立的測試波長以及包被濃度建立微孔板熒光分析法，測量不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品的熒光讀數(shù)為Fa，未加標(biāo)準(zhǔn)品的空白對照的熒光讀數(shù)為Fb，求得ΔF= Fb-Fa，再以ΔF為因變量，抗生素濃度為自變量，做線性回歸，計算回歸方程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算最低檢測限（LOD）和測量范圍。最低檢測限為ΔF=3SD時，標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的抗生素濃度（SD為20個獨立空白樣本熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)差）；檢測范圍設(shè)為ΔF=20%～80%ΔFmax時，標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的抗生素濃度（ΔFmax為相應(yīng)抗生素濃度為10 μg/mL時的ΔF）。

1.4.4特異性測定使用建立的方法測定含有10 μg/mL卡那霉素和10 μg/mL氯霉素的混合物，分析其熒光強度變化。

1.5牛奶樣本的前處理0.2 mL牛奶樣本加入0.56 mL PBS（pH值7.4）和0.02 mL 0.5 mol/L六氰基亞鐵酸鉀，充分混勻后再緩慢加入0.02 mL 1 mol/L醋酸鋅，充分混勻，12 000 r/min（～13，400×g）離心2 min，取上清進行檢測。

1.6牛奶樣本的添加與回收在原奶和成品純牛奶的空白樣本中添加β-內(nèi)酰胺類抗生素，添加濃度分別為1/2MRL、MRL和2×MRL，每個樣本3個平行。以1.5的方法處理后，使用建立的方法進行測量，計算添加回收率。

圖2　PBP2x-7HC SDS-PAGE分析及熒光鑒定M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～4重組蛋白PBP2x-7HC

2　結(jié)果

2.1PBP2x-7HC重組蛋白的表達及鑒定蛋白SDS-PAGE分析顯示，PBP2x-7HC大小為73 kD左右，與理論值相符（見圖2左，兩條帶分別對應(yīng)重組蛋白帶和不帶第一個氨基酸-甲硫氨酸的形式），用365 nm的紫外光照射，蛋白條帶顯示明亮的藍色熒光，證明熒光氨基酸7HC確定插入到了PBP2x中（見圖2右）。

2.2非競爭性受體熒光分析法的建立

2.2.1最佳工作條件的確定PBP2x-7HC結(jié)合青霉素G后，用325 nm激發(fā)，發(fā)射光強度明顯增強，用366 nm激發(fā)，發(fā)射光強度顯著降低，其他5種青霉素類抗生素結(jié)果相同；而當(dāng)其結(jié)合頭孢洛林后，無論用何種波長來激發(fā)，發(fā)射光強均減弱，其他6種頭孢類抗生素結(jié)果相同（見中插彩版圖3）。為統(tǒng)一兩類抗生素的檢測，我們決定以366 nm和450 nm分別作為激發(fā)和發(fā)射波長建立檢測方法。包被條件優(yōu)化試驗顯示，20 μg/mL的PBP2x-7HC得到的信噪比最高，因此使用此濃度蛋白包被微孔板。

2.2.2靈敏度和檢測范圍使用以上建立的方法檢測不同濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品，得到該方法的最低檢測限（LOD）和檢測范圍見表1。青霉素G等13種抗生素的最低檢測限分別為0.49～2.44 ng/mL，均達到歐盟最低殘留限量（MRL）標(biāo)準(zhǔn)。

表1　β-內(nèi)酰胺類抗生素的最低檢測限和檢測范圍

表2　β-內(nèi)酰胺類抗生素在原奶和成品奶中的回收率

2.2.3特異性測定使用建立的熒光檢測法檢測氯霉素和卡那霉素混合物，其熒光強度變化與PBS帶來的背景測量噪聲相當(dāng)（結(jié)果未示），說明PBP2x-7HC保持了青霉素結(jié)合蛋白的特異性。

2.2.4牛奶樣本的添加與回收分別在空白原奶和成品奶樣本中添加不同濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素，添加回收率結(jié)果見表2。原奶中回收率為78%～102%，成品奶中回收率為76%～112%。

3　討論

靈敏的抗生素殘留檢測在食品安全、耐藥菌控制、器官保存及移植等多個領(lǐng)域具有非常重要的意義[2]。熒光作為一種靈敏度極高的信號被廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析、生物檢測以及光學(xué)成像中[3]。非天然氨基酸7HC的熒光對環(huán)境變化反映靈敏，分子卻只有一個氨基酸殘基大小，可以被靈活放置到蛋白質(zhì)不同位點。借助UaaTech工具分子及晶體結(jié)構(gòu)分析，我們將7HC以遺傳編碼的方式引入到青霉素結(jié)合蛋白底物結(jié)合區(qū)域W374位置[4-5]，制備了一種新型的熒光檢測物，并以此建立了一種靈敏的熒光分析法用于檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留。該法對氨芐西林等13種β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測限均低于歐盟的最大殘留限，并可應(yīng)用于牛奶樣本的檢測。此新型熒光檢測物將傳統(tǒng)檢測方法中的捕獲和信號物質(zhì)統(tǒng)一為一種試劑，簡化了試劑制備和分析過程，并且以此為基礎(chǔ)，可以實現(xiàn)小分子物質(zhì)的非競爭性檢測，有助于發(fā)展更加精確，更加穩(wěn)定的檢測手段，是獸藥殘留檢測方法的有益擴充。迄今為止，帶有各種熒光基團的非天然氨基酸在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞中被成功地引入到各類蛋白質(zhì)中，并可大量生產(chǎn)[6]。我們有理由相信，利用熒光氨基酸來發(fā)現(xiàn)和檢測各種與蛋白相互作用的小分子物質(zhì)必將在食品、環(huán)境和臨床醫(yī)學(xué)上得到越來越廣泛的應(yīng)用。

參考文獻：

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中圖分類號：R 927.1

文獻標(biāo)志碼：B

文章編號：0529-6005（2016）05-0084-03

收稿日期：2015-11-09

作者簡介：王謙（1978-），男，博士，從事食品中獸藥殘留檢測，E-mail：547596669@qq.com

通訊作者：沈建忠，E-mail：SJZ@cau.edu.cn當(dāng)今抗生素殘留快速監(jiān)測技術(shù)的主流是以抗原-抗體或者受體-配體反應(yīng)為基礎(chǔ)的競爭性免疫分析法。此類方法設(shè)備相對簡單、使用方便，但存在著競爭物標(biāo)記困難、均一度難以控制、準(zhǔn)確度不夠高的問題。如何實現(xiàn)抗生素這類小分子的非競爭性免疫分析，簡化試劑制備，提高方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，一直是科研工作者努力的目標(biāo)。利用遺傳編碼非天然氨基酸技術(shù)，我們嘗試將熒光氨基酸7HC（見中插彩版圖1a）定點插入到青霉素結(jié)合蛋白PBP2x的抗生素結(jié)合區(qū)域，制備一種新型熒光檢測物，利用7HC熒光強度對微環(huán)境pH值和極性敏感的特性[1]，直接反映PBP2x與抗生素結(jié)合后所引起的底物結(jié)合區(qū)域微環(huán)境的變化（見中插彩版圖1b），從而建立β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留分析方法。